Name: Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dellorecchio delladulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri la microscopia confocale whole-mount per visualizzare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni nella pelle dell'orecchio del topo adulto.

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Ringraziamo K. Gill per la gestione del laboratorio e supporto tecnico, J. Hawkins e il personale del National Institutes of Health (NIH) costruzione impianto 50 animali per l'assistenza con cura del mouse e R. Reed e F. Boi per l'assistenza amministrativa. Grazie anche a Motegi S. e M. Udey per loro orecchio pelle dissezione protocollo N. Burns per aiuto editoriale e membri del laboratorio di cellule staminali e biologia Neuro-vascolare per aiuto tecnico e riflessivo discussione di condivisione. T. Yamazaki è stata sostenuta dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) NIH-KAITOKU. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del cuore nazionale, polmone e sangue Institute (HL005702-11 al Y.M.)

Tutti gli esperimenti in questa sezione sono stati eseguiti sotto approvazione dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) Animal Care e Comitato di uso.
1. adulto Mouse orecchio pelle collezione
<ol><li>Eutanasia di topi adulti tramite l'esposizione di anidride carbonica (CO2) in una camera chiusa e quindi confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale. Nota: L'esperimento segue la Guida di riferimento di National Institutes of Health (NIH) per il metodo di eutanasia.</li>
	<li>Sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in un 35 x 10 mm2 capsula di Petri contenente 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS). Brevemente tagliare i capelli con le forbici.</li>
	<li>Sbucciare la pelle posteriore e anteriore pelle distanza attentamente dalla cartilagine intermedio. Nota: Cartilagine si attacca alla pelle anteriore.</li>
	<li>Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle separatamente a un 24 ben piastra contenente 1 mL di ghiacciata fresca 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto. Appiattire la pelle anteriore e posteriore a 4% PFA.</li>
	<li>Fissare la pelle anteriore e posteriore con cartilagine a 4 ° C per 1 h.</li>
	<li>Lavare la pelle anteriore e posteriore 3 volte per 5 min in 1 mL di PBS con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore con cartilagine alla parte inferiore di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Tagliare la regione della base, che è piegato e ha adiposo e connettivo. Staccare la cartilagine dalla pelle anteriore utilizzando una pinzetta curva.</li>
	<li>Dall'interno della pelle posteriore con Pinzette curve bene, togliere i peli, tessuti adiposi e tessuti connettivi. Mantenere la pelle umida con PBS.</li>
</ol>2. la macchiatura di Immunohistochemical intero-monta della pelle dell'orecchio del topo
Nota: Tutti gli esperimenti nelle sezioni che seguono sono stati eseguiti in conformità con le direttive di sicurezza di laboratorio NIH.
<ol><li>Preparare il tampone di bloccaggio. Siero di capra filtro 10% calore inattivato (Villa) diluito in PBS con 0,2% triton tampone bloccante X-100 (TX-100), o 10% di siero di asino (DS) diluito in PBS con 0,2% tampone bloccante TX-100, utilizzando un filtro da 0,45 µm.</li>
	<li>Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle a un 24 ben piastra contenente 1 mL di tampone di bloccaggio Villa 10% o 10% tampone bloccante di DS per pozzetto. Incubare la pelle per 30 min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari (Tabella materiali) in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS). Nota: Intero-mout l'analisi di immunohistochemical della pelle dell'orecchio dell'adulto con gli anticorpi di classe di neurone-specific marcatore pan-neuronale III β-tubulina (Tuj1, monocloncal mouse o IgG policlonale IgG2a coniglio, diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2 µ g/mL), molecola di adesione Pan-endothelial delle cellule marcatore della piastrina delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1, criceto monoclonale IgG, diluizione di 1: 300 alla concentrazione finale di 3,3 µ g/mL), proteina di base del fodero di myelin marcatore della mielina (MBP, coniglio IgG policlonale, diluizione 1: 200 al concentrazione finale di 5 µ g/mL) e indicatore infiammatorio delle cellule mieloidi CD11b (Rat monoclonali IgG2b, 01:50 diluizione alla concentrazione finale di 20 µ g/mL) è stata indicata nella Figura 1 e Figura 2. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 per actina di muscolo liscio α marcatore di muscolo liscio vascolare delle cellule (αSMA) insieme con gli anticorpi secondari (2,6). Gli anticorpi primari testati da noi stessi sono stati elencati nella Tabella materiali. Gli anticorpi primari multipli derivati da specie diverse possono essere mescolati contemporaneamente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore al nuovo pozzo contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi primari. Incubare la pelle con miscelazione delicata su un mixer a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno seguente, trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 o aspirare il tampone bloccante contenente anticorpi primari. Aggiungere 1 mL di o 2% Villa diluito in PBS con tampone di lavaggio di TX-100 0,2% o 2% DS diluito in PBS con tampone di lavaggio di 0,2% TX-100. Lavare la pelle con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo secondario (Tabella materiali). Diluire anticorpi secondari in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS) e filtro sul blocco buffer contenente anticorpi secondari attraverso una siringa filtro 0,22 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana collegato ad una siringa da 1 mL. Nota: Alexa 488 o anti-coniglio di capra 633-coniugato IgG (H + L) o mouse IgG2a per Tuj1, del anti-criceto capra Alexa 647-coniugato IgG (H + L) per il anti-coniglio di capra PECAM-1, Alexa 488-coniugato IgG (H + L) per MBP, e ratto Alexa 594-coniugato IgG (H + L) per CD11b sono stati utilizzati con diluizione di 1: 250 alla concentrazione finale di 8 µ g/mL. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 αSMA (diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2-3 µ g/mL) in combinazione con questi anticorpi secondari.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione a 13.000 x g per 10 min rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari da tampone bloccante. Nota: Possono essere miscelati simultaneamente diversi anticorpi secondari coniugati fluorescenti derivati da specie diverse.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore ben contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi secondari. Avvolgere la piastra ben 24 in foglio di alluminio per evitare la luce e incubare la pelle per 1 h con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 oppure aspirare la soluzione di anticorpo secondario di dispensare completamente. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di Villa 2% o 2% tampone di lavaggio DS.</li>
	<li>Avvolgere la piastra ben 24 in un foglio di alluminio e lavare con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. montaggio la pelle dell'orecchio sulla diapositiva
<ol><li>Posizionare la pelle sul fondo di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Rimuovere con cura i peli, tessuti adiposi, tessuti connettivi, polveri e fibre dall'interno della pelle utilizzando una pinzetta curva sotto stereomicroscopio con scarsa illuminazione per ridurre al minimo fotografica ampia candeggio. Mantenere la pelle umida con PBS.</li>
	<li>Trasferire la pelle in un vetrino da microscopio adesivo usando il forcipe. Posizionare la pelle anteriore e posteriore con l'interno rivolto verso l'alto sulla diapositiva. Appiattire la pelle usando il forcipe.</li>
	<li>Montare la pelle in un mezzo liquido anti-dissolvenza montaggio per evitare il photobleaching e preservare i segnali fluorescenti. Assicurarsi che nessun bolle di aria sono su o intorno alla pelle.</li>
	<li>Coprire con vetrino coprioggetto sui campioni di pelle attentamente e memorizzare le diapositive di esempio pelle montato nel buia durante la notte a temperatura ambiente per consentire che il supporto di montaggio ottiene costante. Sigillare il coprioggetto alla diapositiva con smalto e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>4. microscopio confocale
<ol><li>Impostare il laser appropriato per fluorofori. Un microscopio confocale con tre sorgenti laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm e HeNe 633 nm) viene utilizzato in questo esperimento.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale, che eccita contemporaneamente campioni triple-macchiato, per evitare e ridurre eventuali sovrapposizioni. Nota: Le immagini saranno prese in modo sequenziale utilizzando la modalità di scansione sequenziale.</li>
	<li>Immagine sotto un obiettivo 10x. Utilizzare lo strumento di analisi delle mattonelle per acquisire la pelle tutto l'orecchio. Impostare Z-stack e assicurarsi che la posizione z copre l'intero spessore della pelle dell'orecchio.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive l'intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell'orecchio dell'adulto per l'analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell'i...

Pelle è composto da tre strati: l'epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.
Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l'etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari1,2,3, 4: assoni sensoriali, simpatici assoni, cellule in nervi Schwann, cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) nei vasi sanguigni. Durante il processo di angiogenesi, una rete capillare primaria subisce intensivo rimodellamento vascolare e si sviluppa in una rete gerarchica di ramificazione vascolare. In sviluppo derma/ipoderma, arterie ramificano al fianco di vene e nervi sensoriali periferici quindi formano adiacenti alle arterie. Dopo la rete vascolare gerarchica è completamente ricoperta di VSMCs, nervi simpatici si estendono lungo e innervano i vasi sanguigni di grande diametro1,5,6. Nonostante il significato in stretta associazione tra i sistemi nervosi e vascolari in via di sviluppo, è stata una questione importante per affrontare ciò che accade alle reti neuro-vascolare in varie situazioni patologiche negli adulti. La formazione immagine tridimensionale ad alta risoluzione è necessaria apprezzare la patogenesi, insieme a morfogenesi di ramificazione anatomicamente riconoscibile e patterning.
Morfogenesi neuronale e vascolare nella pelle del topo adulto è comunemente analizzata macchiando tessuto sezione. Altri studi hanno utilizzato intero-monta la formazione immagine della pelle per visualizzare i nervi periferici e vasi sanguigni, oltre ai follicoli piliferi, ghiandole sebacee e arrector pili muscoli7,8,9. Tuttavia, lo spessore della pelle adulta ha reso difficile analizzare la pelle nel corso di tutta la sua profondità.
Nello studio presente, abbiamo sviluppato un romanzo imaging ad alta risoluzione di intero-monta della pelle dell'orecchio dell'adulto per vincere queste sfide. Pelle dell'orecchio è facilmente accessibile per la dissezione e la formazione immagine intero-monta successiva della pelle nel corso di tutta la sua profondità. Così, è un metodo semplice e altamente riproducibile che possa essere applicato per confrontare l'architettura tridimensionale dei sistemi nervosi e vascolari periferici nella pelle, con misurazioni di quantificazione completa. Abbiamo dimostrato che l'allineamento dei nervi periferici sensoriali e simpatici con i vasi sanguigni di grande diametro è conservato nella pelle adulta. L'obiettivo del presente protocollo è quello di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare in modelli di topo adulto in varie condizioni quali l'infiammazione e rigenerazione.

<table><tbody><tr><td>10 x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, senza Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, con Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fissativo, diluito in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Componente del tampone bloccante/lavaggio</td></tr><tr><td>Normale siero d'asino</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Componente del tampone bloccante/lavaggio</td></tr><tr><td>Pinzetta fine curva</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta curva</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro 0,45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>Siringa filtro Unità 0,22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Mezzo di montaggio anti-sbiadimento</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72180</td><td>Per</td></tr><tr><td>sigillatura Microscopio da dissezione</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Software di editor</td><td>Adobe</td><td></td> Graphics</tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Software di editor</td><td>Adobe</td><td></td> Graphics</tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PECAM-1 (CD31) Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Criceto IgG, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&#945;SMA coniugato con cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>IgG2a di topo, marcatore di cellule muscolari lisce vascolari, anticorpo 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Policlonale di capra, marcatore di cellule endoteliali venose, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Classe III &#946;-tubulina (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, IgG policlonali di coniglio, marcatore panassonale,</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Tuj1</td> 1:500 <td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>IgG2a di topo, marcatore panassonale, anticorpo anti-MBP 1:500</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>IgG policlonali di coniglio, marcatore di mielinizzazione, 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tirosina idrossilasi</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni simpatici, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-periferina</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni periferici, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, marcatore cellulare infiammatorio (macrofagi), 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, marcatore di cellule pan-ematopoietiche, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD3</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>IgG1 di ratto, marcatore di cellule immunitarie, anticorpo 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule infiammatorie, anticorpo anti-GFP 1:200</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Policlonale di coniglio, 1:300</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Policlonale di pollo, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-946;-gal anticorpo</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Policlonale di coniglio, 1:5000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Policlonale di coniglio, 1:300</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-coniglio di capra Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Anticorpo secondario policlonale di coniglio, 1:250</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-criceto di capra Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Anticorpo secondario policlonale di criceto, 1:250</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Anticorpo secondario policlonale di ratto, 1:250</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>IgG2a di topo, 1:250</td></tr></tbody></table>

intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell'orecchio dell'adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L'analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell'orecchio dell'adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l'infiammazione della pelle dell'orecchio dell'adulto sotto diverse condizioni patologiche.

Pelle di topo adulto posteriore dell'orecchio (Figura 1A) e pelle anteriore dell'orecchio (Figura 1B) immunostained con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (blu). Pelle posteriore era immunostained per studiare neuro-immunitario distribuzione utilizzando anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu) (Figura 2A). Distribuzione di CD11b+ cellule infiammator...

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la morfogenesi ramificata e il pattern dei nervi periferici e dei vasi sanguigni, nonché la distribuzione delle cellule immunitarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della neurobiologia, della biologia vascolare e dell'immunologia, illuminando le anomalie morfologiche nei nervi periferici e nei vasi sanguigni, nonché l'infiammazione. Il principale punto di forza di questa tecnica è che possiamo visualizzare i componenti cellulari dei nervi periferici, dei vasi sanguigni e delle cellule immunitarie nella pelle per tutta la sua profondità e possiamo confrontare l'architettura tridimensionale sui sistemi nervoso e vascolare.Questo metodo può fornire informazioni sulle strutture neurovascolari e sulla distribuzione delle cellule immunitarie nei topi giovani e adulti in condizioni normali e patologiche. Dopo l'eutanasia dei topi adulti secondo il protocollo di testo, sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri contenente due millilitri di HBSS. Quindi, usa le forbici per tagliare brevemente i peli.Staccare con cura la pelle posteriore e anteriore dalla ca

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Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l'etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

La matrice extracellulare subisce sostanziale rimodellamento durante la guarigione delle ferite, l'infiammazione e tumorigenesi. Vi presentiamo un approccio immunofluorescenza intravitale romanzo per visualizzare le dinamiche di fibrillare come pure componenti della matrice maglia-come con alta risoluzione spaziale e temporale con epifluorescenza o microscopia a due fotoni.

A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Vi presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Qui descriviamo una nuova preparazione per l'imaging di terminali sensoriali lanceolati vivi di terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio di topo durante la colorazione e la decolorazione con coloranti di stirylpyridinio.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

Questo protocollo descrive l'induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Il modello orecchio del mouse SKH1-Hr hr hairless consente intravitale microscopia a fluorescenza del microcircolo e fototossico induzione trombo senza previa preparazione chirurgica nel letto microvascolare esaminato. Pertanto, l'orecchio del topo glabro è un eccellente modello in vivo per studiare le complesse interazioni durante la formazione di trombi microvascolare, l'evoluzione del trombo, e trombolisi.

Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.

Approccio semplificato di imaging intravitale per il monitoraggio a lungo termine della dinamica del tessuto epiteliale su un microscopio confocale invertito

Questo protocollo, destinato agli utenti inesperti del tessuto dell'orecchio interno del topo, descrive in dettaglio i passaggi per l'elaborazione dell'orecchio interno del topo in diverse fasi di sviluppo per l'immunocolorazione della sezione.

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

Scopri la microscopia confocale whole-mount per visualizzare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni nella pelle dell'orecchio del topo adulto.

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Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

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