Name: Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l intestino di Live Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Scopri come valutare la perdita di acidità lisosomica nell'intestino di Caenorhabditis elegans usando il colorante cDCFDA. Questo metodo semplice e riproducibile aiuta a studiare l'autofagia e la funzione lisosomica.

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Vorremmo ringraziare il centro di genetica di Caenorhabditis per i ceppi, le scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI) per il finanziamento. Vorremmo ringraziare Dr. Lizhen Chen (dipartimento di sistemi cellulari e anatomia, UT Salute San Antonio) per consentire l'utilizzo illimitato del suoi attrezzature di laboratorio per tutti gli esperimenti di c. elegans , nonché Exing Dr. Wang (direttore associato, Optical Imaging Facility UT Salute San Antonio) per assistenza con la microscopia confocale. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Myron Ignatius per fornire supporto e incoraggiamento per facilitare le riprese video.

1. coloranti e lisosomi intestinali di immagine
<ol><li>Piastre di coltura seme del nematode (NGM) con OP50
	<ol>
<li>Preparare piatti NGM secondo il protocollo raccomandato19 e lasciate asciugare per 2 giorni a temperatura ambiente le piastre chiuse.</li>
		<li>Inoculare i batteri OP50 in brodo di Luria brodo (LB) sterile e crescere in un'agitazione incubatore o bagnomaria a 37 ° C per 36 h o fino a quando il diametro esterno è compresa tra 0,2 e 0,4. Evitare l'uso di una coltura batterica con OD > 1 o OD < 0.2.</li>
		<li>Una volta piastre NGM sono asciutti, depositare una goccia (~ 30 µ l) di inoculo OP50 sul centro del piatto e quindi diffondere la goccia in una patch di circa 2 cm x 2 cm nel formato. Nota: Qualsiasi inoculo OP50 rimanente sono memorizzabili a 4 ° C per fino a un mese.</li>
		<li>Capovolgere le piastre OP50 quando l'inoculo si è asciugato (circa 10 o 15 min) e poi incubare le piastre a 37 ° C per 36 h.</li>
		<li>Dopo 36H, rimuovere le piastre dall'incubatore e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo successivo. Nota: Le piastre dovrebbero essere buone per fino a 1 mese a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA complemento per OP50
	<ol>
<li>Per integrare la cDCFDA sulle piastre OP50, preparare un brodo di lavoro di 10 mM cDCFDA in dimetilsolfossido (DMSO). Mantenere la soluzione di cDCFDA protette dalla luce e conservare a-20 ° C per un uso successivo.</li>
		<li>Posizionare delicatamente il 100 µ l di soluzione di cDCFDA di 10 mM sulla superficie del cerotto OP50 2 cm x 2 cm, tale che l'intero patch è uniformemente coperto con cDCFDA. Nota: È molto importante che l'intero patch di OP50 è coperto con cDCFDA. Se necessario, è possibile utilizzare fino a 150 µ l di cDCFDA per ogni piatto. Inoltre è indispensabile che la soluzione di cDCFDA non si estende oltre i bordi della patch OP50, poiché qualsiasi cDCFDA che scorre fuori la patch OP50 non verrà incorporata nell'alimento e si tradurrà in ridotta intensità di colorazione.</li>
		<li>Posizionare le piastre di OP50 in una casella scura sulla parte superiore del banco, fino a quando tutta la soluzione cDCFDA è assorbito nella patch batterica (solitamente circa 25-30 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Macchiatura worm utilizzando cDCFDA
	<ol>
<li>Una volta che il cDCFDA ha completamente permeato la patch OP50, inserire non più di 20 vermi per piastra e incubare le piastre invertite a 20 ° C per un minimo di 14 h. Nota: Si consiglia di posizionare le piastre di cDCFDA in una scatola opaca per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Per controllare le differenze di assunzione tra esperimenti e per normalizzare i segnali cDCFDA, co-macchia con 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ((consigliato) difluoro) boro (2,5 µ l di una soluzione preparata 1 mM), un colorante di ammina debole acidotropic cui fluorescenza è in gran parte non di tipo variant su tutto lo spettro di pH acido (Vedi Tabella materiali per nomi comuni dei reagenti). Nota: Non si colorano vermi per meno di 14 h, poiché questo può fornire cDCFDA insufficiente intensità di colorazione e dare una falsa interpretazione del pH lisosomiale.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare vetrini per microscopia
	<ol>
<li>Posizionare due strisce parallele di etichettatura nastro circa 3 pollici di distanza su una superficie liscia e piana, ad esempio uno specchio (Figura 1).</li>
		<li>Rivestire la superficie dello specchio con spray idrorepellente e asciugare il liquido in eccesso.</li>
		<li>Sciogliere agarosio al 2% (disciolto in acqua distillata H2O) in un forno a microonde fino a quando completamente liquefatto, poi mettere una goccia di 50 µ l di agarosio tra le due strisce di nastro adesivo e rapidamente coprire la goccia con un vetrino da microscopio, tale che il vetrino sia perpendicolare alle strisce di nastro. Dopo l'agarosio è solidificato, formando un pad circolare sotto la diapositiva, capovolgere la diapositiva e aggiungere 10-15 µ l di 5mM sodio azide (NaN3) sul blocchetto di agarosio. Nota: NaN3 è un inibitore del citocromo C che, se usato in concentrazioni basse, reversibilmente anestetizza vermi affinché essi non si sposti durante la formazione immagine.</li>
		<li>Prendono i vermi dalla piastra OP50 completati con cDCFDA e trasferirli in un piatto pulito di NGM senza qualsiasi OP50. Consentire i vermi di muoversi per alcuni secondi per consentire la maggior parte della OP50 per essere rimosso dalla superficie dei vermi e quindi trasferire i vermi per il pad di agarosio contenente 5 mM sodio azide.</li>
		<li>Coprire immediatamente il pad di agarosio con un vetrino coprioggetto. Assicurarsi di posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto senza esercitare troppa pressione, poiché questo può provocare vermi scoppiando. Nota: I batteri OP50 completati con cDCFDA reagiscono in quando visualizzate da microscopia, quindi è importante pulire i vermi come miglior possibile prima della loro immissione sul pad di agarosio contenente sodio azide. Se durante la preparazione più di 6 ceppi di c. elegans (tra cui N2, controllo di tipo selvaggio), si consiglia di preparare i campioni in lotti di 6, in modo da garantire che i vermi non asciugarsi sul pad di agarosio. In alcuni ceppi, vulva inizia a rompersi dopo lunghi periodi di tempo a causa della pressione dal vetrino coprioggetto, quindi è importante pianificare di conseguenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia confocale Nota: Alcuni microscopi hanno una funzionalità incorporata che aumenta automaticamente l'intensità di fluorescenza per compensare i livelli variabili di fluorescenza. Tali microscopi non potrebbero funzionare bene per vermi macchiati con cDCFDA, in quanto intrinsecamente aumentano l'intensità della fluorescenza di campioni di imaging.<ol>
<li>Eseguire imaging su un microscopio confocale standard utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione impostata su 488/530 nm per cDCFDA. Prendere le immagini su un unico piano (non Z-stack) dei lisosomi intestinali e utilizzare solo i lisosomi che sono a fuoco (intensità di segnale massima) per la quantificazione di intensità. Nota: Forse a causa delle differenze nella disponibilità di tintura, i lisosomi delle cellule intestinali direttamente posteriore alla faringe mantengono cDCFDA intensità indipendentemente dal genotipo o età di colorazione, quindi cura deve essere preso per evitare i lisosomi in queste cellule di imaging.</li>
		<li>La diapositiva contenente 2 giorno vecchio selvaggio tipo che N2 worm prima della battuta. Mentre così facendo, regolare i parametri di imaging confocale come potenza laser, pinhole e aperture per garantire che l'intensità di colorazione di cDCFDA non è troppo saturi. Nota: Una volta impostate, queste impostazioni non modificarle per tutta la durata dell'imaging per quel giorno.</li>
		<li>Catturare immagini a 1024 x 1024 pixel di un unico piano dell'intestino (3 o 4 immagini al verme) utilizzando una lente di ingrandimento di 60x. Nota: Lo spettro di emissione di cDCFDA a worms produrrà un singolo picco prominente a 520 nm in coincidenza con i suoi segnalati fluorescenza spettro20, fornendo una lettura segnale specifico che è distinta da autofluorescence intestinale (Figura 3).</li>
		<li>Esportare immagini confocal raw (file .lsm) come file TIFF per ogni canale.</li>
		<li>Quindi, aprire ImageJ e fare clic sul File | Aprire per aprire il file di immagine da quantificare. Una volta che l'immagine viene caricata, è possibile utilizzare lo strumento di selezione di forma ovale in ImageJ per selezionare una regione di interesse (ROI).</li>
		<li>Successivamente, fare clic su Analyze | Misura per quantificare l'intensità di fluorescenza per quel ROI. Selezionare 4 – 5 diversi lisosomi di messa a fuoco per ogni immagine e calcolare l'intensità di fluorescenza relativa media di ogni area di interesse (ROI).</li>
		<li>Per ogni immagine, misurare l'intensità di fluorescenza di fondo in una regione dell'intestino tra i lisosomi. Sottrarre i valori di intensità di fluorescenza di fondo dai valori di intensità di fluorescenza lisosomiale.</li>
		<li>In totale, raccogliere circa 30 a 50 singoli valori normalizzati per cDCFDA intensità (6-10 animali) per ogni sforzo in fase di test. Utilizzare questi valori per tracciare una casella e Baffo trama utilizzando qualsiasi software statistico appropriato. Nota: Colorazione può variare notevolmente a seconda di fattori come temperatura, tempo di incubazione e la salute/età complessiva degli animali tale che sono rilevanti all'interno del processo di campioni nello stesso esperimento colorazione solo i confronti di intensità di fluorescenza. Pertanto è importante elaborare controlli in ogni esperimento di colorazione. Calcolare le differenze statistiche (t-test) utilizzando qualsiasi software statistico appropriato.</li>
		<li>Immagine tutti i ceppi dallo stesso esperimento (macchiato lo stesso giorno) in sequenza, facendo attenzione a non per modificare i parametri di imaging.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Una varietà di eventi cellulari e molecolari contribuiscono all'invecchiamento, influenzato da tratti di storia di vita e fattori genetici. Nostro recente studio22 suggerisce che il ciclo riproduttivo svolge un ruolo importante nel controllare l'idoneità del soma attraverso la regolazione della dinamica di pH lisosomiale. Abbiamo mostrato che proteolisi lisosomiale-mediata sono promosso mentre gli animali si riproducono attivamente dal upregulation della trascrizione del v-atpasi, che a sua volta ...

L'aspetto di aggregati proteici ampiamente è accettato per essere un marchio di garanzia di invecchiamento in cellule eucariotiche1,2,3e la formazione di cui è pensato per essere tra i piloti di principio di senescenza cellulare4 , 5 , 6 , 7. sta coltivando la prova che come cellule età, catabolismo proteico è alterato, portando ad un aumento di aggregazione proteica. Il crollo di proteolisi in cellule di invecchiamento comporta un danno dell'autofagia8 , così come di degradazione proteasome-mediata della proteina9. Infine, ossidazione irreversibile della proteina è aumentata in cellule vecchie, compromettendo ulteriormente proteina catabolismo10.
L'autofagia è stato inizialmente pensato per essere un processo non-selettivi per la degradazione della massa di proteine danneggiate, ma recenti studi hanno indicato che l'autofagia è altamente selettivo per il catabolismo di aggregati di proteine e organelli disfunzionali che non sono suscettibili di degradazione tramite altri meccanismi di clearance proteina11. Durante il processo di autofagia, proteine danneggiate e aggregate sono sequestrate in una vescicola di doppia membrana chiamata autofagosoma. Quindi questo autofagosoma si fonde con gli acidi organelli chiamati lisosomi, che porta alla degradazione dell'autofagosoma carico12. I lisosomi rappresentano il punto finale del pathway autofagico e partecipano a diversi processi cellulari come la riparazione della membrana, controllo trascrizionale e rilevamento dei nutrienti; evidenziando il loro ruolo centralizzato nell'omeostasi cellulare (rivisto in rif. 13). Parecchi studi hanno indicato un'associazione tra una diminuzione età-dipendente nella funzione lisosomiale e vari disordini di neurodegenerative13. Coerentemente, ristabilimento della funzione lysosomal in cellule anziani può ritardare l'insorgenza di relazione con l'invecchiamento fenotipi14,15. Gli studi della composizione del milieu mancata suggeriscono che il collasso della funzione lysosomal in cellule anziani non è a causa di una riduzione della produzione di proteasi lisosomiali16. In alternativa, è stato proposto che perdita di acidità intralysosomal, un requisito fondamentale della sua attività enzimatica, può essere alla base il calo di proteolisi lisosoma-mediata17. Per essere in grado di esplorare questa ipotesi, è essenziale sviluppare reagenti e protocolli per sondare i cambiamenti dinamici nel pH lisosomiale in cellule vive in maniera coerenza e replicabile.
L'intestino di c. elegans è il tessuto metabolico principale in viti senza fine ed è un regolatore critico dell'omeostasi sistemica e durata della vita. Abbiamo sviluppato saggi per valutare i cambiamenti dell'acidità del lume intestinali lisosomi di vermi per determinare come lisosoma-mediata proteolisi contribuisce all'invecchiamento. Anche se fluorofori pH sensibili sono stati usati precedentemente in c. elegans per contrassegnare i lisosomi intestinali, ci non è stato ancora uno sforzo per stabilire un protocollo di successo in grado di rilevare piccoli aumenti in pH lisosomiale in vivo18. Qui, forniamo un protocollo che può essere utilizzato per rilevare la perdita di acidità lisosomiale nelle cellule intestinali di c. elegans utilizzando un protocollo di alimentazione semplice e conveniente che incorpora un fluoroforo pH sensibili (cDCFDA) in OP50 cibo.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Ordina online all'https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carbossi-2',7'-diclorofluoresceina diacetato&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Comunemente noto come cDCFDA</td></tr><tr><td>9-dietilammino-5H-benzo(a)fenossazina-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metilidene]-2H-pirrolo-5-il-kappaN}-N-[2-(dimetilammino)etil]propanamidato)(difluoro)boro</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Comunemente noto come Lysotracker Microscopio</td></tr><tr><td>confocale rosso (ad es. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Scarica gratuitamente da https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Brodo in polvere</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo in polvere</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>coprioggetti ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specchio o altra superficie</td><td></td><td></td><td></td> piana liscia</tr></tbody></table>

valutazione lysosomal alcalinizzazione l' intestino di live caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un sistema di modello che è ampiamente usato per studiare la longevità e le vie dello sviluppo. Tali studi sono facilitati dalla trasparenza dell'animale, la capacità di avanti e indietro le analisi genetiche, la relativa facilità di generare proteine fluorescente contrassegnati e l'uso di coloranti fluorescenti che possono sia essere microiniettati in anticipo embrione o incorporati in suo cibo (e. coli ceppo OP50) per etichettare gli organelli cellulari (ad es. 9-diethylamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Qui, presentiamo l'uso di un colorante fluorescente pH sensibili che macchie intestinali lisosomi, fornendo una lettura visiva dei cambiamenti dinamici, fisiologici acidità lisosomiale in vermi vivi. Questo protocollo non misurare pH lisosomiale, ma piuttosto mira a stabilire un metodo affidabile di valutazione fisiologiche varianti pertinenti lysosomal acidità. cDCFDA è un cellulare-permeante composto che viene convertito il fluoroforo fluorescente 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) su idrolisi dalle esterasi intracellulari. Protonazione all'interno dei lisosomi trappole cDCF in questi organelli, dove si accumula. A causa del suo basso pKa di 4.8, questo colorante è stato utilizzato come un sensore di pH in lievito. Qui descriviamo l'uso di cDCFDA come integratore alimentare per valutare l'acidità dei lisosomi intestinali in elegans del c. Questa tecnica consente il rilevamento dei lisosomi alcalinizzante in animali vivi, e ha una vasta gamma di applicazioni sperimentali tra cui studi sull'invecchiamento, autophagy e biogenesi lisosomiale.

cDCFDA macchie lysosomes in maniera dipendente dal pH, e il suo basso pKa e pronto assorbimento lisosomi rende un sensore di pH ideale21. cDCFDA intensità di colorazione è inversamente proporzionale al pH lisosomiale (cioè colorazione intensità aumenta con il diminuire del pH)18,22. cDCFDA segnali sono costantemente deboli nei lisosomi di animali trattati con clorochina, un inibitore dell'acidifica...

Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare una perdita relativa di acidità lisosomiale nei lisosomi intestinali di C.elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'autofagia fornendo indirettamente informazioni sulla funzione lisosomiale e sulla degradazione delle proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, economica, conveniente e riproducibile.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo osservato la tecnica di colorazione utilizzata per valutare l'alcalinizzazione vacuolare nel lievito. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché alcuni passaggi, come l'aggiunta di cDCFDA al cibo OP50 e il controllo dell'imaging di vermi selvatici di due giorni, sono fondamentali. Dopo aver preparato le piastre NGM, lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per due giorni con il coperchio chiuso.Quindi, inoculare i batteri OP50 nel brodo sterile di Luria. Dopo l'inoculazione, lasciare l'inoculante nell'incubatrice fino a quando l'OD è compreso tra 0,2 e 0,4. Quindi, posizionare una goccia dell'inoculante OP50 al centro della piastra NGM asciutta.Quindi, usa uno spargitore per distribuire l'inoculante in un cerotto di circa due centimetri per due. Circa dopo 15 minuti, capovolgere la piastra OP50 dopo che l'inoculante si è asciugato. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 36 ore.Una volta terminata l'incubazione, trasferire la piastra a quattro gradi Celsius fino all'uso. Quindi, preparare un working stock di cDCFDA da 10 millimolari in tampone M9. Conservare la soluzione cDCFDA al riparo dalla luce a meno 20 gradi Celsius.Quindi, pipettare 100 microlitri di cDCFDA da 10 millimolari per coprire uniformemente l'intero cerotto OP50 sulla piastra. Lasciare le piastre cDCFDA in una scatola scura sul piano di lavoro per circa 30 minuti. Dopo che il cDCFDA ha permeato completamente il cerotto OP50, trasferire 20 vermi sulla piastra, quindi lasciare la piastra in condizioni capovolte per circa 14 ore a 20 gradi Celsius.Quindi, prendi due strisce di nastri adesivi e posizionale a 1,5 pollici di distanza su una superficie a specchio liscia e piatta. Quindi, rivestire la superficie dello specchio con uno spray idrorepellente e rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, sciogliere il 2% di agarosio in acqua distillata nel microonde.Dopo che l'agarosio si è liquefatto, posizionare una goccia di agarosio tra le due strisce dei nastri e coprire la goccia con il vetrino da microscopio. Dopo che l'agarosio si è solidificato a forma di cuscinetto circolare sotto il vetrino, capovolgere il vetrino. Quindi, aggiungere da 10 a 15 microlitri di azoturo di sodio da cinque millimolari sul tampone di agarosio.Ora, trasferire i vermi dalla piastra integrata in cDCFDA a una piastra NGM pulita senza OP50. Lasciare che i vermi si muovano per alcuni secondi in modo che l'OP50 venga rimosso dalla loro superficie. Quindi, trasferire il verme sul cuscinetto di agarosio contenente cinque millimolari di sodio azide.Coprire rapidamente il tampone di agarosio con un vetrino coprioggetti. Successivamente, utilizza l'obiettivo con ingrandimento 60X e acquisisci immagini in un singolo piano dell'intestino da vermi selvatici e mutanti di due giorni. Quindi, apri ImageJ e fai clic sul file.Quindi, fare clic su Apri per aprire il file che deve essere quantificato. Dopo aver caricato l'immagine, utilizzare lo strumento di selezione di forma ovale per selezionare la regione di interesse. Quindi, fare clic su Analizza e infine su Misura per quantificare l'intensità della fluorescenza della regione di interesse.Per studiare l'attività funzionale lisosomiale, l'intensità di colorazione del cDCFDA viene quantificata utilizzando l'imaging confocale. In questa immagine, c'è una robusta intensità del segnale di fluorescenza cDCFDA nei lisosomi intestinali del secondo giorno di C.Elegans wild type. Ciò indica un lisosoma acido funzionalmente competente.Al contrario, l'intensità della fluorescenza è considerevolmente soppressa nei lisosomi intestinali dei vermi selvatici di ottavo giorno. Questo è in confronto ai lisosomi intestinali dei vermi del secondo giorno. Il risultato ha indicato la presenza di lisosoma alcalino funzionalmente incompetente nei vermi dell'ottavo giorno.È interessante notare che l'intensità della fluorescenza del cDCFDA è anche notevolmente ridotta sia nei vermi RNAi del secondo giorno che in quelli dell'ottavo giorno rispetto al verme wild type. Qui, il gene vha, che codifica per le subunità vacuolari dell'ATPasi nel rivestimento lisosomiale, è stato abbattuto nei vermi del secondo e dell'ottavo giorno. Una volta padroneggiato, l'intero regime di colorazione e microscopia può essere completato in meno di 18 ore, se eseguito correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di incubare i vermi nell'integratore cDCFDA nel cibo OP50 per almeno 14 ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la perdita di acidità lisosomiale nei lisosomi intestinali di C.elegans vivo.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Fonte: Le, T. A. N. , et al., Misurare gli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2019)Questo video mostra un saggio basato sulla fluorescenza per quantificare la permeabilità intestinale in C. elegans esposto a Pseudomonas aeruginosa. Rispetto ai controlli alimentati con Escherichia coli, i vermi trattati con patogeni mostrano una maggiore perdita di fluorofori nella cavità corporea, indicando danni alla barriera...

Valutazione della permeabilità intestinale in C. elegans dopo l'esposizione batterica

Questo video descrive un test colorimetrico per la misurazione del lattato nei lisati cellulari utilizzando l'enzima lattato deidrogenasi. Questo enzima converte il lattato in piruvato, insieme alla conversione del NAD in NADH che reagisce con i coloranti tetrazolio e fornisce un prodotto colorato che può essere misurato spettrofotometricamente per quantificare il lattato.

Saggio colorimetrico per la quantificazione del lattato nei campioni di prova

Descriviamo i metodi per studiare aspetti della amylopathies nel...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Per studiare la relazione tra omeostasi proteica, stress e invecchiamento, abbiamo monitorato i cambiamenti nel ripiegamento delle proteine seguendo la disfunzione proteica, la localizzazione delle proteine nella cellula e la stabilità delle proteine a livello di organismo, cellulare e proteico, utilizzando il metazoo geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans come sistema modello.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans come sistema modello per studiare l'omeostasi proteica in un organismo multicellulare

Il trasparente c. elegans intestino può servire come una"nel vivo del tessuto camera" per lo studio della biogenesi di membrana e lume di apicobasal a livello di singola cellula e subcellulare durante tubulogenesis multicellulari. Questo protocollo viene descritto come combinare etichettatura standard, perdita di funzione genetica/RNAi e approcci al microscopio dissezionare questi processi a livello molecolare.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Il canale escretore di c. elegans è un modello unico di singola cellula per l'analisi visiva in vivo della biogenesi della membrana de novo polarizzato. Questo protocollo descrive una combinazione di standard genetico/RNAi e approcci, adattabili per l'identificazione e la caratterizzazione di molecole dirigere tubulogenesis unicellulari e biogenesi lumen e membrana apicale di imaging.

Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive come misurare la permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. Questo metodo è utile per la ricerca biologica di base sulla salute intestinale relativa all'interazione tra i batteri intestinali e il loro ospite e per lo screening per identificare gli agenti probiotici e chimici per curare la sindrome dell'intestino che perde e le malattie infiammatorie intestinali.

Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans

Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.

Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) consente l'imaging selettivo e privo di etichette di specifiche moieties chimiche ed è stata efficacemente utilizzata per l'immagine di molecole lipidiche in vivo. Qui, forniamo una breve introduzione al principio della microscopia SRS e descriviamo i metodi per il suo uso nella conservazione lipidica di imaging in Caenorhabditis elegans.

Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

L'insegnamento delle scienze biologiche può essere reso più stimolante per gli studenti attraverso l'uso della sperimentazione. Questo manoscritto presenta due protocolli diversi ma complementari che possono essere utilizzati in classe per incoraggiare gli studenti a formulare e testare ipotesi relative alle diete ipercaloriche, alla fame e all'invecchiamento.

Utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare l'accumulo di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans

Scopri come valutare la perdita di acidità lisosomica nell'intestino di Caenorhabditis elegans usando il colorante cDCFDA. Questo metodo semplice e riproducibile aiuta a studiare l'autofagia e la funzione lisosomica.

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

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