Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare neuroni, macrofagi e microglia dal cervello larvale di zebrafish ed estrarre RNA di alta qualità per eseguire analisi a valle come la qPCR e la trascrittomica. Le larve transgeniche di pesce zebra sono un potente strumento per l'imaging dal vivo e ci offrono l'opportunità di osservare singole cellule come le microglia nel loro ambiente di vita nel tempo. Tuttavia, per ottenere una comprensione dettagliata delle loro funzioni dobbiamo comprendere il loro profilo di espressione genica e il nostro protocollo di isolamento e smistamento è progettato per questo scopo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può isolare diversi tipi di cellule dal sistema nervoso centrale con modifiche minime al loro profilo di espressione genica, in modo che le funzioni e le proprietà cellulari possano essere caratterizzate. L'efficienza di questo protocollo si riflette nella sua efficacia. Con questo protocollo, è possibile produrre quantità sufficienti di RNA in brevi periodi di tempo per varie applicazioni a valle.

Dopo aver allevato embrioni di zebrafish in terreno E3 contenente PTU secondo il protocollo di testo, utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente per esaminare le larve a due dpf per macrofagi e microglia GFP-positivi nei neuroni DsRED-positivi. Per omogeneizzare gli embrioni in un punto cinque ml di tricaina 15 millimolare per 50 ml di terreno a 50 larve per preparare l'anestesia. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur da tre ml per trasferire 10 larve alla volta in una capsula di Petri da 55 ml riempita con terreno E3 ghiacciato con tricaina per anestetizzarle terminalmente.

Sotto uno steromicroscopio, allineare 10 larve al centro della capsula di Petri, quindi utilizzando micro-forbici chirurgiche sezionare le teste larvali sopra il sacco vitellino. Con una pipetta Pasteur da tre ml, prelevare tutte le teste e con meno liquido possibile, trasferirle in un omogeneizzatore di vetro su ghiaccio contenente un ml di terreno ghiacciato A.Sostituire ogni piccola capsula di Petri contenente ghiaccio E3 più tricaina con una nuova ogni 30 minuti per assicurarsi che la transezione venga eseguita in E3 freddo più tricaina media. Sostituisci il supporto A ghiacciato nell'omogeneizzatore di vetro quando il colore inizia a sbiadire.

Una volta raccolto l'intero gruppo di testine, rimuovere tutto il Media A dall'omogeneizzatore di vetro e sostituirlo con un ml di Media A ghiacciato fresco. Con l'omogeneizzatore ancora sul ghiaccio, utilizzare un pestello aderente per distruggere il tessuto cerebrale eseguendo 40 cicli di frantumazione e giri per tre o cinque larve di dpf e 50 giri per sette e otto larve di dpf. Quindi aggiungere due ml di Media A alla sospensione cellulare per diluire le cellule e ridurre la loro agglomerazione con la mielina. Eliminare l'agglomerazione cellulare facendo passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 40 micron in una provetta fredda da 50 ml su ghiaccio.

Ripeti questo passaggio tre volte. Trasferire un'aliquota di un ml di sospensione cellulare in provette fredde da cinque ml e farle girare a 300 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, utilizzando una siringa da 10 ml con un ago da un pollice calibro 23, rimuovere il surnatante.

Con un ml di gradiente di densità ghiacciato del 22% sovrapposto delicatamente da cinque ml di 1X dbps ghiacciato al punto zero, risospendere delicatamente il pellet cellulare. Far girare i tubi a 950 volte g senza interruzioni in accelerazione lenta a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la rotazione, scartare il mezzo del gradiente di densità dbps nella mielina intrappolata nella loro interfase.

Quindi utilizzare zero virgola cinque ml di Media A con il due percento di NGS per lavare le cellule e centrifugare le provette a 300 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere quanto più surnatante possibile, quindi estrarre i pellet cellulari dalla stessa condizione sperimentale insieme in un ml di terreno A con il due percento di NGS. Se le cellule di interesse esprimono una proteina fluorescente, far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 35 micron e trasferirle in provette FACS fredde da 5 ml su ghiaccio al riparo dalla luce.

Per immunocolorare la microglia, utilizzare tre ml di terreno A più il due percento di NGS per risospendere il pellet cellulare, quindi dividere le cellule in tre provette da cinque ml, una per le cellule non colorate per misurare l'autofluorescenza, una per misurare il legame non specifico di un anticorpo secondario alla microglia e una terza come test. A tutte le provette, aggiungere l'uno per cento di endotossina a basso contenuto di azide o una foglia per bloccare le interazioni CD16, CD32 con il dominio FC delle immunoglobuline. Quindi incubare le cellule per 10 minuti con una leggera agitazione ogni cinque minuti.

Successivamente, alla terza provetta aggiungere l'anticorpo 4C4 e incubarlo per 30 minuti agitando delicatamente ogni 10 minuti. Quindi centrifugare i tubi a 300 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet una volta con zero virgola cinque ml di Media A più il due percento di NGS prima di girare nuovamente le provette.

Risospendere il pellet cellulare con cinque ml di Media A virgola zero più il due percento di NGS, quindi aggiungere l'uno per cento di foglia e incubare le cellule per 10 minuti con una leggera agitazione ogni cinque minuti. Alle provette due e tre, aggiungere gli anticorpi secondari e posizionare le provette al buio. Dopo aver girato le provette e scartato il surnatante, utilizzare zero virgola cinque ml di terreno A più il due percento di NGS per lavare i campioni due volte, quindi risospendere i pellet cellulari con un ml di terreno A più il due percento di NGS.

Far passare la sospensione cellulare attraverso un tappo filtrante da 35 micron e trasferirla in provette FACS fredde da cinque ml su ghiaccio al riparo dalla luce. Infine, eseguire lo smistamento FACS e l'estrazione dell'RNA secondo il protocollo di testo. In questo studio, neuroni e macrofagi più microglia sono stati isolati da otto larve dpf mpeg1 EGFP-positive NBT dsRED-positive.

Il FACS è stato utilizzato per separare le cellule dai detriti in funzione delle loro dimensioni e granularità. Le singole cellule sono state quindi separate da doppietti o agglomerati cellulari. Dalla popolazione di singole cellule, è stato disegnato un cancello per eliminare le cellule morte.

Il dot plot corrispondente ha rivelato che questo protocollo sperimentale preserva l'integrità della membrana plasmatica cellulare poiché il tasso di cellule morte è solo del 26,7%. Come mostrato qui, i neuroni e i macrofagi più le microglia sono stati facilmente segregati dai cancelli della popolazione di cellule vive. All'interno del cervello, la popolazione neuronale sembrava essere più prominente rispetto alla popolazione di macrofagi e microglia.

In un secondo studio, lo smistamento FACS è stato utilizzato per isolare microglia vive da cervelli larvali con 4C4, un anticorpo che etichetta specificamente la microglia. Come riassunto in questa tabella dei dati di isolamento della microglia e di estrazione dell'RNA, il numero di microglia all'interno del cervello larvale di zebrafish varia ed è molto basso a tre dpf. Infine, i risultati dell'estrazione dell'RNA ottenuti con un esperimento da microglia di cinque cervelli larvali di pesce zebra dpf sono mostrati in questa traccia di elettroforesi con una chiara visualizzazione dell'RNA ribosomiale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore a seconda del numero di teste necessarie per condizione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutto freddo e le superfici pulite per evitare la degradazione dell'RNA. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze che utilizzano il pesce zebra come modello per esplorare i profili di espressione genica di diverse cellule in condizioni fisiologiche e patologiche.

Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare neuroni, macrofagi e microglia dal cervello larvale di pesce zebra e come estrarre RNA di alta qualità per eseguire analisi a valle come la qPCR e la trascrittomica.