Name: Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Scopri come indurre rotture localizzate del DNA doppio filamento utilizzando un microscopio confocale laser 405 nm e quantificare automaticamente la dinamica dei fattori di riparazione nelle cellule U2OS.

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Questo lavoro è stato supportato da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada [Discovery sovvenzione 5026 Agresta] e da una nuova generazione di scienziati di borsa di studio dalla società di ricerca cancro [21531 per Agresta]. Ringraziamo Jean-François Lucier per fornire il controllo di qualità eccellente degli script Python Fiji e consulenza sull'analisi statistica. Ringraziamo il Dr. Stephanie A. Yazinski per la ricetta di soluzione di fissazione se. Ringraziamo Paul-Ludovic Karsenti per aiuto con le misurazioni di potenza laser.

1. pre-sensibilizzazione delle cellule
<ol><li>24 h prima dell'esperimento di micro-irradiazione, 40.000 U2OS cellule per pozzetto in 1 x DMEM contenente 10% FBS a 8 pozzetti cultura diapositive con fondelli 170 µm di spessore lamella-come vetro/polimeri per garantire massima trasmittanza di 405 nm luce laser e un'eccellente immagine del seme con una scansione laser confocale microscopio invertito. Se si utilizza un 8 pozzetti 2mpx, utilizzare 500 µ l di media o soluzioni per pozzetto per tutti i trattamenti successivi e le fasi di lavaggio del protocollo. Nota: A causa della loro morfologia piatta, buona aderenza e grandi nuclei, U2OS cellule facilitano l'accertamento di assunzione di proteine in siti di micro-irradiati, ma altri tipi di cellule aderenti possono essere utilizzati come necessario. Le cellule idealmente dovrebbero essere di circa 80% irradiati confluency al momento della micro-irradiazione per aumentare il numero di cellule per esperimento. Molto alta confluenza può comportare alterazioni del ciclo cellulare che possono perturbare le vie di riparazione specifico come ricombinazione omologa che si svolge durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare9.</li>
	<li>Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C con 5% CO2e quindi pre-sensibilizzare le cellule con (punto 1.3) BrdU o (punto 1.4) Giordano (Hoechst 33342). Nota: Per osservare dal vivo reclutamento di una proteina di interesse (PDI) per lesioni del DNA, transfect o trasducono il DNA del plasmide che trasportano una fusione tra una proteina fluorescente e un PDI 24 h dopo la semina delle cellule. 24h post-transfection/transduzione, pre-sensibilizzare e micro-irradiare le cellule per monitorare l'assunzione del PDI presso siti di danno del DNA in tempo reale.</li>
	<li>Per aumentare il numero di DSBs generati da esposizione per il laser di 405 nm, aggiungere 10 µM di BrdU ai media per 24 h prima del micro-irradiazione. Prima di micro-irradiamento, usando una micropipetta, sciacquare le cellule due volte con il mezzo senza rosso fenolo per garantire massima esposizione delle cellule al laser 405 nm.</li>
	<li>In alternativa, trattare le cellule per 15 min con Giordano a 10 µ g/mL nel mezzo appropriato in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. Dopo il trattamento, lavare due volte con il mezzo senza fenolo rosso prima del micro-irradiazione.</li>
</ol>2. micro-irradiazione delle cellule
<ol><li>Selezionare un adatto microscopio confocale a scansione laser. Nota: Gli esperimenti qui presentati sono stati eseguiti su un sistema di microscopio equipaggiato con una linea 50 mW 405 nm laser e un obiettivo di olio 63 X 1.4 apertura numerica. Per generare DSBs, le cellule erano micro-irradiati a 1 X scanner zoom a 1.024 x 1.024 pixel/field (0.21 µm/pixel 63 ingrandimenti) e in modalità unidirezionale a 8 µs/pixel. La potenza del laser utilizzata è stato il 25% e l'80% per celle Giordano e BrdU-pre-sensibilizzate, rispettivamente. Per aiutare gli utenti a configurare il proprio sistema, post-l'obiettivo di potenza laser sul sistema presentato è stato misurato utilizzando un misuratore di potenza secondo le istruzioni del produttore. Le misure corrispondono a 2,6 mW e 7.0 mW per Giordano e BrdU-pre-sensibilizzate le cellule, rispettivamente.</li>
	<li>
Accendere il microscopio e la camera ambientale.
	<ol>
<li>Impostare la camera a 37 ° C con 5% CO2 prima campioni vengono posti in incubatrice sul palco per evitare inutili stress alle cellule e garantire cinetiche omogenee di DDR attraverso esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezionare uno o più campi con cellule ben distribuiti, regolare la messa a fuoco e registrare la loro posizione per facilitare l'acquisizione di immagini dopo il protocollo di se. Acquisire almeno un'immagine che servirà come punto di riferimento pre-danni per monitorare la cinetica di reclutamento di proteine dopo micro-irradiazione. Nota: Recipienti di coltura Gridded possono anche essere utilizzati per facilitare la localizzazione delle cellule micro-irradiati a passi successivi.<ol>
<li>Per gli esperimenti se usando le cellule Giordano-etichettati, regolare il fuoco sulle cellule utilizzando il laser 405 nm con il minimo consumo di laser sufficiente per visualizzare le celle al fine di evitare ingiustificato danno del DNA.<ol>
<li>Evitare di utilizzare widefield fluorescenza per regolare il fuoco sul Giordano-macchiato le cellule, come i raggi UV emessi dalla lampada può indurre il danno del DNA in siti illuminati.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Se usando le cellule di BrdU-etichettati, regolare il fuoco utilizzando imaging contrasto di fase o contrasto differenziale di interferenza (DIC) guardando sub-nucleare caratteristiche quali i nucleoli.</li>
		<li>Se utilizza cellule esprimenti POIs fluorescente-etichetta, selezionare un piano focale con l'intensità di fluorescenza rappresentativo. Nota: Evitare di cellule che esprimono livelli molto alti del PDI come forte sovraespressione può provocare artifactual localizzazione. Inoltre, selezionare le celle che esprimono il PDI a livelli comparabili (selezione di cloni stabili si raccomanda vivamente di minimizzare le variazioni nei livelli di espressione e reclutamento di PDI).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurare il microscopio per il passaggio di micro-irradiazione usando il fluorescenza-recupero dopo Module photobleaching (FRAP) del sistema. Nota: I parametri più importanti da considerare quando messa a punto del sistema di microscopio per esperimenti di micro-irradiazione sono: la potenza di uscita del laser 405 nm, numero di iterazioni (cioè il numero di volte il laser andrà oltre le stesse coordinate), numero di pixel/campo (a 63 X ingrandimento e risoluzione di 1.024 x 1.024, 1 pixel = 0.21 µm) e tempo di permanenza al pixel. Tutti questi fattori avrà un impatto la quantità di energia che le cellule di esperienza e così la quantità e il tipo di DNA danni generati (Vedi discussione per ulteriori informazioni sull'ottimizzazione di dose).</li>
	<li>Utilizza il modulo FRAP del sistema microscopio, micro-irradiare le cellule. Nota: Sulla maggior parte dei sistemi micro-irradiazione di più celle può essere eseguita in un singolo campo come macchie o linee/rettangoli (in genere 1-2 µm di larghezza). Durante l'esecuzione di live-imaging delle proteine fluorescente etichettati immediatamente post-danneggiare, limitare il micro-irradiazione ad un piccolo numero di cellule per campo, perché il tempo impiegato per micro-irradiare ogni cella si tradurrà in un'induzione ritardata della DDR. Ciò è particolarmente importante durante il monitoraggio di proteine che sono reclutate molto rapidamente a lesioni del DNA.</li>
	<li>
Dopo micro-irradiazione, rimessa le diapositive multi pozzetto o piastre in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per la durata necessaria prima del trattamento campioni per se (sezione 5) o procedere immediatamente con live-imaging (sezione 3).
	<ol>
<li>Come primo passo, è necessario fissare le cellule in pochi minuti e fino a pochi dopo irradiazione di ore per il protocollo di se. A seconda del PDI, cinetica di reclutamento può variare. In genere, le proteine che sono della cromatina-associated presso DSBs e SSB localizzano molto rapidamente alla lesione e a volte vengono rimossi entro 5 min. Alcuni fattori come quelli che assemblano a ssDNA saranno reclutati intervalli successivi di tempo una volta che il macchinario di resezione è stato impegnato e vi rimangono per ore (Vedi Figura 1 e riferimento4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vivere-imaging di proteine identificate fluorescente
<ol><li>Eseguire time-lapse imaging delle cellule micro-irradiati. Per proteine che sono reclutate molto rapidamente alle lesioni, pochi secondi per fotogramma saranno l'ideale, ma per le proteine che si localizzano la zona danneggiata dopo (ad es., fattori di resezione), acquisizione possono essere eseguita ogni 1-2 minuti fino a raggiunta un plateau. Nota: Ridurre al minimo la potenza del laser per l'acquisizione immagine per evitare lo sbiancamento per quanto possibile e garantire che assunzione di proteine nei siti di danno non raggiunge saturazione che precluderebbe segnale quantificazione e analisi successive (Vedi analisi dei dati Sezione 4). Il sistema presentato, l'imaging è stato fatto con un 63 X / olio 1.4 obiettivo utilizzando un tempo di permanenza di 8 µs/pixel, risoluzione 1.024 x 1.024, 1 X zoom e con una media di 2. Nota che questi parametri devono essere ottimizzati per altri sistemi e/o esperimenti differenti.</li>
	<li>Micro-irradiare le cellule nei campi aggiuntivi fino a misure cinetiche sono ottenute per 15-30 celle. Ripetere gli esperimenti almeno 3 volte in biologici replicati per garantire l'accuratezza e la riproducibilità della cinetica di reclutamento. Nota: Quando si adatta questo protocollo per uno specifico sistema confocale, può essere utile iniziare monitorando la cinetica di reclutamento di un fattore di manutenzione di genoma noto fluorescente etichettati (ad es., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, ecc.). Utilizzando live-imaging per ottimizzare le condizioni di micro-irradiazione permetterà all'utente di testare rapidamente più parametri.</li>
</ol>4. reclutamento analisi cinetiche
<ol><li>Installare il plugin Microirradiation analisi10 in il Fiji image analysis software11.</li>
	<li>
Aprire le immagini acquisite in Fiji. Selezionare "The danni Analyzer" dal menu a tendina plugin nella suite Microirradiation analisi. Seguire le istruzioni per definire un'area di sfondo di interesse (ROI) (in genere 3 x 3 µm) e non irradiati e irradiati ROIs in ogni cella di micro-irradiati.
	<ol>
<li>ROIs di uso delle stesse dimensioni per minimizzare potenziali pregiudizi nel dire le intensità del segnale. Per immagini acquisite, anche includere almeno un fotogramma pre-irradiazione che servirà come base per monitorare assunzione presso siti di micro-irradiati.</li>
		<li>Una volta che tutte le ROI dati sono stati raccolti nel corso della serie full time-lapse, salvare il file creato dal plugin contenente i risultati come file txt (file di delimitato da tabulazione) o csv (file delimitato da virgole). Questo file contiene misure di intensità media per ciascun punto di tempo e ogni ROI (dire sfondo di intensità, significa intensità Non irradiati e significa intensità irradiati). Nota: Il plugin automaticamente sottrae l'intensità di sfondo (iob) dall'intensità della ROIs irradiati (s) e il ROIs non irradiati (hon). Calcola automaticamente anche un rapporto fra entrambi i valori (Vedi la formula qui sotto) per correggere per photobleaching (irradiata/Non-irradiati). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> Il plugin inoltre calcola una normalizzazione tra il primo punto di tempo (valore impostato su 1) e tutti gli altri punti di tempo per ogni nucleo (rapporto rispetto al primo punto temporale). Ulteriori informazioni sono reperibili sul sito Web plugin10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire l'analisi utilizzando il plugin per tutti i micro-irradiati cellule (almeno 15-30) e rappresentare graficamente l'arricchimento medio relativo alle regioni di micro-irradiati nel corso del tempo. Calcolare gli errori standard della media per ogni punto e tracciarle.
	<ol>
<li>Confermare le differenze nella cinetica di reclutamento tra due condizioni sperimentali mediante l'esecuzione di Student t-test per ogni punto dati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Se protocollo
<ol><li>
Preparare soluzioni di se. Preparare la soluzione di pre/post-extraction (ghiacciata 1X PBS contenente 0,25% Triton X-100), soluzione di lavaggio (1x PBS contenente 0.05% Tween-20), soluzione di blocco (1x PBS contenente 3% BSA e 0.05% Tween-20) e soluzione di fissazione (paraformaldeide 3% + 2% di saccarosio in PBS 1 x) in provette coniche in polipropilene. Nota: Per un singolo 8 pozzetti 2mpx, 10 mL di soluzione pre/post-extraction, 50 mL di soluzione, 10 mL di soluzione bloccante e 5 mL di soluzione di fissazione di lavaggio sono necessari.<ol>
<li>Preparare la soluzione di fissaggio.<ol>
<li>Sotto una cappa chimica, mescolare 400 mL di acqua bidistillata (ddH2O) con 15 g di paraformaldeide e 30 µ l di NaOH 10 N in una beuta da 1 L.</li>
			<li>Chiudere il contenitore e il calore a 65 ° C su una piastra calda agitatore magnetico, mescolando per solubilizzare il paraformaldeide completamente.</li>
			<li>Utilizzando una pipetta 25 mL, aggiungere 50 mL di 10X PBS, mescolare e filtro utilizzando un filtro da 0,45 µm.</li>
			<li>Aggiungere 10 g di saccarosio e portare a 500 mL con ddH2O.</li>
			<li>Aliquota della soluzione in provette coniche da 15 mL; conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare i nuclei soluzione di colorazione diluendo una soluzione madre di 1 mg/mL di 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 in PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando una micropipetta, rimuovere attentamente il supporto dai pozzi le diapositive di microscopia multi pozzetto o piastre e lavare immediatamente con 500 µ l di soluzione di lavaggio se modificando la soluzione due volte senza attesa. Nota: I dati se qui presentati sono stati ottenuti utilizzando cellule sviluppate nelle diapositive di microscopia di 8 pozzetti che sono stati lavati e incubati in 500 µ l di tutte le soluzioni. Volumi dovrebbero essere regolati secondo i contenitori di cultura cellulare utilizzati da sperimentatori. Inoltre, eseguire il protocollo se con estrema cura, come le cellule possono staccare facilmente dal fondo di vetro/polimero. Utilizzare una micropipetta per tutte le modifiche di soluzione per ridurre al minimo la perdita delle cellule.</li>
	<li>Incubare in ghiaccio per 5 min con 500 µ l di ghiacciata se soluzione pre/post-extraction e ricciolo delicatamente a mano per 15 – 30 s eseguire pre-l'estrazione passo che rimuove più proteine citoplasmiche e adrenocorticale e massimizza il segnale dalla cromatina / Fattori DNA-collegati.</li>
	<li>Lavare due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio se.</li>
	<li>Incubare per 15 min a temperatura ambiente in 500 µ l di soluzione di fissaggio se. In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione di paraformaldeide precostruito (3 – 4%) per il passaggio di fissazione.</li>
	<li>Lavare due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio se.</li>
	<li>Incubare in ghiaccio per 5 min in 500 µ l di ghiacciata se pre/post-extraction soluzione e agitare la diapositiva delicatamente a mano per eseguire il passaggio di permeabilizzazione.</li>
	<li>Lavare due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio se.</li>
	<li>Incubare per almeno 30 min a temperatura ambiente con 500 µ l di soluzione bloccante se.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione bloccante utilizzando una micropipetta e incubare per una notte in una camera umidificata a 4 ° C con gli anticorpi primari µ l 250 diluiti in soluzione di blocco. Nota: È buona norma eseguire l'incubazione con gli anticorpi primari in sequenza per evitare potenziali artefatti di co-localizzazione. Una volta che sono stati effettuati controlli appropriati, incubare simultaneamente gli anticorpi primari per accelerare il processo.</li>
	<li>Lavare quattro volte per 5 min in 500 µ l di soluzione di lavaggio se con movimentazione delicata (60 rpm in un rotatore).</li>
	<li>Incubare per 1h a 37 ° C con 250 µ l di anticorpi secondari diluito in soluzione bloccante in una camera umidificata. Nota: Proteggere i campioni dalla luce con l'aggiunta di anticorpi secondari fluorescente etichettati.</li>
	<li>Lavare 4 volte ciascuno per 5 min in 500 µ l di soluzione di lavaggio se con agitazione delicata.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 5 min in 500 µ l di 1X PBS contenente 1 µ g/mL DAPI a macchiare i nuclei.</li>
	<li>Lavare due volte con 500 µ l di PBS 1X e lasciare le cellule in 500 µ l di soluzione di PBS per l'imaging: 1x.</li>
	<li>Utilizzando gridded diapositive o posizioni di fase registrati, trovare le celle con micro-irradiati utilizzando un indicatore di danni del DNA ben caratterizzato (ad es., γ-H2A.X, RPA32, ecc.).</li>
	<li>Immagine la cultura multi-pozzetto diapositive o piastre in tutti i canali pertinenti utilizzando le impostazioni appropriate su un microscopio confocale a scansione laser. Nota: Il sistema presentato, l'imaging è stato fatto con un 63 X / olio 1.4 obiettivo utilizzando un tempo di permanenza di 8 µs/pixel, risoluzione 1.024 x 1.024, 1 X zoom e con una media di 2. Nota che questi parametri devono essere ottimizzati per altri sistemi e/o esperimenti differenti.</li>
</ol>

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<li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).</li>
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<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+a+%CE%B3H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li>
<li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Utilizzando i metodi descritti sopra, 405 nm laser micro-irradiazione delle cellule pre-sensibilizzate con Giordano o BrdU consente la generazione localizzata delle lesioni del DNA compreso DSBs all'interno dei nuclei delle cellule umane aderenti. Cinetica della DDR a questi DSBs sono simili a quelli generati con altri metodi in cellule eucariotiche9,18,19. Resezione di DSB presso siti di micro-irradiati conduce a ssDNA-generazi...

Le cellule sono costantemente esposti a fonti endogene ed esogene di danno del DNA che minacciano l'integrità genomica. Il DDR è un insieme di vie che rilevare, segnalare e ripristino le lesioni del DNA per sostenere la stabilità del genoma di segnalazione. Alle rotture del doppio filamento del DNA (DSBs), la DDR si verifica principalmente su due piattaforme complementari: γ-H2A.X-labeled cromatina e una regione di DNA (ssDNA) single-stranded resecata in genere rivestito con il ssDNA-associazione complessa RPA1,2.
Micro-irradiazione UV-laser delle cellule pre-sensibilizzate con la timidina analogica 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) o la tintura di DNA bisbenzimide etossido triidrocloruro (Giordano, Hoechst 33342) crea una miscela di lesioni del DNA tra cui rotture del singolo filamento ( SSB) e DSBs che suscitare un DDR localizzato sulla cromatina sia ssDNA piattaforme3,4. Lavori precedenti hanno mostrato che il reclutamento di fattori di mantenimento del genoma per queste due piattaforme distinte al DSB può essere discriminata utilizzando laser a raggi UV-A ad alta energia (335-365 nm) combinato con se2,5. Microscopi dotati di tali laser sono costosi, in quanto richiedono un laser ad alta energia e obiettivi trasmettenti dedicati di UV-A che li rende molto meno prevalente in contesti accademici e farmaceutici che microscopi confocale a scansione laser con laser 405 nm linee. Lo studio di assunzione di proteine e di scambio in siti di micro-irradiati è interdetto anche dall'analisi manuale laborioso dell'immagine necessario per descrivere il comportamento dinamico di fattori di mantenimento del genoma.
Qui, indichiamo che il pre-sensibilizzazione delle cellule con BrdU o Giordano acido nucleico macchia seguita da micro-irradiazione con un laser di 405 nm su un comune microscopio confocale permette il monitoraggio delle dinamiche di fattore di manutenzione genoma a lesioni del DNA. L'utilizzo di γ-H2A.X o subunità complessa RPA come marcatori di piattaforma insieme a z-stacking per una maggiore profondità di campo e deconvoluzione per una migliore risoluzione consente lo sperimentatore di discriminare i fattori che sono reclutati localmente a DSBs da quelle che si diffondono a domini di cromatina grande che circonda la lesione iniziale. Questa sub-classificazione secondo distinti compartimenti intra-nucleare aiuta a perfezionare i potenziali ruoli delle proteine atipici reclutati ai siti di micro-irradiati. Inoltre, forniamo conveniente protocolli e ottimizzato condutture per analizzare rapidamente la dinamica dei fattori di mantenimento del genoma utilizzando il software open-source Fiji (una distribuzione ImageJ)6,7,8. Questi perfezionamenti per gli attuali metodi di micro-irradiazione rendono lo studio della DDR possibile in praticamente qualsiasi ambiente di laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 microscopio confocale a scansione laser risonante</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 software (versione 2.1)</td><td>Laser Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405 nm</td><td>Sorgente di</td><td></td><td>radiazioni</td>coerente</tr><tr><td>Incubatore per microscopio AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60X /1.4 Obiettivo</td><td>Olio Olympus</td><td></td><td> obiettivo ad immersione</td></tr><tr><td>vetrini di coltura a 8 pozzetti su vetrino coprioggetto (X-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>U2OS linea cellulare umana per osteosarcoma</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Linee cellulari stabili&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindolo (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Attenzione</td></tr><tr><td>tossico 5-bromo-2&prime;-deossiuridina&nbsp;( BrdU)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Attenzione tossico</td></tr><tr><td>Bisbenzimmide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,1%&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Reagente di</td> trasfezione BioShop <td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME&nbsp;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade montante con DAPI&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, + rosso fenolo</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, - rosso fenolo</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RPA32 di topo</td><td>Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 per IF</td></tr><tr><td>Coniglio anti-&gamma;-H2A. Segnalazione cellulare anticorpo X</td><td>&nbsp;</td><td>9718S</td><td>1:500 per IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-53BP1 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>4937S</td><td>1:500 per IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-PRP19 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>1:500 per IF</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td><td>Cell Signaling&nbsp;</td><td>4414S</td><td>1:250 per IF</td></tr><tr><td>Capra anti-topo&nbsp; IgG Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>4408S</td><td>1:250 per</td></tr><tr><td>il software open source per l'analisi delle immagini IF Fiji&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>1918-K Misuratore di potenza con sensore 918D-SL-0D3</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indagine di assunzione di proteine per lesioni del dna utilizzando 405 nm laser micro-irradiazione

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

La risposta di danno del DNA (DDR) utilizza una pletora di proteine per rilevare, segnalare e riparare le lesioni del DNA. Delineazione di questa risposta è fondamentale per capire i meccanismi di manutenzione del genoma. Dal momento che il reclutamento e lo scambio di proteine alle lesioni sono altamente dinamici, il loro studio richiede la capacità di generare danni al DNA in maniera rapida e spazialmente delimitato. Qui, descriviamo le procedure per indurre localmente il danno del DNA in cellule umane utilizzando un microscopio confocale laser-scanner comunemente disponibile dotato di una linea di laser 405 nm. Accumulo di manutenzione genoma fattori alle strisce di laser possono essere valutati mediante immunofluorescenza (IF) o in tempo reale utilizzando proteine etichettati come reporter fluorescenti. Utilizzando fosforilato istone H2A. X (γ-H2A.X) e Replication Protein A (RPA) come marcatori, il metodo fornisce una risoluzione sufficiente per discriminare fattori reclutati da coloro che si sono diffuse sulla cromatina adiacente. Forniamo ulteriori script basati su ImageJ per monitorare in modo efficiente la cinetica di rilocalizzazione della proteina al DNA danni siti. Questi perfezionamenti semplificano notevolmente lo studio della dinamica della DDR.

A seguito di micro-irradiamento, le cellule sono autorizzate a recuperare per un determinato periodo di tempo a seconda della natura del genoma manutenzione proteine1,12. DSBs saranno trattati dall'azione delle nucleasi, più estesamente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare, per creare una regione limitata di ssDNA che rapidamente è rivestita da RPA e altri fattori di mantenimento del genoma9. Questa r...

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare rotture localizzate del DNA a doppio filamento utilizzando un microscopio confocale a scansione laser a 405 nanometri ampiamente disponibile e fornire procedure automatizzate per quantificare la dinamica dei fattori di riparazione del DNA in queste lesioni. Questo metodo può essere utilizzato per determinare se una data proteina viene reclutata per le rotture del DNA a doppio filamento e delineare le vie di segnalazione che regolano il suo accumulo nelle lesioni del DNA. La tecnica utilizza un sistema di microscopio confocale comunemente disponibile per indurre localmente il danno al DNA.Ciò consente praticamente a qualsiasi laboratorio di studiare la cinetica della risposta al danno al DNA. Se si monitora il reclutamento in tempo reale di una proteina marcata in fluorescenza, eseguire la trasfezione transitoria o la selezione di linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse, fuse con un reporter fluorescente. 24 ore prima dell'esperimento di micro-irradiazione, seminare 40.000 cellule U2OS per pozzetto in DMEM 1X contenente il 10% di FBS, in vetrini di coltura a otto pozzetti, con fondi in polimero di vet

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I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare in modo efficiente le cellule in fase S per studi di microscopia a valle, come la misurazione del reclutamento di proteine di riparazione del DNA mediante microirraggiamento laser.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare il piccolo RNA interferente specifico della proteina da shock termico 27 (HSP27) per valutare la funzione di HSP27 durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. L'interferenza dell'RNA è il metodo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica per studiare la funzione delle proteine in vari tipi di cellule.

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Il danno mirato al DNA può essere ottenuto legando un agente dannoso al DNA a un oligonucleotide (TFO) che forma un triplex. Utilizzando TFO modificati, l'associazione proteica specifica per il danno al DNA e la modifica della topologia del DNA possono essere studiate nelle cellule umane utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA qui descritti.

Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks

La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo.

Protocolli per l&#39;assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

Scopri come indurre rotture localizzate del DNA doppio filamento utilizzando un microscopio confocale laser 405 nm e quantificare automaticamente la dinamica dei fattori di riparazione nelle cellule U2OS.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

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