Name: Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dellorecchio delladulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri la microscopia confocale whole-mount per visualizzare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni nella pelle dell'orecchio del topo adulto.

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Ringraziamo K. Gill per la gestione del laboratorio e supporto tecnico, J. Hawkins e il personale del National Institutes of Health (NIH) costruzione impianto 50 animali per l'assistenza con cura del mouse e R. Reed e F. Boi per l'assistenza amministrativa. Grazie anche a Motegi S. e M. Udey per loro orecchio pelle dissezione protocollo N. Burns per aiuto editoriale e membri del laboratorio di cellule staminali e biologia Neuro-vascolare per aiuto tecnico e riflessivo discussione di condivisione. T. Yamazaki è stata sostenuta dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) NIH-KAITOKU. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del cuore nazionale, polmone e sangue Institute (HL005702-11 al Y.M.)

Tutti gli esperimenti in questa sezione sono stati eseguiti sotto approvazione dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) Animal Care e Comitato di uso.
1. adulto Mouse orecchio pelle collezione
<ol><li>Eutanasia di topi adulti tramite l'esposizione di anidride carbonica (CO2) in una camera chiusa e quindi confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale. Nota: L'esperimento segue la Guida di riferimento di National Institutes of Health (NIH) per il metodo di eutanasia.</li>
	<li>Sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in un 35 x 10 mm2 capsula di Petri contenente 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS). Brevemente tagliare i capelli con le forbici.</li>
	<li>Sbucciare la pelle posteriore e anteriore pelle distanza attentamente dalla cartilagine intermedio. Nota: Cartilagine si attacca alla pelle anteriore.</li>
	<li>Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle separatamente a un 24 ben piastra contenente 1 mL di ghiacciata fresca 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto. Appiattire la pelle anteriore e posteriore a 4% PFA.</li>
	<li>Fissare la pelle anteriore e posteriore con cartilagine a 4 ° C per 1 h.</li>
	<li>Lavare la pelle anteriore e posteriore 3 volte per 5 min in 1 mL di PBS con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore con cartilagine alla parte inferiore di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Tagliare la regione della base, che è piegato e ha adiposo e connettivo. Staccare la cartilagine dalla pelle anteriore utilizzando una pinzetta curva.</li>
	<li>Dall'interno della pelle posteriore con Pinzette curve bene, togliere i peli, tessuti adiposi e tessuti connettivi. Mantenere la pelle umida con PBS.</li>
</ol>2. la macchiatura di Immunohistochemical intero-monta della pelle dell'orecchio del topo
Nota: Tutti gli esperimenti nelle sezioni che seguono sono stati eseguiti in conformità con le direttive di sicurezza di laboratorio NIH.
<ol><li>Preparare il tampone di bloccaggio. Siero di capra filtro 10% calore inattivato (Villa) diluito in PBS con 0,2% triton tampone bloccante X-100 (TX-100), o 10% di siero di asino (DS) diluito in PBS con 0,2% tampone bloccante TX-100, utilizzando un filtro da 0,45 µm.</li>
	<li>Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle a un 24 ben piastra contenente 1 mL di tampone di bloccaggio Villa 10% o 10% tampone bloccante di DS per pozzetto. Incubare la pelle per 30 min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari (Tabella materiali) in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS). Nota: Intero-mout l'analisi di immunohistochemical della pelle dell'orecchio dell'adulto con gli anticorpi di classe di neurone-specific marcatore pan-neuronale III β-tubulina (Tuj1, monocloncal mouse o IgG policlonale IgG2a coniglio, diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2 µ g/mL), molecola di adesione Pan-endothelial delle cellule marcatore della piastrina delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1, criceto monoclonale IgG, diluizione di 1: 300 alla concentrazione finale di 3,3 µ g/mL), proteina di base del fodero di myelin marcatore della mielina (MBP, coniglio IgG policlonale, diluizione 1: 200 al concentrazione finale di 5 µ g/mL) e indicatore infiammatorio delle cellule mieloidi CD11b (Rat monoclonali IgG2b, 01:50 diluizione alla concentrazione finale di 20 µ g/mL) è stata indicata nella Figura 1 e Figura 2. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 per actina di muscolo liscio α marcatore di muscolo liscio vascolare delle cellule (αSMA) insieme con gli anticorpi secondari (2,6). Gli anticorpi primari testati da noi stessi sono stati elencati nella Tabella materiali. Gli anticorpi primari multipli derivati da specie diverse possono essere mescolati contemporaneamente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore al nuovo pozzo contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi primari. Incubare la pelle con miscelazione delicata su un mixer a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno seguente, trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 o aspirare il tampone bloccante contenente anticorpi primari. Aggiungere 1 mL di o 2% Villa diluito in PBS con tampone di lavaggio di TX-100 0,2% o 2% DS diluito in PBS con tampone di lavaggio di 0,2% TX-100. Lavare la pelle con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo secondario (Tabella materiali). Diluire anticorpi secondari in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS) e filtro sul blocco buffer contenente anticorpi secondari attraverso una siringa filtro 0,22 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana collegato ad una siringa da 1 mL. Nota: Alexa 488 o anti-coniglio di capra 633-coniugato IgG (H + L) o mouse IgG2a per Tuj1, del anti-criceto capra Alexa 647-coniugato IgG (H + L) per il anti-coniglio di capra PECAM-1, Alexa 488-coniugato IgG (H + L) per MBP, e ratto Alexa 594-coniugato IgG (H + L) per CD11b sono stati utilizzati con diluizione di 1: 250 alla concentrazione finale di 8 µ g/mL. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 αSMA (diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2-3 µ g/mL) in combinazione con questi anticorpi secondari.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione a 13.000 x g per 10 min rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari da tampone bloccante. Nota: Possono essere miscelati simultaneamente diversi anticorpi secondari coniugati fluorescenti derivati da specie diverse.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore ben contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi secondari. Avvolgere la piastra ben 24 in foglio di alluminio per evitare la luce e incubare la pelle per 1 h con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 oppure aspirare la soluzione di anticorpo secondario di dispensare completamente. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di Villa 2% o 2% tampone di lavaggio DS.</li>
	<li>Avvolgere la piastra ben 24 in un foglio di alluminio e lavare con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. montaggio la pelle dell'orecchio sulla diapositiva
<ol><li>Posizionare la pelle sul fondo di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Rimuovere con cura i peli, tessuti adiposi, tessuti connettivi, polveri e fibre dall'interno della pelle utilizzando una pinzetta curva sotto stereomicroscopio con scarsa illuminazione per ridurre al minimo fotografica ampia candeggio. Mantenere la pelle umida con PBS.</li>
	<li>Trasferire la pelle in un vetrino da microscopio adesivo usando il forcipe. Posizionare la pelle anteriore e posteriore con l'interno rivolto verso l'alto sulla diapositiva. Appiattire la pelle usando il forcipe.</li>
	<li>Montare la pelle in un mezzo liquido anti-dissolvenza montaggio per evitare il photobleaching e preservare i segnali fluorescenti. Assicurarsi che nessun bolle di aria sono su o intorno alla pelle.</li>
	<li>Coprire con vetrino coprioggetto sui campioni di pelle attentamente e memorizzare le diapositive di esempio pelle montato nel buia durante la notte a temperatura ambiente per consentire che il supporto di montaggio ottiene costante. Sigillare il coprioggetto alla diapositiva con smalto e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>4. microscopio confocale
<ol><li>Impostare il laser appropriato per fluorofori. Un microscopio confocale con tre sorgenti laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm e HeNe 633 nm) viene utilizzato in questo esperimento.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale, che eccita contemporaneamente campioni triple-macchiato, per evitare e ridurre eventuali sovrapposizioni. Nota: Le immagini saranno prese in modo sequenziale utilizzando la modalità di scansione sequenziale.</li>
	<li>Immagine sotto un obiettivo 10x. Utilizzare lo strumento di analisi delle mattonelle per acquisire la pelle tutto l'orecchio. Impostare Z-stack e assicurarsi che la posizione z copre l'intero spessore della pelle dell'orecchio.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive l'intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell'orecchio dell'adulto per l'analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell'i...

Pelle è composto da tre strati: l'epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.
Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l'etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari1,2,3, 4: assoni sensoriali, simpatici assoni, cellule in nervi Schwann, cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) nei vasi sanguigni. Durante il processo di angiogenesi, una rete capillare primaria subisce intensivo rimodellamento vascolare e si sviluppa in una rete gerarchica di ramificazione vascolare. In sviluppo derma/ipoderma, arterie ramificano al fianco di vene e nervi sensoriali periferici quindi formano adiacenti alle arterie. Dopo la rete vascolare gerarchica è completamente ricoperta di VSMCs, nervi simpatici si estendono lungo e innervano i vasi sanguigni di grande diametro1,5,6. Nonostante il significato in stretta associazione tra i sistemi nervosi e vascolari in via di sviluppo, è stata una questione importante per affrontare ciò che accade alle reti neuro-vascolare in varie situazioni patologiche negli adulti. La formazione immagine tridimensionale ad alta risoluzione è necessaria apprezzare la patogenesi, insieme a morfogenesi di ramificazione anatomicamente riconoscibile e patterning.
Morfogenesi neuronale e vascolare nella pelle del topo adulto è comunemente analizzata macchiando tessuto sezione. Altri studi hanno utilizzato intero-monta la formazione immagine della pelle per visualizzare i nervi periferici e vasi sanguigni, oltre ai follicoli piliferi, ghiandole sebacee e arrector pili muscoli7,8,9. Tuttavia, lo spessore della pelle adulta ha reso difficile analizzare la pelle nel corso di tutta la sua profondità.
Nello studio presente, abbiamo sviluppato un romanzo imaging ad alta risoluzione di intero-monta della pelle dell'orecchio dell'adulto per vincere queste sfide. Pelle dell'orecchio è facilmente accessibile per la dissezione e la formazione immagine intero-monta successiva della pelle nel corso di tutta la sua profondità. Così, è un metodo semplice e altamente riproducibile che possa essere applicato per confrontare l'architettura tridimensionale dei sistemi nervosi e vascolari periferici nella pelle, con misurazioni di quantificazione completa. Abbiamo dimostrato che l'allineamento dei nervi periferici sensoriali e simpatici con i vasi sanguigni di grande diametro è conservato nella pelle adulta. L'obiettivo del presente protocollo è quello di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare in modelli di topo adulto in varie condizioni quali l'infiammazione e rigenerazione.

<table><tbody><tr><td>10 x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, senza Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, con Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fissativo, diluito in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Componente del tampone bloccante/lavaggio</td></tr><tr><td>Normale siero d'asino</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Componente del tampone bloccante/lavaggio</td></tr><tr><td>Pinzetta fine curva</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta curva</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro 0,45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>Siringa filtro Unità 0,22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Mezzo di montaggio anti-sbiadimento</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72180</td><td>Per</td></tr><tr><td>sigillatura Microscopio da dissezione</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Software di editor</td><td>Adobe</td><td></td> Graphics</tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Software di editor</td><td>Adobe</td><td></td> Graphics</tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PECAM-1 (CD31) Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Criceto IgG, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&#945;SMA coniugato con cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>IgG2a di topo, marcatore di cellule muscolari lisce vascolari, anticorpo 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Policlonale di capra, marcatore di cellule endoteliali venose, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Classe III &#946;-tubulina (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, IgG policlonali di coniglio, marcatore panassonale,</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Tuj1</td> 1:500 <td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>IgG2a di topo, marcatore panassonale, anticorpo anti-MBP 1:500</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>IgG policlonali di coniglio, marcatore di mielinizzazione, 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tirosina idrossilasi</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni simpatici, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-periferina</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni periferici, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, marcatore cellulare infiammatorio (macrofagi), 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, marcatore di cellule pan-ematopoietiche, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD3</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>IgG1 di ratto, marcatore di cellule immunitarie, anticorpo 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule infiammatorie, anticorpo anti-GFP 1:200</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Policlonale di coniglio, 1:300</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Policlonale di pollo, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-946;-gal anticorpo</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Policlonale di coniglio, 1:5000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Policlonale di coniglio, 1:300</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-coniglio di capra Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Anticorpo secondario policlonale di coniglio, 1:250</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-criceto di capra Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Anticorpo secondario policlonale di criceto, 1:250</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Anticorpo secondario policlonale di ratto, 1:250</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>IgG2a di topo, 1:250</td></tr></tbody></table>

intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell'orecchio dell'adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L'analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell'orecchio dell'adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l'infiammazione della pelle dell'orecchio dell'adulto sotto diverse condizioni patologiche.

Pelle di topo adulto posteriore dell'orecchio (Figura 1A) e pelle anteriore dell'orecchio (Figura 1B) immunostained con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (blu). Pelle posteriore era immunostained per studiare neuro-immunitario distribuzione utilizzando anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu) (Figura 2A). Distribuzione di CD11b+ cellule infiammator...

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la morfogenesi ramificata e il pattern dei nervi periferici e dei vasi sanguigni, nonché la distribuzione delle cellule immunitarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della neurobiologia, della biologia vascolare e dell'immunologia, illuminando le anomalie morfologiche nei nervi periferici e nei vasi sanguigni, nonché l'infiammazione. Il principale punto di forza di questa tecnica è che possiamo visualizzare i componenti cellulari dei nervi periferici, dei vasi sanguigni e delle cellule immunitarie nella pelle per tutta la sua profondità e possiamo confrontare l'architettura tridimensionale sui sistemi nervoso e vascolare.Questo metodo può fornire informazioni sulle strutture neurovascolari e sulla distribuzione delle cellule immunitarie nei topi giovani e adulti in condizioni normali e patologiche. Dopo l'eutanasia dei topi adulti secondo il protocollo di testo, sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri contenente due millilitri di HBSS. Quindi, usa le forbici per tagliare brevemente i peli.Staccare con cura la pelle posteriore e anteriore dalla cartilagine intermedia. Trasferire ogni sezione di pelle separatamente in una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di PFA fresco e ghiacciato al 4% in PBS per pozzetto. Quindi, appiattisci la pelle nel PFA.Quindi, fissare la pelle posteriore e anteriore con la cartilagine a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi, utilizzare un millilitro di PBS per lavare la pelle tre volte per cinque minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente. Trasferire la pelle con la cartilagine sul fondo di una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri.Usa una pinza curva fine per staccare la cartilagine dalla pelle anteriore. Quindi, taglia la regione di base, che è piegata e ha tessuti adiposi e connettivi. Usando la stessa pinza, rimuovere con cura i peli, il tessuto adiposo e il tessuto connettivo dall'interno della pelle posteriore.Usa il PBS per mantenere la pelle bagnata. Per eseguire la colorazione immunoistochimica a montaggio intero, trasferire la cute posteriore e anteriore in una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di tampone bloccante il siero inattivato termicamente al 10% per pozzetto. Incubare la pelle mescolando delicatamente a temperatura ambiente per 30 minuti.Diluire gli anticorpi primari nel tampone bloccante come descritto nel protocollo di testo e aggiungere 150 microlitri di anticorpi primari nel tampone bloccante al pozzetto. Quindi, trasferire la pelle posteriore e anteriore in nuovi pozzetti contenenti anticorpi primari. Incubare la pelle con una miscelazione delicata a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, dopo aver trasferito la pelle in nuovi pozzetti o aspirato gli anticorpi primari, aggiungere un millilitro di siero al 2% in PBS con Triton X-100 allo 0,2%. Lavare i campioni con una miscelazione delicata a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte.Nel frattempo, preparare gli anticorpi secondari in un tampone bloccante al 10% e filtrare le soluzioni anticorpali attraverso un filtro per siringa a membrana PVDF da 0,22 micrometri collegato a una siringa da un millilitro. Centrifugare la soluzione a 13.000 volte la gravità per 10 minuti per rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari dal tampone bloccante, aggiungendo 150 microlitri di anticorpi secondari nel tampone bloccante al nuovo pozzetto. Trasferire la pelle nel pozzetto contenente gli anticorpi secondari.Avvolgere la piastra a 24 pozzetti in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare la pelle mescolando delicatamente a temperatura ambiente per un'ora. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio del siero al 2%. Quindi, trasferire la pelle posteriore e anteriore nei pozzetti contenenti il tampone di lavaggio.Avvolgere la piastra e lavare i campioni con una miscelazione delicata a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte. Posizionare la pelle sul fondo di una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri.Quindi, sotto uno stereomicroscopio a bassa illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento, utilizzare una pinza curva fine per rimuovere con cura i peli, il tessuto adiposo, il tessuto connettivo, la polvere e le fibre dall'interno della pelle. Usa il PBS per mantenere la pelle bagnata. Con una pinza, trasferire la cute posteriore e anteriore, con l'interno rivolto verso l'alto, su un vetrino da microscopio adesivo.Usa il forcipe per appiattire la pelle. Montare la pelle in un mezzo di montaggio liquido anti-sbiadimento per evitare il foto-sbiancamento e preservare i segnali fluorescenti. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sopra o intorno alla pelle.Conservare i vetrini dei campioni di pelle macchiati al buio per una notte a temperatura ambiente per consentire al mezzo di montaggio di diventare solido. Quindi, usa lo smalto per unghie per sigillare il vetrino coprioggetti sul vetrino e conservalo a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Per eseguire la microscopia confocale, impostare laser appropriati per i fluorofori.In questo esperimento viene utilizzato un microscopio confocale con tre sorgenti laser. Acquisire immagini dei campioni sotto un obiettivo 10X e utilizzare lo strumento di scansione sequenziale, che eccita contemporaneamente i campioni con tripla colorazione, per evitare e ridurre qualsiasi sovrapposizione. In questo esperimento, la pelle dell'orecchio posteriore e anteriore del topo adulto sono state immunocolorate con anticorpi contro alfa-SMA, Tuj1 e PECAM-1.La cute posteriore è stata immunocolorata per studiare la distribuzione neuroimmune utilizzando anticorpi contro CD11b e MBP, insieme a Tuj1. Infine, come mostrato qui, la distribuzione delle cellule infiammatorie CD11b-positive, inclusi i macrofagi, è stata rilevata con una risoluzione di singola cellula. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare la pelle con cura e di rimuovere delicatamente e lentamente i peli, il tessuto adiposo e il tessuto connettivo dall'interno della pelle dell'orecchio prima del montaggio.Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per studiare la morfogenesi ramificata e il pattern dei nervi periferici e dei vasi sanguigni, nonché la distribuzione tridimensionale dei componenti della pelle, comprese le cellule immunitarie in modelli murini da giovani a adulti. Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

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