Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

L'obiettivo generale di questa tecnica analitica è quantificare il farmaco antitubercolare etambutolo all'interno dei compartimenti tissutali delle lesioni polmonari della tubercolosi per determinare se vengono raggiunte concentrazioni di farmaci battericidi. Questo metodo può rispondere a domande nel campo della scoperta e dello sviluppo di farmaci per la tubercolosi, determinando se i farmaci somministrati stanno raggiungendo popolazioni batteriche a concentrazioni sterilizzanti all'interno di tutti i compartimenti tissutali del granuloma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione completa delle concentrazioni di farmaci con un elevato dettaglio spaziale all'interno di specifiche strutture tissutali e popolazioni cellulari.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di sezionamento e montaggio dei tessuti sono difficili da apprendere a causa del potenziale di contaminazione dei tessuti e della natura fragile dei vetrini a membrana. Iniziare questa procedura con la raccolta dei tessuti come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire il sezionamento dei tessuti, impostare prima il criostato alla temperatura di taglio desiderata.

Trasferire la biopsia polmonare irradiata con raggi gamma dalla cella di stoccaggio a meno 80 gradi Celsius al criostato e lasciare agire per 30 minuti per bilanciare la temperatura del tessuto. Utilizzando una pinzetta, fissare la biopsia al mandrino del criostato utilizzando una piccola quantità di adesivo per la temperatura di taglio ottimale per far aderire la base del tessuto al mandrino. Orientare il tessuto in modo che la superficie piana sia la superficie esposta per il taglio.

Assicurarsi che l'OCT non contamini la superficie del tessuto, in quanto ciò potrebbe interferire con la successiva analisi di spettrometria di massa. Tagliare tre sezioni di tessuto a 25 micron di spessore e montarle su vetrini a membrana in PET. Toccare delicatamente la membrana con la sezione di tessuto e rimuovere la sezione.

Se viene applicata troppa pressione, la membrana sottile potrebbe strapparsi. Evitare un'eccessiva manipolazione del vetrino prima del montaggio per non caricare la membrana in PET e diminuire l'adesione della sezione di tessuto. Mantenere il vetrino della membrana a temperatura ambiente per consentire il montaggio dello scongelamento e la corretta adesione del tessuto alla membrana.

Rimuovere il vetrino dal criostato e lasciare asciugare il vetrino all'aria per tre minuti. Se lcm-LC-MS/MS non viene eseguito immediatamente, sigillare il vetrino in un piccolo sacchetto ermetico e sigillabile e trasferirlo nella conservazione a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è necessario per la dissezione. Tagliare una sezione adiacente a una temperatura compresa tra 10 e 12 micron e montarla su un vetrino standard per la colorazione con ematossilina ed eosina.

A questo punto è possibile tagliare sezioni aggiuntive per altre colorazioni istochimiche desiderate. Rimuovere il sacchetto sigillato contenente il vetrino dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per cinque minuti. Se il vetrino freddo viene immediatamente esposto all'atmosfera del laboratorio, il tessuto si ricoprirà di condensa e l'integrità spaziale del farmaco potrebbe essere compromessa.

Accendi il microscopio e il laser. Il laser richiede da cinque a 10 minuti per riscaldarsi prima di poter iniziare il taglio. Caricare le provette PCR da 0,20 millilitri con tappo piatto nel supporto.

Dopo aver rimosso il vetrino dalla sacca, acquisire un'immagine ottica della sezione di tessuto sul vetrino in PET utilizzando uno scanner piano. Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino, con il fazzoletto rivolto verso il basso. Assegnare provette di raccolta separate a specifiche regioni di granuloma di interesse utilizzando il software del microscopio.

In genere, si tratta di polmone non coinvolto, granuloma cellulare e caseo, ma possono variare a seconda della patologia specifica della biopsia del granuloma. Metti a fuoco il tessuto utilizzando l'obiettivo del microscopio 5X. Questo ingrandimento dovrebbe fornire una buona panoramica del tessuto contenente sia le aree del granuloma cellulare che quelle necrotiche.

Nel software, selezionare il tubo designato caseo per spostarlo in posizione sotto il tessuto. Immettere i parametri di dissezione desiderati. Le impostazioni tipiche per una sezione polmonare spessa 25 micron sono la potenza laser 30, la velocità 15 e l'apertura 35.

Tuttavia, questi variano a seconda del microscopio utilizzato e del potenziale calo di potenza dovuto all'età del laser. Selezionate lo strumento Disegno libero e, utilizzando un mouse o una penna touchscreen, delineate la regione desiderata per la dissezione. La superficie della regione verrà visualizzata nel software.

Mantenere le regioni selezionate al di sotto di 500.000 micron quadrati per facilitare la dissezione. Ripetere la dissezione fino a quando non sono stati raccolti in totale tre milioni di micron quadrati nel tappo della provetta. A volte, la regione sezionata può rimanere attaccata alla membrana circostante e non cadere nel tappo di raccolta.

Rimuovere queste regioni dalla superficie cumulativa totale selezionando e rimuovendo manualmente all'interno del software. Successivamente, seleziona il cappuccio per la lesione cellulare e raccogli tre milioni di micron quadrati di tessuto utilizzando lo stesso processo. Seleziona il tappo per il polmone non coinvolto e raccogli tre milioni di micron quadrati di tessuto utilizzando lo stesso processo.

Si noti che il tessuto polmonare non coinvolto contiene molti bronchioli e spazi alveolari. Prestare particolare attenzione per escluderli dalle regioni di tessuto definite per la dissezione. Rimuovere il supporto del tappo e sganciare, sigillare ed etichettare con cura ciascun tubo.

Proteggere i tessuti sezionati dai disturbi dell'aria circostante. Analizzare immediatamente i tessuti sezionati o conservarli a meno 80 gradi Celsius e scongelarli prima dell'elaborazione e dell'analisi LC/MS. Ipotizzando una densità tissutale di un grammo per millilitro, preparare lo stock omogeneizzato pesando 50 milligrammi di tessuto di controllo e aggiungendo tampone PBS per diluire.

Omogeneizzare il tessuto battendo il tessuto polmonare e il tampone PBS per cinque minuti a 1750 giri/min su un omogeneizzatore di microsfere. Successivamente, diluire un milligrammo per millilitro di scorte di farmaco in acetonitrile/acqua uno a uno per creare soluzioni di spiking della curva standard. Determinare le concentrazioni standard di picco in base al volume del picco e al volume del tessuto target.

L'esempio illustrato è per uno standard di 100 nanogrammi per millilitro utilizzando un volume di picco di 10 microlitri. Rimuovere le provette contenenti il tessuto microsezionato dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere 10 microlitri di soluzione acquosa di acetonitrile/uno a uno e due microlitri di tampone PBS alle provette contenenti il tessuto microdissezionato.

Per le provette standard a curva e per il controllo qualità, aggiungere 10 microlitri di soluzione di spiking a due microlitri di omogeneizzato polmonare di controllo. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di estrazione in ogni tubo. Agitare ogni tubo per cinque minuti.

Quindi, sonicali per cinque minuti. Quindi, centrifugare le provette a 5.000 giri/min per cinque minuti per formare un pellet di pellicola e tessuto in ciascuna provetta. Dopo la centrifugazione, trasferire 50 microlitri di surnatante in una piastra a 96 pozzetti e diluire con altri 50 microlitri di acqua deionizzata in ciascun pozzetto.

Infine, eseguire l'analisi LC-MS/MS e la convalida del metodo come descritto nel protocollo di testo. Il metodo LCM-LC/MS è stato inizialmente convalidato analizzando le regioni microdissezionate al laser da omogenato di tessuto con ethambutolo addizionato. Come mostrato qui, il metodo era altamente riproducibile e ha dimostrato un eccellente recupero dai farmaci.

Le concentrazioni di etambutolo misurate mediante LCM-LC/MS in più tessuti polmonari sono state ulteriormente convalidate mediante confronto diretto con le concentrazioni determinate da un approccio LC/MS consolidato. Concentrazioni equivalenti sono state rilevate con entrambe le tecniche. Le concentrazioni assolute di etambutolo all'interno del parenchima polmonare non coinvolto, del bordo della lesione cellulare e del caseo necrotico sono state determinate mediante LCM-LC/MS.

I livelli di sterilizzazione del Mycobacterium tuberculosis sono stati raggiunti in tutti i compartimenti della lesione. Sono indicate le concentrazioni minime necessarie per uccidere il 99% dei bacilli replicanti extracellulari e il 99% dei bacilli intracellulari nei macrofagi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microsezionare i tessuti e quantificare i livelli di farmaco all'interno di strutture definite di granuloma polmonare.

Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della ricerca sui farmaci antimicrobici di valutare in modo accurato e quantitativo se i farmaci somministrati raggiungono le popolazioni di agenti patogeni target a concentrazioni sterilizzanti. Questo approccio ha un'ampia applicabilità a molti tessuti e stati patologici diversi.