Name: Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri come quantificare l'etanbutolo nelle lesioni polmonari di tubercolosi mediante microdissezione laser e LC/MS. Questo metodo consente di misurare con precisione le concentrazioni farmacologiche nei diversi compartimenti del granuloma.

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Ringraziamo Paul O'Brien, Marizel Mina e Isabella Freedman per gli esperimenti sugli animali, Jacquie Gonzalez e Danielle Weiner dal NIH/NIAID per aiuto con irradiazione gamma dei tessuti di coniglio prima del laser capture microdissection e Jansy Sarathy per manoscritto pensieri e consigli. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1174780) e strumentazione di NIH ha condiviso concedere 1S10OD018072. Ringraziamo Eliseo A. Eugenin per fornire accesso al microscopio Leica LMD 6500 e condivisione di competenze e consulenza. L'acquisto e il supporto continuo di, il 6500 LMD è stato finanziato dal grant The National Institute of Mental Health, MH096625, Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo, NS105584, PHRI finanziamenti (per E.A.E) e contributi di GSK (a E.A.E).

Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, con l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Comitato dei NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animali esperimenti e tessuto collezione
Questa sezione del protocollo descrive procedure animale e raccolta di campioni in condizioni di biosicurezza di livello 3 (BSL3). Protocolli dettagliati della tubercolosi del micobatterio aerosol infezione procedura gestione della droga e protocolli nei conigli sono stati descritti precedentemente11,12.
<ol><li>Infettare i conigli bianchi della Nuova Zelanda (maschi e femminile a 4-5 mesi di età) con M. tuberculosis HN878 utilizza un sistema di aerosol solo naso, come descritto in precedenza11.</li>
	<li>Amministrare le droghe selezionate (Etambutolo nell'esempio presentato qui) tramite l'itinerario preferito ed eutanasia degli animali a 2, 6 e 24 h dopo la somministrazione. In primo luogo, anestetizzare il coniglio mediante iniezione intramuscolare di ketamina a 35mg/kg e xilazina a 5 mg/kg. Attendere dieci minuti e confermare il corretto amputate pizzicando la coda e toccando delicatamente l'occhio. Se non c'è nessuna reazione, eutanasia di somministrazione endovenosa di pentobarbital e fenitoina (Vedi Tabella materiali) a 1 mL/4,5 kg in soluzione salina sterile mL 2. Nota: Questi punti temporali sono ottimali a coprire il profilo farmacocinetico di etambutolo e possono richiedere la regolazione/ottimizzazione per altri farmaci di studio.</li>
	<li>Utilizzando pinze, forbici o bisturi, rimuovere i polmoni dalla cavità toracica, resecare le biopsie del polmone che contiene grandi granulomi necrotici incorporati nel tessuto polmonare uninvolved (come descritto in precedenza3) circostante. Necrotici granulomi appaiono beige in colore e in genere sporgono leggermente dal polmone circostante di colore rosso/rosa. Per facilitare la facile cryosectioning, garantire che le biopsie sono non più grande di 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Mediante pinze, inserire la biopsia su un vassoio cryomold pre-etichettata con la superficie di taglio desiderata a diretto contatto con la base del vassoio. Dopo il congelamento, ciò fornirà una superficie piana da cui cryosections sarà tagliato.</li>
	<li>Congelare la biopsia in vapore di azoto liquido. Riempire un contenitore di polistirolo ad una profondità di 2 pollici con azoto liquido e una cremagliera del tubo di filo metallico. Il rack deve sporgere sopra la superficie dell'azoto liquido che fornisce una superficie piana su cui vengono posizionati i vassoi di tessuto. Riposizionare il coperchio sul contenitore di polistirolo e lasciare tessuti per 10 minuti per congelare completamente.</li>
	<li>Rimuovere i vassoi di tessuto, rapidamente avvolgere nella pellicola di alluminio e posizionare nel individualmente etichettati come guarnizione e sacchetti di plastica richiudibili. Trasferimento a-80 ° C congelatore per lo stoccaggio. Nota: Passaggi 1.1-1.6 vengono eseguiti in condizioni BSL3 (comprese tutte le lavoro animale e gestione di infetti di organi e tessuti). Gamma irradiare le biopsie del polmone alle 3 megarad per attivare gestione di fuori del contenimento BSL3. Microdissezione laser sul tessuto non sterilizzato devono essere eseguiti entro il BLS3 impianto se approvato protocolli di sicurezza sono a posto. Tuttavia, la parte restante del presente protocollo viene descritta l'elaborazione a valle in una struttura di BSL-2.</li>
</ol>2. tessuto di sezionamento
<ol><li>Impostare la temperatura di taglio desiderata del criostato. Trasferire la biopsia del polmone di gamma-irradiati da-80 ° C stoccaggio per criostato e lasciare per 30 minuti per equilibrare la temperatura del tessuto. Nota: -20-22 ° C è ottimale per le biopsie lesione di TB.</li>
	<li>Con una pinzetta, fissare la biopsia al mandrino criostato utilizzando una piccola quantità di adesivo di taglio ottimale temperatura (OCT) per aderire alla base del tessuto al mandrino. Orientare il tessuto in modo che la superficie piana (che era in contatto con la base della cryomold) è la superficie esposta per il taglio. Garantire che l'OCT non contaminare la superficie del tessuto, come questo potrebbe interferire con l'analisi di spettrometria di massa successiva.</li>
	<li>Tre sezioni di tessuto a 25 µm spessore di tagliare e montare sul PET membrana diapositive. Delicatamente toccare la membrana alla sezione di tessuto e rimuovere. Se si applica troppa pressione, la sottile membrana può strappare.<ol>
<li>Evitare movimenti eccessivi del microfono delle diapositive prima del montaggio come questo si tradurrà nella membrana PET diventando carica e scarsa aderenza delle sezioni del tessuto. Assicurarsi che la diapositiva di membrana viene mantenuta a temperatura ambiente per consentire disgelo-montaggio e successo aderenza del tessuto alla membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il vetrino dal criostato e lasciare asciugare all'aria per 3 minuti. Se non viene eseguita immediatamente LCM-LC/MS/MS, sigillare il vetrino in un piccolo sacchetto sigillabile ermetico e trasferire in memoria di-80 ° C fino a quando richiesto per la dissezione.</li>
	<li>Tagliare una sezione adiacente al 10-12 µm e disgelo-montaggio su un vetrino standard per colorazione ematossilina ed eosina (H &amp; E) e riferimento. Sezioni aggiuntive possono essere tagliate in questo momento per altre macchie di istochimica desiderato (ad esempio Ziehl-Niellsen per la visualizzazione del Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Rimuovere il sacchetto sigillato contenente la diapositiva da-80 ° C stoccaggio e permettono di raggiungere la temperatura ambiente per 5 minuti. Nota: Se la diapositiva fredda è esposto immediatamente nell'atmosfera del laboratorio, il tessuto sarà diventato rivestito con condensazione, e potrebbe essere compromessa l'integrità territoriale della droga.</li>
	<li>Accendere il microscopio e il laser (laser richiede 5-10 minuti di riscaldamento prima che possa iniziare il taglio). Caricare provette PCR piatto-cap 0,20 mL nel supporto.</li>
	<li>Rimuovere il vetrino dal sacchetto e prendere un'immagine ottica della sezione di tessuto sulla diapositiva PET utilizzando uno scanner piano.</li>
	<li>Porre il vetrino nel portavetrini (lato tessuto rivolto verso il basso) e assegnare tubi di raccolta differenziata a regioni specifiche granuloma di interesse utilizzando il software di microscopio. In genere, questi saranno 'uninvolved polmone,' 'cellular granuloma,' e 'caseum' (centro necrotico), ma può variare a seconda della patologia specifica di biopsia e del granuloma.</li>
	<li>Concentrarsi sul tessuto utilizzando la 5x obiettivo del microscopio. Questo ingrandimento dovrebbe fornire una buona panoramica del tessuto contenente entrambe le aree granuloma cellulare e necrotico. Nel software selezionare il tubo designato 'caseum' per spostarlo nella posizione sotto il tessuto.</li>
	<li>Inserire i parametri desiderati dissezione. Le impostazioni tipiche per una sezione di polmone spesse 25 µm sono laser Potenza 30, velocità 15 e aperture 35 (unità arbitrarie). Tuttavia, questi sarà diverso a seconda del microscopio utilizzato e potenziale diminuzione del potere a causa dell'età del laser.</li>
	<li>Selezionare lo strumento di disegno libero e, utilizzando un mouse o touchscreen penna, delineare la regione desiderata per la dissezione. L'area della superficie della regione verrà visualizzato nel software. Mantenere le regioni selezionate sotto 500.000 µm2 (0,5 mm2) per facilitare la dissezione più facile. Ripetere la dissezione fino a 3 milioni µm2 (3 mm2) sono stati raccolti in totale nel cappuccio del tubo.<ol>
<li>In occasione della regione dissecata potrebbe rimangono bloccata alla membrana circostante (per esempio a causa di attrazione statica) e non cadere nel tappo di raccolta. Rimuovere queste regioni della superficie cumulativo totale selezionando e rimuovere manualmente all'interno del software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare il tappo per 'lesione cellulare' e raccogliere 3 milioni µm2 del tessuto utilizzando lo stesso processo come descritto al punto 3.7.</li>
	<li>Selezionare il tappo per 'uninvolved polmone' e raccogliere 3 milioni µm2 del tessuto utilizzando lo stesso processo come descritto al punto 3.7. Nota che il tessuto polmonare uninvolved contiene molti bronchioli e gli spazi alveolari. Prestare particolare attenzione a escluderle dalle regioni definite del tessuto per la dissezione.</li>
	<li>Rimuovere il supporto di tappo e attentamente sganciare, sigillare ed etichettare ogni provetta. Proteggere i tessuti dissecati dalle circostanti dispersioni di aria (ad esempio, da interruzione di flusso di aria da una porta di apertura). Analizzare i tessuti dissecati immediatamente, o conservare a-80 ° C e scongelare prima di elaborazione e analisi LCMS.</li>
</ol>4. estrazione e analisi LCMS
<ol><li>Preparare la soluzione di estrazione di 1:1. acetonitrile/metanolo contenente standard interno d-10 di etambutolo. Quando si seleziona uno standard interno, uso una forma stabile con etichetta della droga dell'analita (ad esempio deuterio-etichetta EMB utilizzato in questa dimostrazione) con spostamento sufficiente massa per evitare isotopo cross talk tra l'analita droga e standard (di solito un minimo di 4 Dalton) . Nota: Creazione di omogenato di ogni tipo di tessuto rispettivi standard è difficile perché c'è un controllo molto limitato tessuto con cui creare omogeneato standard. In alternativa a rendere standard da un campione a spillo omogeneato, standard può essere creato aggiungendo tessuto vuoto e composto in esame insieme ed estrazione. Un volume di controllo tessuto in un omogeneato che corrisponde al volume dell'obiettivo delle sezioni di tessuto del campione di studio si combina direttamente con una quantità della sostanza in esame che sarà presente ad una concentrazione determinata.</li>
	<li>Calcolare il volume di tessuto mirato basato sulla superficie e spessore della sezione di tessuto e determinare il fattore di diluizione necessario per l'omogeneizzato utilizzando il volume dell'omogeneato che verrà aggiunti al standard e campioni QC. I calcoli sono illustrati sotto per un'area di destinazione dissecato2 (3 mm2) µm 3 milioni con un 25 µm spessore e 2 µ l di omogenato. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Assumendo una densità di tessuto di 1 g/mL, preparare il brodo di omogenato di 50 mg di tessuto di controllo di pesatura e l'aggiunta di tampone PBS per diluire (utilizzando il fattore di diluizione di 26,67 omogeneato calcolato al punto 4.2, il diluente è 1,283 mL). Omogeneizzare mediante perlina battendo il tessuto polmonare e tampone PBS per 5 minuti a 1750 giri su un omogeneizzatore del tallone. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Diluire la concentrazione del farmaco scorte di 1 mg/mL in acetonitrile/acqua di 1:1 per creare la curva standard chiodare soluzioni. Determinare chiodare concentrazioni standard basate sul volume di spike e il volume del tessuto dell'obiettivo. L'esempio illustrato è per un 100 ng/mL standard utilizzando un 10 µ l di spike. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Rimuovere le provette contenenti i tessuti microdissected da-80 ° C stoccaggio e permettono di raggiungere la temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di soluzione di acetonitrile/acqua 1:1 e 2 µ l di tampone PBS le provette contenenti tessuto microdissected.</li>
	<li>Per curva standard ed i tubi di controllo qualità, aggiungere 10 µ l di soluzione a 2 µ l di controllo omogeneato del polmone di chiodare.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di estrazione in ogni provetta.</li>
	<li>Vortexare ciascuna provetta per 5 minuti, trattare con ultrasuoni per 5 minuti e centrifugare a 5000 RPM per 5 minuti per formare una pallina di pellicola e tessuto in ogni provetta.</li>
	<li>Trasferire 50 µ l del surnatante ad una piastra a 96 pozzetti profondi pozzetti e diluire con un ulteriore 50 µ l di acqua deionizzata in ogni pozzetto.</li>
	<li>Eseguire l'analisi LC/MS/MS utilizzando i parametri dello strumento ottimizzato per etambutolo ed etambutolo-d10 standard interno (come precedentemente descritto in dettaglio12).</li>
	<li>Utilizzare un fattore di diluizione per correggere la quantità esatta di tessuto dissecato per ciascun campione. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. metodo convalida
<ol><li>Creare un omogeneato nel tessuto polmonare controllo combinando 1 parte del polmone, 2 parti di PBS e perline d'acciaio 3-4. Battere il tessuto polmonare e tampone PBS per 5 minuti a 1750 giri utilizzando un omogeneizzatore del tallone.</li>
	<li>Spike omogeneato aggiungendo 10 µ l di 1 mg/mL di brodo di etambutolo DMSO nel 990 µ l omogeneato per creare una concentrazione finale di 10.000 ng/mL (10 mg/mL) e vortex per 1 minuto.</li>
	<li>Creare un blocco congelato omogeneato versando l'omogeneizzato in un cryomold e rapidamente congelamento il ghiaccio secco per 5 minuti.</li>
	<li>Preparare 25 µm spessore sezioni dal blocco omogeneato come descritto ai punti 2.1-2.5.</li>
	<li>Sezionare l'area di tessuto di destinazione come specificato nei passaggi 3.2-3.10.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l 1:1 acetonitrile/acqua e 2 µ l di tampone PBS le provette contenenti tessuto microdissected.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di estrazione in ogni provetta. Procedura il 4,9-4.12, per creare una curva standard e determinare la concentrazione di farmaco nel blocco di omogenato di tessuto.</li>
	<li>Calcolare l'efficienza di estrazione utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
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<li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li>
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<li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics%3A+methodologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li>
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<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+A+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016(2011).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li>
<li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li>
<li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Risolto nello spazio di quantificazione delle droghe all'interno delle lesioni di TB polmonare è necessaria per determinare se esposizione al farmaco raggiunge concentrazioni sterilizzante a popolazioni batteriche risiedono gli scompartimenti differenti della lesione. Il metodo di LCM-LC/MS qui descritto consente la quantificazione assoluta delle droghe anti-TB all'interno tutti i compartimenti di lesione, tra cui il caseum ricchi di batteri, utilizzando sezioni di tessuto di solo 1-3 in totale. Omogeneizzazione dei tess...

La capacità di risolvere spazialmente e di quantificare i livelli della droga è un requisito essenziale per determinare se i farmaci antitubercolari raggiungono sottopopolazioni batteriche all'interno delle lesioni polmonari a sterilizzare le concentrazioni1. Di particolare importanza è determinante la penetrazione del farmaco nel nucleo necrotico della lesione (chiamato caseum), che in genere contiene il più alto numero di bacilli e può essere scarsamente accessibile ai farmaci a causa dell'assenza di vascolarizzazione.
Metodi tradizionali per valutare la penetrazione della lesione, che coinvolgono omogeneizzazione delle lesioni polmonari asportate seguita da estrazione con solvente e analisi di spettrometria di massa (LC/MS) cromatografia liquida, sono altamente sensibili e selettivi per i farmaci di interesse. Tuttavia, questi metodi offrono scarsa informazione spaziale, limitato alla dimensione del tessuto omogeneizzato originale. Approcci di imaging basati sulla spettrometria di massa, ad esempio matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)2,3, desorbimento electrospray ionizzazione (DESI)4 o estrazione liquido-aumentata della superficie5, 6 offrono funzionalità di imaging altamente spazialmente risolto, ma diretta quantificazione può essere estremamente difficile o impossibile a causa di effetti di soppressione di ioni eterogenee e diverse efficienze di estrazione dell'analita dalla cella vari o7tipi di tessuto. Inoltre, approcci di imaging tessuto MS più diretti sono intrinsecamente meno sensibili di LC/MS a causa della mancanza di separazione cromatografica delle specie endogene in competizione per la ionizzazione e l'efficienza di estrazione con solvente più bassa del farmaco dal tessuto.
Microdissezione laser (LCM) combinato con analisi LC/MS è stato ordinariamente applicato per isolare e caratterizzare regioni di tessuto distinti per studi di proteomica8,9 e recentemente utilizzato per la quantificazione di droga in dosato tessuto animale10. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato l'applicazione LCM combinato con analisi LC/MS (LCM-LC/MS) per quantificare le droghe anti-TB nei raggruppamenti distinti granuloma. In lavorazione con il laser capture microdissection, un laser UV è focalizzato attraverso l'obiettivo del microscopio sulla sezione del tessuto, che taglia e che consenta di isolare l'area di tessuto desiderato seguendo un percorso definito dall'utente. Per gravità assistita LCM (la tecnica usata per questa ricerca), la sezione di tessuto è montata su un vetrino di membrana sottile polimero (PET o PEN) e il tessuto viene catturato in un cappuccio del tubo di raccolta situato sotto la diapositiva. I farmaci vengono estratti dal tessuto asportato e quantificati tramite approcci standard LC/MS. La quantità di tessuto devono essere raccolti in definitiva è determinata dalla concentrazione prevista della droga presente nel tessuto e la sensibilità del metodo LC/MS. Per la maggior parte delle analisi delle droghe dosato a livelli terapeutici e analizzati usando uno spettrometro di massa di routine triplo quadrupolo, 3 milioni µm2 (3 mm2) del tessuto superficie è sufficiente.
Questo protocollo descrive la potente combinazione di analisi spaziale e quantificazione completo offerto da LCM-LC/MS, fornendo concentrazioni nella droga assoluta all'interno di tutti i comparti dei granulomi di TB. La tecnica può essere applicata anche per determinare le concentrazioni di farmaco in molti diversi tessuti malati, fornendo informazioni di scoperta e sviluppo della droga vitale.

<table><tbody><tr><td>Conigli bianchi della Nuova Zelanda</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamina) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (xilazina) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodico e fenitoina sodica) Soluzione</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile (grado LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico (grado LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Acqua (grado LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR a tappo piatto da 0,2 mL</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Telai in acciaio, membrana in PET</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Vetrini per microscopio smerigliato</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Piastra a pozzetti profondi 2,0 ml PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Zorbax SB-C8 (4,6 x 50 mm; granulometria, 3,5 &; m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr> <tr><td>"Cerniera" Sacchetti per campioni con guarnizione</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 criostato</td><td>Leica</td><td>Fuori produzione</td><td>Leica CM1860 è il modello attuale</td></tr><tr><td>Sistema di microdissezione laser 6500</td><td>Leica</td><td>fuori produzione</td><td>Leica LMD 6 è il modello attuale</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Spettrometro di massa</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di laser capture microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (lcm-lc/ms)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

La tubercolosi è ancora delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Miglioramenti a terapie farmacologiche esistenti e lo sviluppo di approcci terapeutici sono urgentemente necessari. La capacità di dosata TB farmaci per raggiungere e sterilizzare i batteri all'interno di aree necrotiche scarsamente vascolarizzato (caseum) di granulomi polmonari è cruciale per un riuscito intervento terapeutico. I regimi terapeutici efficaci devono pertanto contenere farmaci con proprietà di penetrazione caseum favorevole. Attuali metodi di LC/MS per quantificare i livelli di farmaco nei tessuti biologici hanno limitato la capacità di risoluzione spaziale, rende difficile determinare con precisione le concentrazioni nella droga assoluta all'interno di piccoli compartimenti come quelle che si trovano all'interno granulomi necrotici. Qui presentiamo un protocollo che unisce la microdissezione laser (LCM) delle regioni di tessuto patologico distinti con quantificazione di LC/MS. Questa tecnica fornisce quantificazione assoluta di farmaci all'interno del granuloma caseum, che circonda la lesione cellulare e tessuto polmonare uninvolved e, pertanto, con precisione determina se le concentrazioni battericide sono stati raggiunti. Oltre alla ricerca di tubercolosi, la tecnica ha molte applicazioni potenziali per risolta spazialmente quantificazione delle droghe in tessuti malati.

Una panoramica dell'approccio LCM-LC/MS è illustrata nella Figura 1. Dopo la sterilizzazione il tessuto di irradiazione gamma, tutti i passaggi successivi (dal tessuto sezionamento in poi) si svolgono di fuori di condizioni BSL3. La figura 2 Mostra la lesione dalle sezioni di biopsia prima e dopo l'isolamento del tessuto di LCM. Aree necrotiche e cellulari delle lesioni TB possono essere facilmente identificate ed isolate mediant...

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

L'obiettivo generale di questa tecnica analitica è quantificare il farmaco antitubercolare etambutolo all'interno dei compartimenti tissutali delle lesioni polmonari della tubercolosi per determinare se vengono raggiunte concentrazioni di farmaci battericidi. Questo metodo può rispondere a domande nel campo della scoperta e dello sviluppo di farmaci per la tubercolosi, determinando se i farmaci somministrati stanno raggiungendo popolazioni batteriche a concentrazioni sterilizzanti all'interno di tutti i compartimenti tissutali del granuloma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione completa delle concentrazioni di farmaci con un elevato dettaglio spaziale all'interno di specifiche strutture tissutali e popolazioni cellulari.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di sezionamento e montaggio dei tessuti sono difficili da apprendere a causa del potenziale di contaminazione dei tessuti e della natura fragile dei vetrini a membrana. Iniziare questa procedura con la raccolta dei tessuti come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire il sezionamento dei tessuti, impostare prima il criostato alla temperatura di taglio desiderata.Trasferire la biopsia polmonare irradiata con raggi gamma dalla cella di stoccaggio a meno 80 gradi Celsius al criostato e lasciare agire per 30 minuti per bilanciare la temperatura del tessuto. Utilizzando una pinzetta, fissare la biopsia al mandrino del criostato utilizzando una piccola quantità di adesivo per la temperatura di taglio ottimale per far aderire la base del tessuto al mandrino. Orientare il tessuto in modo che la superficie piana sia la superficie esposta per il taglio.Assicurarsi che l'OCT non contamini la superficie del tessuto, in quanto ciò potrebbe interferire con la successiva analisi di spettrometria di massa. Tagliare tre sezioni di tessuto a 25 micron di spessore e montarle su vetrini a membrana in PET. Toccare delicatamente la membrana con la sezione di tessuto e rimuovere la sezione.Se viene applicata troppa pressione, la membrana sottile potrebbe strapparsi. Evitare un'eccessiva manipolazione del vetrino prima del montaggio per non caricare la membrana in PET e diminuire l'adesione della sezione di tessuto. Mantenere il vetrino della membrana a temperatura ambiente per consentire il montaggio dello scongelamento e la corretta adesione del tessuto alla membrana.Rimuovere il vetrino dal criostato e lasciare asciugare il vetrino all'aria per tre minuti. Se lcm-LC-MS/MS non viene eseguito immediatamente, sigillare il vetrino in un piccolo sacchetto ermetico e sigillabile e trasferirlo nella conservazione a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è necessario per la dissezione. Tagliare una sezione adiacente a una temperatura compresa tra 10 e 12 micron e montarla su un vetrino standard per la colorazione con ematossilina ed eosina.A questo punto è possibile tagliare sezioni aggiuntive per altre colorazioni istochimiche desiderate. Rimuovere il sacchetto sigillato contenente il vetrino dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per cinque minuti. Se il vetrino freddo viene immediatamente esposto all'atmosfera del laboratorio, il tessuto si ricoprirà di condensa e l'integrità spaziale del farmaco potrebbe essere compromessa.Accendi il microscopio e il laser. Il laser richiede da cinque a 10 minuti per riscaldarsi prima di poter iniziare il taglio. Caricare le provette PCR da 0,20 millilitri con tappo piatto nel supporto.Dopo aver rimosso il vetrino dalla sacca, acquisire un'immagine ottica della sezione di tessuto sul vetrino in PET utilizzando uno scanner piano. Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino, con il fazzoletto rivolto verso il basso. Assegnare provette di raccolta separate a specifiche regioni di granuloma di interesse utilizzando il software del microscopio.In genere, si tratta di polmone non coinvolto, granuloma cellulare e caseo, ma possono variare a seconda della patologia specifica della biopsia del granuloma. Metti a fuoco il tessuto utilizzando l'obiettivo del microscopio 5X. Questo ingrandimento dovrebbe fornire una buona panoramica del tessuto contenente sia le aree del granuloma cellulare che quelle necrotiche.Nel software, selezionare il tubo designato caseo per spostarlo in posizione sotto il tessuto. Immettere i parametri di dissezione desiderati. Le impostazioni tipiche per una sezione polmonare spessa 25 micron sono la potenza laser 30, la velocità 15 e l'apertura 35.Tuttavia, questi variano a seconda del microscopio utilizzato e del potenziale calo di potenza dovuto all'età del laser. Selezionate lo strumento Disegno libero e, utilizzando un mouse o una penna touchscreen, delineate la regione desiderata per la dissezione. La superficie della regione verrà visualizzata nel software.Mantenere le regioni selezionate al di sotto di 500.000 micron quadrati per facilitare la dissezione. Ripetere la dissezione fino a quando non sono stati raccolti in totale tre milioni di micron quadrati nel tappo della provetta. A volte, la regione sezionata può rimanere attaccata alla membrana circostante e non cadere nel tappo di raccolta.Rimuovere queste regioni dalla superficie cumulativa totale selezionando e rimuovendo manualmente all'interno del software. Successivamente, seleziona il cappuccio per la lesione cellulare e raccogli tre milioni di micron quadrati di tessuto utilizzando lo stesso processo. Seleziona il tappo per il polmone non coinvolto e raccogli tre milioni di micron quadrati di tessuto utilizzando lo stesso processo.Si noti che il tessuto polmonare non coinvolto contiene molti bronchioli e spazi alveolari. Prestare particolare attenzione per escluderli dalle regioni di tessuto definite per la dissezione. Rimuovere il supporto del tappo e sganciare, sigillare ed etichettare con cura ciascun tubo.Proteggere i tessuti sezionati dai disturbi dell'aria circostante. Analizzare immediatamente i tessuti sezionati o conservarli a meno 80 gradi Celsius e scongelarli prima dell'elaborazione e dell'analisi LC/MS. Ipotizzando una densità tissutale di un grammo per millilitro, preparare lo stock omogeneizzato pesando 50 milligrammi di tessuto di controllo e aggiungendo tampone PBS per diluire.Omogeneizzare il tessuto battendo il tessuto polmonare e il tampone PBS per cinque minuti a 1750 giri/min su un omogeneizzatore di microsfere. Successivamente, diluire un milligrammo per millilitro di scorte di farmaco in acetonitrile/acqua uno a uno per creare soluzioni di spiking della curva standard. Determinare le concentrazioni standard di picco in base al volume del picco e al volume del tessuto target.L'esempio illustrato è per uno standard di 100 nanogrammi per millilitro utilizzando un volume di picco di 10 microlitri. Rimuovere le provette contenenti il tessuto microsezionato dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere 10 microlitri di soluzione acquosa di acetonitrile/uno a uno e due microlitri di tampone PBS alle provette contenenti il tessuto microdissezionato.Per le provette standard a curva e per il controllo qualità, aggiungere 10 microlitri di soluzione di spiking a due microlitri di omogeneizzato polmonare di controllo. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di estrazione in ogni tubo. Agitare ogni tubo per cinque minuti.Quindi, sonicali per cinque minuti. Quindi, centrifugare le provette a 5.000 giri/min per cinque minuti per formare un pellet di pellicola e tessuto in ciascuna provetta. Dopo la centrifugazione, trasferire 50 microlitri di surnatante in una piastra a 96 pozzetti e diluire con altri 50 microlitri di acqua deionizzata in ciascun pozzetto.Infine, eseguire l'analisi LC-MS/MS e la convalida del metodo come descritto nel protocollo di testo. Il metodo LCM-LC/MS è stato inizialmente convalidato analizzando le regioni microdissezionate al laser da omogenato di tessuto con ethambutolo addizionato. Come mostrato qui, il metodo era altamente riproducibile e ha dimostrato un eccellente recupero dai farmaci.Le concentrazioni di etambutolo misurate mediante LCM-LC/MS in più tessuti polmonari sono state ulteriormente convalidate mediante confronto diretto con le concentrazioni determinate da un approccio LC/MS consolidato. Concentrazioni equivalenti sono state rilevate con entrambe le tecniche. Le concentrazioni assolute di etambutolo all'interno del parenchima polmonare non coinvolto, del bordo della lesione cellulare e del caseo necrotico sono state determinate mediante LCM-LC/MS.I livelli di sterilizzazione del Mycobacterium tuberculosis sono stati raggiunti in tutti i compartimenti della lesione. Sono indicate le concentrazioni minime necessarie per uccidere il 99% dei bacilli replicanti extracellulari e il 99% dei bacilli intracellulari nei macrofagi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microsezionare i tessuti e quantificare i livelli di farmaco all'interno di strutture definite di granuloma polmonare.Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della ricerca sui farmaci antimicrobici di valutare in modo accurato e quantitativo se i farmaci somministrati raggiungono le popolazioni di agenti patogeni target a concentrazioni sterilizzanti. Questo approccio ha un'ampia applicabilità a molti tessuti e stati patologici diversi.

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Ionizzazione ablazione laser elettrospray (LAESI) è una pressione atmosferica sorgente di ioni per la spettrometria di massa. Nella modalità di imaging, un medio infrarosso sonde laser le distribuzioni delle molecole attraverso una sezione di tessuto o di un biofilm. Questa tecnica presenta un nuovo approccio per diversi studi bioanalitici effettuata sotto natale condizioni sperimentali.

Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

Spettroscopia laser ripartizione indotta eseguita su organi sottile e tessuto tumorale rilevato con successo elementi naturali e gadolinio artificialmente iniettato (Gd), emessi da nanoparticelle a base di Gd. Immagini di elementi chimici raggiunto una risoluzione di 100 micron e sensibilità quantitativa sub-mM. La compatibilità del setup con la microscopia ottica standard sottolinea la sua capacità di fornire immagini multiple di uno stesso tessuto biologico.

Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ

Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine ​​nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Qui descriviamo un test di cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) per quantificare l'immunosoppressore tacrolimus in macchie di sangue essiccato utilizzando una semplice fase manuale di precipitazione delle proteine ed estrazione online della colonna.

Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS

L'infezione da tubercolosi umana è un processo complesso, difficile da modellare in vitro. Qui descriviamo un nuovo modello 3D di tessuto polmonare umano che ricapitola le dinamiche che si verificano durante l'infezione, tra cui la migrazione delle cellule immunitarie e la formazione precoce del granuloma in un ambiente fisiologico.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Qui si descrive un metodo rapido equilibrio di dialisi (RED) per misurare farmaco legame caseum da lesioni tubercolosi polmonare e cavità. Il protocollo viene utilizzato anche con una matrice macrofagi derivato schiumosa che è un surrogato efficace caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

Questo protocollo presenta una piattaforma integrata di spettroscopia-massa spectromo (MS) in grado di raggiungere la risoluzione a cella singola. La spettroscopia raman può essere utilizzata per studiare la risposta cellulare ai farmaci, mentre la SM può essere utilizzata per l'analisi mirata e quantitativa dell'assorbimento e del metabolismo dei farmaci.

Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

Gli attuali metodi di analisi dell'aderenza dei pazienti ai complessi regimi di tubercolosi farmacoresistente (DR-TB) possono essere imprecisi e dispendiosi in termini di risorse. Il nostro metodo analizza i capelli, una matrice facilmente raccolta e conservata, per concentrazioni di 11 farmaci DR-TB. Utilizzando LC-MS/MS, possiamo determinare i livelli di farmaci sub-nanogrammi che possono essere utilizzati per comprendere meglio l'aderenza ai farmaci.

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Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.

Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile

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Approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

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Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS) (Video) | JoVE Journal

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

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