Name: Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Scopri l'analisi della mineralizzazione ossea mediante microscopia elettronica a trasmissione e microanalisi EDX su cellule umane hFOB 1.19 e Saos-2. Questo metodo avanzato permette di studiare la nucleazione dei minerali a livello cellulare.

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MK e ASK eseguite operazioni manuali e LB preparato disegni e ha realizzato il film. ASK ha scritto il manoscritto, LB ha scritto la sceneggiatura e MK preparato il tavolo. SM, RB e SP leggere criticamente la tabella, la sceneggiatura e il manoscritto. Gli autori vorrei ringraziare Hanna Chomontowska per la sua eccellente assistenza con ultramicrotomia nonché Szymon Suski e Henryk Bilski per la loro eccellente assistenza con analisi TEM-EDX. Gli autori vorrei ringraziare dr Patrick Boschetti per correzione di lingua inglese professionale e Barbara Sobiak per le istruzioni di registrazione.
Questo lavoro è stato supportato da grant N N401 140639 del ministero polacco della scienza e dell'istruzione superiore per ASK, da sovvenzioni dal National Science Centre, Polonia 2016/23/N/NZ4/03313 LB e 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 progetto BIOIMAGINE : BIO-IMAGing in ricerca innovazione e formazione, GA n. 264173 e dai fondi statutari dell'Istituto Nencki di biologia sperimentale, Accademia polacca delle scienze.

1. cultura e trattamento delle cellule
<ol><li>Mettere tutti i materiali necessari sotto la cappa a flusso laminare e sterilizzarli sotto luce UV. Terreni di coltura sono: una miscela 1:1 di prosciutto di media F12 e DMEM con 2,5 mM L-Glutammina completati con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% siero bovino fetale (FBS) (v/v) per feto umano hFOB 1.19 grande T antigene SV40 transfettate osteoblasti e medio 5A di McCoy con 1,5 mM L-Glutammina completato con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina e 15% FBS (v/v) per le cellule di osteosarcoma umano Saos-2.</li>
	<li>Coltura di cellule hFOB 1.19 a 34 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 e cellule Saos-2 a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2. Trasferimento di colture cellulari, entrambi hFOB 1.19 o Saos-2 cellule, dall'incubatrice per la cappa a flusso laminare e cambiare il mezzo a 10 mL di terreno di coltura fresco con FBS.</li>
	<li>Incubare le cellule senza stimolatori (cellule quiescenti) o stimolarli con 50 µ g/mL di acido ascorbico (AA) seguita da 7,5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparato in precedenza in acqua ultrapura e filtrata attraverso filtri per siringa 0,22 µm. Aggiungere gli stimolatori da microcentrifuga plastica sulla superficie del terreno di coltura. Delicatamente mescolare il piatto di cultura e incubare per 7 giorni.</li>
</ol>2. rilevazione di minerali di calcio
<ol><li>Lavare le colture cellulari con tampone fosfato salino (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1mm KH2PO4, pH 7.0).</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di 2% (g:100 mL) AR-S in PBS, pH 5.0 e incubare le piastre per 30 min a macchiare i minerali.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS. Con attenzione aggiungere PBS al muro piatto, cercare di non distruggere i minerali.</li>
	<li>Osservare i minerali di calcio sotto un microscopio ottico invertito e prendere le immagini.</li>
</ol>3. visualizzazione delle sonde ai raggi UV.
<ol><li>Per lisati cellulari, colture cellulari, sia a riposo o stimolato per 7 giorni, un trattamento secondo il protocollo di digestione della collagenosi24.</li>
	<li>Raccogliere il mezzo dalle colture delle cellule e lavare le cellule con PBS.</li>
	<li>Digerire le cellule con 3 mL di collagenasi di U/mL 500 in una soluzione di 0,25 M saccarosio, 0,12 M di NaCl, KCl e buffer di 0,02 M Tris-HCl, pH 0,01 M 7,45, a 37 ° C per 3 h.</li>
	<li>Meccanicamente raschiare le cellule, trasferirli in plastica per microcentrifuga e farli passare 10 volte attraverso una siringa di U mL 40 1 con 0,5 × 16 ago.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 500 × g per 5 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di linfa sintetica di cartilagine (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosio, saccarosio 63mm, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).</li>
	<li>Trasferire l'idrossiapatite (HA), fluorapatite (FA) e chlorapatite (CA) polveri dalle bottiglie sul transilluminatore UV con una spatola e utilizzare come controlli.</li>
	<li>Trasferire i lisati cellulari dai tubi in plastica con punte di plastica e inserire con attenzione il transilluminatore UV.</li>
	<li>Prendere immagini sotto visibile e UV luce.</li>
</ol>4. preparazione delle sonde per TEM-EDX
<ol><li>Preparazione di minerali per la macchiatura negativa<ol>
<li>Sospendere 2,5 mg di prodotto sinteticamente HA, CA e FA di minerali25 in 500 µ l di acqua deionizzata e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 per 1 h.</li>
		<li>Prendete griglie Formvar/carbonio 300 Mesh Ni dal box con una pinza antistatica, posto su un piatto di porcellana multi-pozzetto e rilasciare 10 µ l di sospensioni HA, CA e FA le griglie.</li>
		<li>Asciugare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di riposo e hanno stimolato le cellule per l'incorporamento di 26<ol>
<li>Raccogliere medio da colture cellulari e lavare le cellule con il mezzo di desensibilizzazione fisiologico (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10mm NaHCO3, 1mm KH2PO4, glucosio di 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7.4).</li>
		<li>Fissare le cellule con 5 mL di una miscela di glutaraldeide di 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,2 per 1 h a temperatura ambiente sotto la cappa.</li>
		<li>Lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato di sodio 100 mM e rimuovere delicatamente il buffer dopo il lavaggio.</li>
		<li>In camera oscura, postfix i campioni con 2 mL di 1% tetrossido di osmio (g:100 mL) in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,2, per 20 min a temperatura ambiente sotto la cappa.</li>
		<li>Rimuovere il tetrossido di osmio e utilizzarlo.</li>
		<li>Lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato di sodio 100 mM.</li>
		<li>Quindi, disidratare i campioni in aliquote di 5 mL di una serie di soluzione di etanolo graduato a temperatura ambiente: 25% (vol.) per 5 min, 50% (vol.) per 10 min, 75% (vol.) per 15 min, 90% (in volume) per 20 min. Infine utilizzare etanolo assoluto due volte e incubare per 30 minuti e 12 ore.</li>
		<li>Meccanicamente raschiare le cellule dai piatti di cultura Petri in plastica, raccogliere in plastica per microcentrifuga e centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.</li>
		<li>Togliere i surnatanti e sospendere le cellule in 1 mL di una miscela di resina bianca di LR ed etanolo assoluto a un rapporto di volume di 1:2.</li>
		<li>Mescolare bene il contenuto delle provette di vetro prima dell'uso ed incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere i surnatanti e ripetere il passaggio precedente con 1 mL di una miscela 1:1 di resina bianca di LR ed etanolo assoluto.</li>
		<li>Mescolare bene e incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere i sovranatante.</li>
		<li>Infine, aggiungere 1 mL di resina pura LR White ai campioni due volte e incubare per 1 h a temperatura ambiente in tubi di plastica.</li>
		<li>Posto 500 µ l di ciascun campione in capsule di gelatina. Nota: I campioni sono etichettati utilizzando un piccolo foglio di carta e una matita in modo che la resina non distrugge le etichette.</li>
		<li>Chiudere le capsule di gelatina, metterle in plastica per microcentrifuga e centrifugare a 130 x g per 1 min in un rotore.</li>
		<li>Rimuovere le capsule dai tubi plastica utilizzando una pompa a vuoto.</li>
		<li>Spostare i campioni al forno e polimerizzare a 56 ° C per 48 h.</li>
		<li>Preparare i blocchi di montarli nel supporto e li taglio alla piramide.</li>
		<li>Inserire il titolare l'ultramicrotomo, allegare il coltello di diamante Ultra 45° e riempirlo con acqua deionizzata; Ricordarsi di pulire la lama da bolle d'aria accidentale.</li>
		<li>Quindi tagliare sezioni (700 Å) utilizzando il coltello di diamante sul bagno di acqua deionizzata.</li>
		<li>Impostare gli scarti utilizzando bovina ciglia e posto che loro sul lato lucido del Formvar/carbonio 300 mesh Ni griglia e farle asciugare.</li>
		<li>Preparare il 2,5% (vol.) acetato di uranile in etanolo assoluto al buio sotto una cappa aspirante. Mantenere l'acetato di uranile in un contenitore di piombo e ricordate di non raccogliere il sedimento.</li>
		<li>In camera oscura, colorante di contrasto le griglie di apatiti sintetici e campioni di cellule con acetato di uranile 2.5% (vol.) in etanolo per 20 min a temperatura ambiente sotto la cappa.</li>
		<li>Lavare le griglie in etanolo al 50% (da Vol.), poi in acqua deionizzata e asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Infine, mettere le griglie nella casella.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. TEM-EDX Analysis
<ol><li>Formazione immagine TEM di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) attrezzata con microanalisi a raggi x dispersiva di energia di gamma completa (EDX) sistema e 11 Megapixel fotocamera<ol>
<li>Preparare un titolare di berillio per l'osservazione dei minerali e delle cellule. Utilizzare strumenti di antistatici.</li>
		<li>Rimuovere la coppia di viti e sollevare il piatto di berillio e rondella di berillio lontano dal resto del fermo.</li>
		<li>Montare la griglia, il lato lucido, sul supporto.</li>
		<li>Posizionare la rondella di berillio e la piastra di berillio e riavvitare le viti di fissaggio.</li>
		<li>Mettere la porta nella camera del vuoto e accendere la pompa del vuoto.</li>
		<li>Una volta raggiunto il vuoto, delicatamente inserire il supporto della camera di imaging e girare sulla trave.</li>
		<li>Sul monitor fluorescente, impostare i parametri di apertura del microscopio. Eseguire la correzione di astigmatismo di immagine; impostare lo zoom, messa a fuoco e telaio; e prendere le immagini TEM ad un ingrandimento di 50, 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging e microanalisi a raggi x per analisi spettrale e compositiva del gambo<ol>
<li>Inserire il rilevatore di raggi x (EDX) dispersiva di energia nella trasmissione scansione microscopia elettronica (STEM) imaging camera.</li>
		<li>Regolare la nitidezza dell'immagine in modalità messa a fuoco.</li>
		<li>Prendere immagini di staminali a un ingrandimento di 15, 000 X.</li>
		<li>Selezionare un punto nell'esempio per microanalisi a raggi x e raccogliere gli spettri.</li>
		<li>Ottenere dati sommando tutti i pesi atomici per tutti gli elementi della tavola periodica nel campione (come 100%) e che significa il contenuto degli elementi selezionati: Ca, F, Cl e P (come % atomica). Quindi, calcolare i rapporti di Ca, F o Cl a P per ogni campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mappatura dello ione<ol>
<li>Selezionare elementi quali calcio, fluoro, cloro e fosforo per rendere agli ioni mapping ed eseguire mappe EDX degli elementi selezionati nei campioni.</li>
		<li>Per ottenere dati che indica la localizzazione di elementi analizzati: Ca, F, Cl e P (come % atomica) e calcolare la co-localizzazione (in %) di Ca, F o Cl con P per ogni campione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Nella carta attuale, abbiamo descritto i protocolli per la macchiatura, identificazione di luce UV di fluoroapatite AR-S e TEM-EDX in vitro la formazione immagine di MVs rilasciato da mineralizzante di cellule e di minerali prodotto da MVs. È possibile indirizzare tutti i metodi sopra indicati di seguito alcuni passaggi di risoluzione dei problemi comuni. Per ottenere risultati ottimali, diversi passaggi critici devono essere eseguite con attenzione. In primo luogo, è meglio aggiungere AA (che è acido) ...

L'osso è un tipo di tessuto connettivo composto da due parti: organici (cellule e fibre collagene) e minerali (composti di calcio e fosfato). I componenti principali di minerali nelle ossa sono apatiti1. Diversi tipi di cellule competenti di mineralizzazione in osso (osteoblasti), nei denti (odontoblasti) e nella cartilagine (condrociti) regolano i passi iniziali di mineralizzazione di produrre proteine della matrice extracellulare (ECM) e rilasciare la matrice vescicole (MVs) (Figura 1). MVs sono 100-300 nm diametro vescicole che si accumulano di calcio e fosfato facilitando la nucleazione apatite e successivamente associare al collagene2,3. Quindi, MVs disintegrarsi per rilasciare apatiti al medium extracellulare. Le apatiti continuano a crescere a contatto con le fibre di collagene e formano la matrice dell'osso. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di Pio e Ca2 + nel mezzo extracellulare. Alcuni dati recentemente pubblicati supportano il nostro modello4,5. Tessuti molli non mineralizzare in condizioni fisiologiche. Tuttavia, la calcificazione ectopica può verificarsi in condizioni patologiche come calcificazione vascolare3. Le cellule vascolari che acquisiscono il fenotipo degli osteoblasti in grado di produrre MVs che inducono la nucleazione di apatiti e avviare mineralizzazione negli strati della parete mediale e intimale dei vasi sanguigni. Dal calcificazione ectopica assomigliano endochondral normale mineralizzazione3, comprendere i meccanismi molecolari della mineralizzazione delle cellule ossee e condrociti dovrebbero fornire alcuni indizi sulla calcificazione ectopica dei tessuti molli che sono formato.
Lo sviluppo di tessuti scheletrici è regolato da vari enzimi, fattori di crescita e promotori o inibitori della mineralizzazione. L'azione antagonistica di tessuto-non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) (Figura 1) ed ectonucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi ho (NPP1), insieme a ankyrin (ANK), controlla concentrazione pirofosfato inorganico (PPho) 6. PPho, un potente inibitore della formazione HA, è idrolizzato di TNAP; NPP1 idrolizza i trifosfati del nucleotide per formare PPho mentre ANK PPho Esporta dalla cella alla ECM. Il rapporto di Pi/PPi può disciplinare l'apatite formazione7,8 con possibili conseguenze patologiche9.
La membrana di MV è arricchita in proteine di trasporto dello ione che facilitano la precipitazione iniziale di calcio e fosfato all'interno la MVs durante il processo di nucleazione (Figura 1). Il trasportatore del fosfato 1 (PiT) consente di incorporare Pho generato nello spazio perivesicular nel MVs10,11. Annexins possono essere coinvolti nell'associazione e nel trasporto di Ca2 + e nel processo biofisico che avvia la mineralizzazione del MV lumen12,13. Favoriamo l'ipotesi, suggerito in precedenza, per mineralizzazione all'interno di vescicole intracitoplasmatiche di nucleazione interno di apatite dentro la MV prima della sua propagazione nell'ECM14,15. Modellazione in vitro hanno confermato l'induzione di Ca2 +/ pho complessi formazione nei proteoliposomi effettuata in PS e AnxA516. Ciò potrebbe indicare che accumulo di Ca2 +, Pho, complessi AnxA5 e PS in "lipid rafts" di membranesrepresent i microvilli-come il nucleo di nucleazione (NC) di apatite all'interno Mvs Annexins e TNAP possiedono anche collagene-associazione capacità che possono essere utili nel mettere MVs lungo le fibre di collagene e, nello stimolare la propagazione di mineralizzazione in ECM. Fetuina A e osteopontina (OPN)17, sono noti come inibitori della formazione di apatite che possono rallentare la propagazione della mineralizzazione sul patibolo collageno. Nucleazione e propagazione sono eventi distinti, il primo precede quest'ultimo, ed entrambi possono essere rilevanti per il processo di mineralizzazione patologico.
Per scoprire come la chimica dei complessi di fosfato di calcio può cambiare fisiologico mineralizzazione e calcificazione ectopica, è necessario identificare i minerali prodotti dalle cellule. Apatiti sono un gruppo di calcio e fosfato contenente minerali con cristallo generale unità cella formula Ca10(PO4) di6X2, dove X = Cl, F, OH. Essi sono classificati come segue18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 e idrossiapatite (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
La scelta di linee cellulari di osteoblasti per indurre la formazione di minerali è fondamentale, poiché ogni linea cellulare esibisce un profilo distinto di mineralizzazione. In questo rapporto, abbiamo confrontato la nucleazione dei minerali da due modelli di cella selezionata umana di mineralizzazione: cellule osteoblastic hFOB 1.19 e cellule di osteosarcoma Saos-2. Cellule derivate da osteosarcoma sono comunemente usate come modelli osteoblastiche e cellule Saos-2 hanno conservato il carattere osteoblastic più maturo19 mentre le cellule indifferenziate hFOB fetale umano sono ampiamente usate come un modello per il normale osteoblastic differenziazione20. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati con metodi diversi: Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletta visualizzazione luce (UV), formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione, quantificazione di energia dispersiva x-ray microanalisi (EDX) e dello ione mappatura. Il vantaggio di TEM-EDX su tecniche alternative utilizzate negli studi precedenti è che dà risultati quantitativi e qualitativi della sostituzione dello ione in cristalli di apatite4,5,21. L'obiettivo generale dell'utilizzo di TEM-EDX era di trovare un metodo semplice per l'imaging e quantificazione della distribuzione degli ioni Ca, F e Cl in vari minerali da diversi tipi di cellule durante fasi distinte del processo di mineralizzazione. Questo metodo è stato utilizzato con successo, ad esempio, per monitorare l'interazione delle nanoparticelle di zinco con i prodotti chimici coesistenti e loro effetti combinati su organismi acquatici22. In un altro studio, un photocatalyst rame su materiali di titanio in soluzione acquosa è stato ampiamente caratterizzato mediante spettrometria ad emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman spettroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical misure23. Il nostro obiettivo era di confrontare l'origine e la proprietà di vescicole e minerali in due linee cellulari per comprendere il meccanismo che controlla la mineralizzazione durante la differenziazione ossea.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Figura 1 . Schema delle fasi iniziali di mineralizzazione in cellule ossee che coinvolge la sintesi di proteine della matrice extracellulare (ECM) ed il rilascio delle vescicole della matrice (MVs) dalla membrana. MVs accumulare calcio attraverso l'azione di proteine leganti il calcio, annexins e fosfato, attraverso l'azione di un trasportatore di fosfato inorganico (PiT) seguita dall'attività del tessuto non specifico della fosfatasi alcalina (TNAP), che defosforila PPio Pho, quindi facilitante la nucleazione apatite. Quindi, MVs si disintegrano e rilasciare apatiti al medium extracellulare. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di Pio e Ca2 + in extracellulare media4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ham" s Miscela di terreni DMEM/F12</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, per osteoblasti trasfettati con antigene T di grandi dimensioni hFOB 1.19 SV40 (ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A medium</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>per osteosarcoma umano Saos-2 cellule (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>Miscela di antibiotici (penicillina/streptomicina)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U/mL ciascuno</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% per hFOB 1,19 e 15% per Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 &; g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7.5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>per HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>sintetizzato da noi</td></tr><tr><td>CA</td><td>sintetizzato da noi Tampone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato di sodio Na2HPO4/NaH2PO4 miscela</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7,0, preparato da noi</td></tr><tr><td>AR-S in PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0,5 g/100 mL, pH 5,0</td></tr><tr><td>Collagenasi tipo IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL tampone</td><td></td><td></td><td>preparato da noi</td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> deionizzata <td>prodotta da noi</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>assoluta 99,8% e soluzioni 25, 50, 75, 90%</td></tr> <tr><td>acetato di uranile in etanolo al 50%</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0,25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD medium</td><td></td><td></td><td>pH 7,4, preparato da noi</td></tr><tr><td>Miscela di fissazione (paraformaldeide/glutaraldeide)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>Post-fissazione OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR Resina bianca in etanolo</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr> <tr><td>Acetone</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>puro</td></tr><tr><td><forte>Strumento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1,2 mL</td></tr><tr><td>Piastre per coltura Petri</td><td>in plastica Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Provette in plastica</td><td>Falcon</td><td>352096 e 352070</td> Pipette sierologiche da <td>15 e 50 mL</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>e VWR</td><td>357521 e 612-3700</td><td>1 e 10 mL</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga in plastica</td><td>Sigma</td><td>Z688312 e Z628034</td><td>1,5 mL nere e 2 mL trasparenti</td></tr><tr><td>Puntali in plastica</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 e 613-1050</td><td>0,1-10 &micro; L naturale, 1-200 &micro; L giallo e 200-1000 &micro; L blu</td></tr><tr><td>Rack in plastica Light</td><td>Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>verde per provette, arancione per microprovette e blu per sonde TEM</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td>Filtro HEPA <td>KS12</td><td>(H14 secondo DIN EN 1822)</td></tr><tr><td>Incubatori Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34 gradi C per hFOB 1,19 e 37 gradi C per Saos-2</td></tr><tr><td>Cappa aspirante</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>per colorazioni TEM Bottiglie</td></tr><tr><td>di vetro</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 e 1632414501100</td><td>50 e 100 mL</td></tr><tr><td>Provette di vetro al quarzo</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE comfort</td><td>per vuoto</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg; C</td></tr><tr><td>Piastra multipozzetto in porcellana</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 pozzetti Becher</td></tr><tr>in<td>vetro</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Bottiglie di vetro</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Scatola di plastica</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>per l'oscurità</td></tr><tr><td>Capsule di gelatina Snap Fit</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>misura 1</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 Mesh Ni griglie in scatola</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>Pellicola S162N3</td><td>sul lato lucido</td></tr><tr><td>Raschietto per celle di silicio</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>misura 1,8/25 cm</td></tr><tr><td>Siringa con ago Siringa</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>1 mL 40 U, ago 0,5 x 16</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>MPW Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g e 500 x g</td></tr><tr><td>Transluminatore UV</td><td>UVP</td><td>M-20</td><td>per luce visibile e UV</td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; sezioni</td></tr><tr><td>Portablocco</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>forma rotonda</td></tr><tr><td>Coltello diamantato</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>Taglia 3</td></tr><tr><td>Porta</td><td></td><td></td> ciglia <td>bovino, preparato da noi</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>antistatico per griglie Set di</td></tr><tr><td>spatole</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>antistatico per polveri</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a luce invertita</td><td>Zeiss con Canon</td><td>AxioObserver Z1 dotato di PowerShot G9</td><td>Contrasto di fase, luce trasmessa, obiettivo 20x, filtri RGB</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>TEM Jeol Co. con Oxford Instruments e SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM dotato di sistema di microanalisi a raggi X a dispersione di energia INCA (EDX) a gamma completa e ingrandimento della fotocamera MORADA G2 da 11 Megapixel</td><td>50.000X per TEM e 15.000X per STEM e EDX</td></tr><tr><td>Corpo macchina e obiettivi</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>per registrazioni di filmati</td></tr><tr><td>Microfono</td><td>MXL Mics</td><td>Tempo</td><td>per registrazioni vocali</td></tr></tbody></table>

analisi di minerali prodotto da hfob 1.19 e saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Questo video presenta l'uso di microscopia elettronica di trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia (TEM-EDX) di confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. Queste linee cellulari, dopo il trattamento con acido ascorbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), subiscono transdifferenziazione osteogenica completa dalla proliferazione di mineralizzazione e produrre vescicole di matrice (MVs) che attivano la nucleazione apatite nella matrice extracellulare (ECM).
Basato su Alizarin Red-S (AR-S) colorazione e analisi della composizione dei minerali in lisati cellulari utilizzando la luce ultravioletta (UV) o in vescicole usando la formazione immagine TEM seguita da EDX quantificazione e mappatura dello ione, possiamo dedurre che osteosarcoma Saos-2 e osteoblastica le cellule hFOB 1.19 rivelano profili distinti di mineralizzazione. Cellule Saos-2 mineralizzano in modo più efficiente rispetto alle cellule hFOB 1.19 e producono più grandi depositi di minerali che non sono visibili ai raggi UV, ma sono simili a idrossiapatite (HA) in quanto hanno le sostituzioni più Ca e F.
I risultati ottenuti con queste tecniche ci permettono di concludere che il processo di mineralizzazione è diverso a seconda del tipo di cella. Proponiamo che, a livello cellulare, l'origine e la proprietà delle vescicole predeterminare il tipo di minerali.

TEM-EDX consente per l'imaging in vitro delle vescicole di matrice (MVs) rilasciate da mineralizzante di cellule e di minerali prodotti da Mvs i risultati ottenuti con questa tecnica dimostrano che il processo di mineralizzazione può procedere in modo diverso in vari tipi di cellule. Le linee due cellulari ricevuto lo stesso trattamento di transdifferenziazione osteoblastica, ancora stimolato le cellule Saos-2 in modo più efficiente rispetto hFOB mineralizzata 1,19 osteo...

Vi presentiamo un protocollo per confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati da Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletto (UV) luce visualizzazione, formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione e microanalisi a raggi x dispersiva di energia (EDX).

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Durante le fasi iniziali della mineralizzazione, le cellule producono proteine della matrice extracellulare e rilasciano vescicole della matrice che accumulano calcio e fosfato per facilitare la nucleazione dell'apatite. In questo rapporto, confrontiamo la nucleazione dei minerali da parte di due modelli cellulari umani selezionati, le cellule osteoblastiche hFOB 1.19 e le cellule osteosarcoma Saos-2. I loro profili di mineralizzazione sono stati analizzati con metodi diversi.Metti tutti i materiali sotto il laminare e sterilizzali sotto la luce UV. Cambiare il terreno a 10 millilitri di terreno di coltura fresco con siero fetale bovino. Le cellule a riposo vengono incubate senza stimolatori, mentre le cellule stimolate vengono trattate sia con acido ascorbico che con beta-glicerofosfato.Innanzitutto, far cadere delicatamente l'acido ascorbico alla concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro sulla superficie del terreno di coltura per stimolare le cellule. Successivamente, aggiungere il beta-glicerofosfato alla concentrazione finale di 7,5 millimolari in terreno di coltura per stimolare le cellule. Mescola delicatamente il piatto di coltura e mettilo nell'incubatrice per sette giorni.Dopo sette giorni di incubazione, lavare le colture cellulari con soluzione salina tamponata con fosfato, PBS. Aggiungere cinque millilitri di rosso alizarina al 2% e incubare la piastra per 30 minuti per colorare i minerali. Lavare tre volte con PBS.Aggiungi con cura PBS alla parete del piatto. Cerca di non distruggere i minerali. Osservare i minerali al microscopio ottico invertito.Raccogliere il terreno dalle colture cellulari e lavare le cellule con PBS. Digerire le cellule a riposo o stimolate per sette giorni con una soluzione di collagenasi da 500 unità per millilitro a 37 gradi per tre ore. Quindi, raschiare meccanicamente le cellule.Trasferirli in provette da microcentrifuga di plastica. Passarli attraverso una siringa 10 volte. Centrifugare i campioni a 500 g per cinque minuti.Scartare il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di linfa cartilaginea sintetica. Trasferire le polveri di idrossiapatite, fluorapatite e clorapatite dai flaconi sul transilluminatore UV con spatola e utilizzarle come controlli. Trasferire i lisati cellulari dalle provette di plastica con punte di plastica e posizionarli con cura sul transilluminatore UV.Sospendi 2,5 milligrammi di polveri di idrossiapatite, fluorapatite e clorapatite in 500 microlitri di acqua deionizzata. Incubare a 37 gradi per un'ora. Prendi le griglie Formvar/nichel di carbonio dalla scatola con una pinza antistatica e posizionale su una piastra multipozzetto in porcellana.Far cadere 10 microlitri della sospensione di idrossiapatite sulle griglie. Fai lo stesso per la clorapatite e la fluorapatite. Asciugare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente.Preparare le cellule a riposo e stimolate per l'inclusione. Raccogliere il terreno dalle colture cellulari. Lavare le cellule in terreno di desensibilizzazione fisiologico.Fissare le celle con cinque millilitri di una miscela di 3% di paraformaldeide e 1% di glutaraldeide in un tampone di fosfato di sodio da 100 millimolari per un'ora a temperatura ambiente sotto la cappa aspirante. Lavare le cellule con cinque millilitri di tampone fosfato di sodio da 100 millimolari. Rimuovere delicatamente il tampone dopo il lavaggio.Nella camera oscura, postfissare i campioni con due millilitri di tetrossido di osmio all'1% in tampone fosfato di sodio da 100 millimolari. Incubare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente sotto la cappa aspirante. Rimuovi il tetrossido di osmio e utilizzalo.Lavare le cellule con cinque millilitri di tampone fosfato di sodio da 100 millimolari. Quindi, disidratare i campioni in aliquote da cinque millilitri di una serie di soluzioni di etanolo graduate a temperatura ambiente, etanolo al 25, 50, 75 e 90%. Infine, utilizzare due volte l'etanolo assoluto e incubare per 30 minuti e 12 ore.Raschiare meccanicamente le cellule dai piatti di coltura. Raccogliere le cellule in provette da microcentrifuga di plastica. Centrifugare i campioni a 130 g per un minuto.Rimuovere i surnatanti. Sospendi le celle in una miscela di resina LR White ed etanolo assoluto con un rapporto di volume di uno a due. Mescolare bene e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Centrifugare i campioni a 130 g per un minuto. Rimuovere i surnatanti. Ripetere il passaggio precedente utilizzando una miscela uno a uno di resina LR White ed etanolo assoluto.Mescolare bene e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 130 g per un minuto. Rimuovere i surnatanti.Aggiungere la resina bianca LR pura ai campioni e incubare per un'ora a temperatura ambiente in provette di plastica. Centrifugare i campioni a 130 g per un minuto. Rimuovere i surnatanti.Aggiungere nuovamente la resina bianca LR pura. Mettere 500 microlitri di ogni campione in capsule di gelatina. Si noti che i campioni vengono etichettati utilizzando un piccolo foglio di carta e una matita in modo che la resina non distrugga le etichette.Chiudere le capsule di gelatina. Mettere le capsule in provette di plastica per microcentrifuga. Centrifugare a 130 g per un minuto in un rotore oscillante.Rimuovere le capsule dai tubi di plastica utilizzando una pompa a vuoto. Spostare i campioni nel forno e polimerizzare a 56 gradi per 48 ore. Preparare i blocchi montandoli nel supporto.Inserire il supporto nell'ultramicrotomo. Attacca il coltello diamantato. Riempilo con acqua deionizzata.Ricorda, pulisci la lama dalle bolle d'aria accidentali. Quindi, tagliare le sezioni utilizzando un coltello diamantato sul bagno d'acqua deionizzato. Fissare gli scarti utilizzando le ciglia bovine.Quindi, posizionali sul lato lucido della griglia Formvar/nichel di carbonio e asciugali. Nella camera oscura, controcolorare le griglie di apatiti sintetiche e i campioni cellulari con il 2,5% di acetato di uranile in etanolo per 20 minuti a temperatura ambiente sotto cappa aspirante. Lavare le griglie in etanolo al 50%, poi in acqua deionizzata e asciugarle a temperatura ambiente per 24 ore.Infine, metti le griglie nella scatola. Preparare il supporto in berillio per l'osservazione di minerali e cellule. Utilizzare strumenti antistatici.Rimuovere la coppia di viti. Sollevare la piastra in berillio e la rondella in berillio dal resto del fermo. Montare la griglia, con il lato lucido rivolto verso l'alto, sul supporto.Posizionare con cura la rondella al berillio e la piastra al berillio. Avvitare saldamente le viti di fissaggio. Inserire il supporto nella camera del vuoto e accendere la pompa del vuoto.Una volta raggiunto il vuoto, inserire delicatamente il supporto nella camera di imaging e accendere il raggio. Sul monitor fluorescente, impostare i parametri di apertura del microscopio. Esegui la correzione dell'astigmatismo dell'immagine.Imposta lo zoom, la messa a fuoco, l'inquadratura e scatta un'immagine al microscopio elettronico a trasmissione. Spostare il rivelatore nella camera di imaging. Regolare la nitidezza dell'immagine nella modalità di messa a fuoco.Selezionare un punto nel campione per la microanalisi a raggi X e raccogliere gli spettri. Seleziona elementi come calcio, fluoro, cloro e fosforo per eseguire la mappatura ionica ed eseguire mappe degli elementi selezionati. Le cellule di Saos stimolate mineralizzano in modo più efficiente rispetto agli osteoblasti hFOX.Solo le fluorapatiti possono essere osservate sotto eccitazione alla luce UV. I lisati cellulari HFOB erano più fluorescenti di Saos, suggerendo che le fluorapatiti sono più abbondanti in queste cellule. Le cellule Saos stimolate producono più vescicole contenenti minerali rispetto alle cellule hFOB e alle cellule Saos a riposo.Le apatiti sintetiche avevano diverse forme minerali. La procedura applicata sopra ha mostrato la presenza di vescicole nelle cellule hFOB e Saos in condizioni di riposo e stimolazione. I punti rossi indicano le distribuzioni di calcio, fosforo verde e fluoro blu.In condizioni stimolate, c'era una forte sovrapposizione tra le distribuzioni di calcio e fosforo nelle vescicole prodotte dalle cellule Saos e tra fluoro e fosforo nelle vescicole prodotte dalle cellule hFOB. In conclusione, i nostri risultati indicano che le vescicole sono determinanti chiave della nucleazione minerale, soprattutto a livello cellulare. Il confronto tra le vescicole rilasciate dalle cellule Saos-2, che mineralizzano in modo più efficiente, e le vescicole rilasciate dalle cellule hFOB 1.19 supportano l'ipotesi che le vescicole della matrice siano vescicole piene di minerali.Ciò lascia aperta la questione se la presenza di vescicole di matrice sia necessaria per indurre la nucleazione dell'apatite e come ciò possa alterare la mineralizzazione fisiologica o patologica.

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