Name: Mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Scopri la coltura di monostrato epiteliale gastrico primario derivato da topo e umano per studiare la rigenerazione cellulare. Questo metodo consente analisi di migrazione e guarigione delle ferite in vitro.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH (NIDDK) 5 DK083402 R01-07 concedere (YZ).

Per evitare contaminazioni, eseguire protocollo nella sua interezza all'interno di una cappa di sterili per coltura. Tessuto umano fundic è stato raccolto da pazienti sottoposti a gastrectomia verticale secondo il protocollo approvato IRB Università di Cincinnati (numero di protocollo IRB: 2015-4869). Tutti gli studi del topo sono stati approvati dall'Università di Cincinnati istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) che gestisce un impianto di associazione americana di valutazione e accreditamento di laboratorio animale cura (AAALAC).
1. istituzione di derivazione umana 3D gastrico fundico Organoids
Nota: Questo protocollo si basa sulla ricerca precedentemente pubblicata in questo laboratorio8.
<ol><li>Preparare i supporti 3D organoid che consiste di 50% Wnt-condizionate e 20% R-spondin condizionata media.<ol>
<li>Preparare il supporto di Wnt condizionata, coltura le cellule L nel mezzo di crescita Wnt (Dulbecco s modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina/streptomicina) per 7 giorni, raccogliere il mezzo e del filtro utilizzando un filtro da 0,22 µm.</li>
		<li>Preparare i supporti R-spondin condizionata. Crescere una linea cellulare che secerne modificata di HEK 293T R-spondin in R-spondin crescita medio (Dulbecco s modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina/streptomicina). All'allegato dopo 2 h, modificare il mezzo da queste cellule a crescita OPTIMEM medium, 1% penicillina/streptomicina. Coltura delle cellule per 7 giorni. Poi raccogliere i media di R-spondin condizionata e filtrare usando un filtro da 0,22 µm. Nota: Questo protocollo è stato pubblicato in precedenza e per un protocollo più dettagliato fare riferimento a 6,7,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scongelare la matrice della membrana dello scantinato ridotta, privo di rosso fenolo di fattore di crescita per 16 h sul ghiaccio a 4 ° C. Raccogliere il tessuto nel Ca2 +/Mg2 +ghiaccio freddo-gratis DBPS in un grande contenitore di plastica. Memorizzare sul ghiaccio fino al punto di inizio 1.4. Nota: Il tessuto è raccolto da pazienti sottoposti a gastrectomia.</li>
	<li>Usando il forcipe, lavare il tessuto vigorosamente in un becher sterile contenente 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libero Phosphate Buffered Saline (DPBS di Dulbecco). Lavare per circa 30 s o fino a quando i detriti e il sangue è stato rimosso. Successivamente, utilizzando garza sterile, spazzare via lo strato di muco dall'epitelio.</li>
	<li>Usando il forcipe grande, saldamente afferrare lo strato muscolare del tessuto e con forza, raschiare via l'epitelio utilizzando il grande curvo pinza emostatica. Raccogliere i frammenti epiteliali raschiati in una capsula di Petri sterile, polistirolo.</li>
	<li>Tritare il tessuto epiteliale in frammenti di2 dimensioni circa 2.0 x 2.0 mm utilizzando rasoi per ottimizzare la digestione del tessuto. Lavare i frammenti di tessuto con Ca2 +/Mg2 + -gratis DBPS completati con antibiotici (Ca2 +/Mg2 + -gratis DPBS, 1% di penicillina/streptomicina, 0,25 mg/mL anfotericina B 10 mg/mL Gentamicina, kanamicina 50 mg/mL), fino a quando il lavaggio è privo di sangue. Se necessario, eseguire diversi lavaggi. Gettare fuori il lavaggio filtrando attentamente il lavaggio attraverso una garza sterile in un becher da rifiuti.</li>
	<li>Lavato raccogliere frammenti in un bicchiere da 125 mL pallone da con un ancoretta di 25 mm e pre-riscaldato incubazione media (media basale completati con 2 mM L-Glutammina, 1% penicillina/streptomicina, 10 mM tampone HEPES, 1 mg/mL 1 tipo collagenosi, coltura cellulare di 2 mg/mL Albumina di siero bovino di grado). Sigillare il pallone a fondo tondo con setti di gomma.</li>
	<li>Inserire un ago spinale 20 G i setti e collegarlo ad una bombola di ossigeno con tubi di gomma. Per filtrare le sostanze contaminanti, inserire il tubo per creare un filtro di carta velina. Accendere il deflusso di ossigeno basso. Inserire gli aghi di deflusso di 10-15 i setti per evitare la rottura dei setti.</li>
	<li>Fissare il kit fino ad un anello utilizzando morsetti e posizionarlo in un bagnomaria calibrato a 37 ° C con un piatto di mescolare per 30-45 min. Dopo che il tessuto è stato incubazione per 15 minuti, rimuovere 50 µ l di incubazione carta e controllare visivamente per ghiandole dissociate. Se le ghiandole non sono dense o non sono separati dal tessuto, lasciare per altri 5-10 min.</li>
	<li>Subito dopo incubazione, aggiungere 50 mL pre-riscaldata DMEM/F12 ai media di incubazione utilizzando una pipetta sterile sierologica o versando direttamente nella miscela di incubazione.</li>
	<li>Filtrare la miscela di ghiandola attraverso una garza sterile in quattro provette coniche da 50 mL. Mantenere il filtrato in ghiaccio per 15 minuti consentire di estratti di ghiandole depositano alla parte inferiore del tubo conico. Fare attenzione a non disturbare le ghiandole si stabilirono, rimuovere ed eliminare la parte superiore 40 mL di surnatante con una pipetta sierologica. Risospendere i rimanenti 10 mL in 10 mL di DPBS completati con antibiotici.</li>
	<li>Distribuire uniformemente la miscela in provette da 5 mL cella cultura. Centrifugare per 5 min a 65 x g a 4 ° C e rimuovere il surnatante con attenzione usando una pipetta. Risospendere il pellet di ghiandola nella matrice della membrana dello scantinato scongelati utilizzando una pipetta o una punta di vasta pipetta 200 µ l. Mescolare fino a quando non è omogenea. Nota: È fondamentale per eseguire questo passaggio sul ghiaccio e per evitare la polimerizzazione della matrice della membrana basale durante la miscelazione. Inoltre, è importante ispezionare visivamente la densità della ghiandola di campionamento 50 µ l. La densità ottima è confluency di ~ 70%.</li>
	<li>Successivamente, piastra le ghiandole in 50 µ l di matrice della membrana basale usando una pipetta a punta larga. Evitare di produrre qualsiasi le bolle mentre placcatura.</li>
	<li>Per consentire la matrice della membrana basale di polimerizzare, incubare per 10-15 min a 37 ° C. Se placcatura in una piastra di coltura 12-pozzetti, aggiungere 1 mL di hFGO media (medium di medie/F12 Eagle modificate di Advanced Dulbecco completati con 2mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 0,25 mg/mL anfotericina B 10 mg/mL Gentamicina, 50 mg/mL kanamicina, 10 mM HEPES Buffer, n-Acteylcystine di 1 mM, 1 x N2, 1x B27, 50% medio di Wnt-condizionato, 20% R-spondin-condizionato supplementato con 100 ng/mL dell'osso inibitore della proteina morfogenetica, 1 gastrina nM, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, fattore di crescita fibroblastico 200 ng/mL 10, 10 mM nicotinammide e 10 µM Y-27632 ROCK inibitore) per pozzetto. Se non utilizzando una piastra di coltura 12-pozzetti aggiungere abbastanza media per immergere la bolla di matrice della membrana dello scantinato.</li>
	<li>Coltura le cellule a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare umidificata di 5% CO2 . Cambiare supporto ogni 4-5 giorni.</li>
</ol>2. stabilire Organoids Fundic gastrica 3D Mouse-derivato
Nota: Questo protocollo è stato in precedenza pubblicato 6. Scongelare la matrice della membrana basale sul ghiaccio e preparare tutti i reagenti prima di iniziare.
<ol><li>Sacrificio di topi utilizzando un metodo approvato dall'Istituto di ricerca dove si esegue la ricerca. Rimuovere lo stomaco dal mouse e sezionare secondo i protocolli precedentemente pubblicati 6. Lavare in 20ml ghiaccio freddo Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS. Nota: Topi C57BL/6, età compresa tra 8-10 settimane, sono utilizzati per colture fundic gastrica organoid. Topi sono stati sacrificati per inalazione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale manuale prima della rimozione dello stomaco.</li>
	<li>Striscia lo strato del muscolo dallo stomaco e qualsiasi visibile vasi sanguigni come precedentemente pubblicato 6.</li>
	<li>Separare il fondo dal antrum e prestomaco utilizzando una lama di rasoio sterile. Taglio fondo usando piccole forbici chirurgiche in frammenti circa 2.0 x 2.0 mm. Using forcipe, raccogliere i frammenti in una provetta conica da 15 mL contenente tampone dell'EDTA di incubazione (Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS, 5mm EDTA) e incubare a 4 ° C per 2 h con movimentazione delicata.</li>
	<li>In una cappa sterile, lasciare il tubo conico e frammenti sul ghiaccio per circa 5 min. utilizzano una pipetta per rimuovere quanto più tampone di incubazione possibile lasciando frammenti intatti. Aggiungere 5 mL di buffer di agitazione (1 g D-sorbitolo, saccarosio 1,47 g in 100 mL di Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS) ed agitare a mano con una forza di 2 min permetterà i grandi frammenti di stabilirsi e di fretta, utilizzando una pipetta 1000P, rimuovere i piccoli frammenti che sono ancora da stabilirsi nello strato superiore.</li>
	<li>Girare i frammenti rimossi per 5 min a 4 ° C a 65 x g.</li>
	<li>Evitando bolle d'aria, rimuovere il supernatante, risospendere nella matrice della membrana basale e mescolare fino a quando non è omogenea.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di punta larga per piastra la matrice della membrana basale a 50 µ l per pozzetto e incubare a 37 ° C per 20 min.</li>
	<li>Aggiungi media di crescita abbastanza mFGO (Advanced Dulbecco per volta medium medium/F12 Eagle completate con 2mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 10 mM tampone HEPES, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% medio di Wnt-condizionato, 20% R-spondin-condizionato supplementato con 100 inibitore della proteina morfogenetica dell'osso ng/mL, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal Growth Factor, fattore di crescita fibroblastico 10 ng/mL 10 e inibitore di Y-27632 ROCK 10 µM) per sommergere la bolla.</li>
	<li>Coltura le cellule a 37 ° C, incubatrice di coltura cellulare umidificata di 5% CO2 . Modificare i media ogni 4-5 giorni.</li>
</ol>3. rivestimento collagene per trasferimento 2D
Nota: Eseguire tutte le procedure in un cappuccio sterili per coltura, se non diversamente specificato. Begin collagene rivestimento 24 h prima del trasferimento organoids 3D per il monostrato. Mantenere il collagene della coda di ratto sul ghiaccio e protetto da luce. Piastre di collagene rivestito sono buoni per fino a 2 settimane. Se non si utilizza le piastre rivestite in immediatamente, avvolgere la piastra in parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando necessario.
<ol><li>Diluire il collagene della coda di ratto a 50 µ g/mL utilizzando 20 mM di acido acetico.</li>
	<li>Sufficientemente coprire la superficie del pozzo con il collagene diluito. Per un pozzo in una piastra standard 12-pozzetti, cappotto con circa 1 mL di collagene. Lasciar riposare a temperatura ambiente in una cappa sterile.</li>
	<li>Lavare due volte con 1 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS per pozzetto e lasciano scoperti per 2 h a temperatura ambiente in una cappa sterile.</li>
</ol>4. membrana basale Matrix rivestimento per trasferimento 2D
Nota: Eseguire tutte le procedure in un cappuccio sterili per coltura, se non diversamente specificato. Iniziare la matrice della membrana basale rivestimento 2 h prima del trasferimento organoids 3D per il monostrato. Tenere la matrice della membrana basale su ghiaccio. Piastre devono essere utilizzati immediatamente e non possono essere memorizzati per un periodo prolungato di tempo.
<ol><li>Diluire la matrice della membrana dello scantinato in una provetta conica da 15 mL con un acqua di grado di cultura cellulare presso un 01:10 ratio. Diluire il ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta aggiungere 100 µ l di matrice della membrana basale diluito in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti standard. Utilizzando un raschietto di cella, distribuire uniformemente la matrice della membrana dello scantinato diluito in tutto il bene per uno strato uniforme.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 1 h.</li>
	<li>Rimuovere l'acqua residua utilizzando una pipetta e asciugare a temperatura ambiente per 1 h prima del trasferimento organoids 3D.</li>
</ol>5. trasferimento di m/hFGOs 3D a 2D monostrati di cellule epiteliali gastriche umane
<ol><li>Dopo 3D mouse-derivati umani o che fgos sono state coltivate per 6-7 giorni, iniziare il trasferimento dei organoids 3D per il 2D monostrato. Nota: Per ogni pozzetto di un monostrato necessario si consiglia di utilizzare 300 organoids intatto o singole cellule derivate da 300 organoids. In una solida cultura si prevede di ottenere circa 150 organoid/pozzetto all'interno di una piastra di coltura ben 12.</li>
	<li>Assicurarsi che le piastre vengono coperte prima del trasferimento. Nota: Le piastre di matrice rivestito della membrana dello scantinato hanno uno strato di gel traslucido, tuttavia, piastre di collagene rivestito non avrà alcuna indicazione ovvia del rivestimento.</li>
	<li>Sloggiare la bolla di matrix 3D della membrana dello scantinato dalla piastra direttamente pipettando 1 mL sterile Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS sul centro della bolla.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, raccogliere l'impasto di matrice e organoid della membrana dello scantinato in provette di coltura delle cellule. Raccogliere con un rapporto di 2 bolle di matrice della membrana dello scantinato per ogni provetta. Centrifugare per 5 min 40 x g e a 4 ° C.</li>
	<li>Utilizzando un sistema di vuoto, rimuovere il supernatante e come molta matrice della membrana basale come possibile. Risospendere in 4 mL di Ca2 +/Mg2 +-priva di DBPS, rimuovere il supernatante e ripetere 2 - 3 volte. Per il protocollo di trasferimento di intero organoid, procedere al passaggio 5.10. Continuare al punto 5.7 per il protocollo di sospensione unicellulare.</li>
	<li>Pre-riscaldare la soluzione di separazione cellulare a 37 ° C e aggiungere 1 mL di ciascuna provetta. Mescolare delicatamente da invertendo i tubi o pipettaggio su e giù con una pipetta. Incubare per 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS direttamente da ciascuna provetta.</li>
	<li>Utilizzare un ago da 26 G e la siringa la miscela 2 - 3 volte. Controllare visivamente per singole celle. Siringa 1-2 volte di più se ci sono ancora organoids o aggregati di cellule.</li>
	<li>Centrifuga a 40 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 2D media FGO (del mouse 2D FGO crescita medio: medium di medie/F12 Eagle modificate di Advanced Dulbecco completati con 2mM L-Glutammina, 10mm penicillina/streptomicina, 10% di siero fetale di vitello, 10 mM tampone HEPES, 1 x N2, 1 x B27, completati con 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, inibitore di TGF-β 1 µM e inibitore di Y-27632 ROCK 10 µM. 2D umano FGO crescita medio: Medium di medie/F12 Eagle modificate di Dulbecco avanzati completati con 2mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 10 mM tampone HEPES, 10% di siero fetale di vitello, 10 mM nicotinammide, 1 x N2, 1 x B27, addizionata di 50 mg/mL kanamicina, 50 ng/mL sviluppo epidermico Fattore e 10 µM Y-27632 ROCK inibitore, 1 µM TGF-β inibitore).</li>
	<li>Piastra la risospensione su piastre. Incubare le piastre a 37 ° C. Sostituire ogni 4 giorni o prima se media diventa giallo. Monostrato richiede circa 4 giorni al form.</li>
</ol>6. analisi della ferita usando monostrati di cellule epiteliali gastriche 2D di scratch
<ol><li>Utilizzando una lama di rasoio, graffiare il monostrato quando la cultura ha raggiunto confluency di 100%.</li>
	<li>Difficoltà monostrati utilizzando 3,7% formaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Permeabilize con detergente non ionico/PBS di 0,5% per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Successiva blocco monostrati con siero di asino 2% per 1 h a temperatura ambiente e incubare con diluizione 1: 1000 di H+, K+-anticorpo primario dell'atpasi durante la notte a 4 ° C, lavare con detergente non ionico/PBS al 0,1% e incubare con diluizione 1: 100 di asino anticorpo secondario anti-topo 488 e 10 μg/mL dei nuclei delle cellule Hoechst macchia per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per identificare le cellule di superficie mucosa pit in colture monostrato gastrico umano-derivato 2D, macchia di cellule con 20 μg/ml di coniugato FITC Ulex europaeus (UEAI). Monostrati di immagine su un microscopio confocale.</li>
	<li>Prendere le immagini di ferita ogni h. qualche graffio sarà ri-epithelialize tra 24-48 h a seconda della qualità di strato monomolecolare e variazione tra pazienti.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'attuale protocollo dettagli l'istituzione di monostrati epiteliali gastrico umano e del mouse-derivato che può essere utilizzato per le analisi di zero-ferita. Il protocollo dipende il concetto dei tessuti di isolamento da primari umani (o mouse) di cellule staminali residenti e un protocollo modificato è pubblicato da Schlaermann et al.7. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo qui per stabilire un confluenti e polarizzati monostrato epiteliale gastrica che esprime i principa...

L'uso di metodi di zero-ferita è un metodo popolare per lo studio della rigenerazione e riparazione1,2,3,4,5,6. La metodologia proposta può essere usata per studiare specificamente rigenerazione gastrico e Helicobacter pylori colonizzazione. In passato, linee cellulari di cancro gastrico sono stati utilizzati come mezzo per studiare l' Helicobacter pylori (H. pylori) infezione1,2 e fino a cancro gastrico recentemente linee cellulari quali le cellule AGS erano favorito1 ,2,3,4. Una limitazione di colture di cellule di cancro gastrico è loro fallimento di ricapitolare la diversità cellulare dell'epitelio gastrico. Per tentare di risolvere questa limitazione, dimostrato che qui è l'istituzione e il trasferimento dei primari umani - e mouse-derivati 3-dimensionale fundic gastrica organoids (FGOs) di un monostrato epiteliale gastrico per ferita guarigione saggi basati su un metodo modificato prima descritto da Schlaermann et al. 7 dimostriamo che gastrici monostrati epiteliali derivati da Tosato 3D FGOs gastrico o FGO-derivato singole cellule conservano una composizione cellulare polarizzata che strettamente rappresenta che dell'epitelio gastrico in vivo. Dato che le linee cellulari del cancro gastrico non dimostrano la composizione cellulare che questa tecnica consente di visualizzare, l'attuale protocollo ha un vantaggio rispetto ai metodi alternativi dosaggio zero-ferita. Questa metodologia è stata ottimizzata per cui gli strati monomolecolari possono essere stabilita da organoids intero o da una sospensione singola cella da organoids dissociate e placcato utilizzando una matrice della membrana basale o collagene-rivestimento. L'obiettivo generale del presente protocollo è quello di stabilire che un organoid derivato colture monostrato epiteliale gastrica per un'analisi di guarigione della ferita romanzo.

<table><tbody><tr><td>Eagle/F12 medium modificato avanzato di Dulbecco (terreno basale)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutammina)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B/Gentamicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcistina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore BMP (Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inibitore ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; Inibitore</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+ -free DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&micro; Filtro M</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 gradi C Bagno d'acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 1</td><td>Worthington</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>Siero Bovino Albumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (carta velina)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 mL pallone</td><td></td><td></td><td></td>a fondo tondo</tr><tr><td>1 pollice (25 mm) barra di agitazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Setti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>in gomma Garza sterile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td><td></td>di agitazione</tr><tr><td>Anello Anello</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morsetti per</td><td></td><td></td><td></td>supporto</tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td><td></td>di Petri sterile</tr><tr><td>Aghi da 18 G da 1,5 pollici di lunghezza</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Aghi spinali da 20 G da 3,5 pollici di lunghezza</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>trattata per colture cellulari a 12 pozzettiMidwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita ridotto, senza rosso fenolo MatrigelTM (matrice della membrana basale)</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Lame</td><td></td><td></td><td></td>di rasoio sterili</tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td>a punta larga</tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td></td><td></td>emostatiche curve</tr><tr><td>200 e micro; L punte per pipette larghe</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Provette per colture cellulari da 5 mL</td><td></td> Fisher <td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno con tubo in</td><td></td><td></td><td></td>gomma</tr><tr><td>1 g di D-sorbitolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>da</tr><tr><td>dissezione Vassoio</td> <td>da dissezione</td><td></td><td></td></tr><tr>Tavolo <td></td><td></td><td></td><td>a dondolo</td></tr><tr><td>Collagene a coda di ratto di tipo 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale per colture cellulari</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino a camera a 2 pozzetti</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12 pozzetti Transwell (inserti a membrana in poliestere)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (soluzione per il distacco delle cellule)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>263/8 siringa G</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>lama di</td><td></td><td></td><td></td>rasoio</tr><tr><td>L Cells</td><td>Le cellule L, una linea cellulare produttrice di Wnt3a, sono state ricevute in dono dal Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Paesi Bassi). &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Cellule secernenti spondina</td><td>Una linea cellulare HEK-293T secernente spondina R modificata è stata ottenuta dal Dr. Jeff Whitsett (Sezione di Neonatologia, Biologia Perinatale e Polmonare, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre e The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA). &nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPasi Anticorpo primario</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 anticorpo secondario (Asino anti-topo 488 anticorpo secondario)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Studi in vitro della riparazione arrotolata gastrico in genere comporta l'uso di linee cellulari di cancro gastrico in un dosaggio zero-ferita di migrazione e proliferazione cellulare. Una limitazione critica di tali dosaggi, tuttavia, è loro assortimento omogeneo di tipi cellulari. Riparazione è un processo complesso che richiede l'interazione di diversi tipi di cellule. Pertanto, studiare una cultura priva di sottotipi cellulari, è una preoccupazione che dovrà essere superata se vogliamo comprendere il processo di riparazione. Il modello organoid gastrico può alleviare questo problema per cui la raccolta eterogenea di tipi di cellule strettamente riflette quella dell'epitelio gastrico o altri tessuti in vivo. Ha dimostrato qui è un romanzo in vitro dosaggio zero-ferita derivato da umani o organoids 3-dimensionale del mouse che possono essere trasferiti a un monostrato epiteliale gastrico come entrambi organoids intatto o come una sospensione unicellulare di dissociato organoids. L'obiettivo del protocollo è quello di stabilire monostrati epiteliali gastrici organoid-derivato che possono essere utilizzati in un sistema di analisi novella zero-ferita per studiare rigenerazione gastrico.

Organoids sono stati derivati dal corpus/corpo dell'essere umano o del fondo dei tessuti dello stomaco del mouse (Figura 1A). Dopo aver collagenasi o digestione di EDTA del tessuto dello stomaco di derivati umani o del mouse rispettivamente, ghiandole sono incorporati nella matrice della membrana basale e coltivate per 6-7 giorni (Figura 1A). Figura 1B dimostra la formazione dei organoids gastrico um...

Qui descriviamo un protocollo per stabilire e coltura umano e del mouse-derivato organoids gastrico 3-dimensionale (3D) e il metodo per il trasferimento di organoids 3D di un monostrato di 2-dimensionale. L'uso del monolayer epiteliale gastrico come un'analisi novella di zero-ferita per studi di rigenerazione è anche descritto.

Mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

L'obiettivo generale di questo sistema di coltura è quello di generare un monostrato gastrico primario di origine murina o umana per lo studio della rigenerazione in un test di guarigione delle ferite. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo gastrico, come il meccanismo di rigenerazione delle cellule epiteliali gastriche in risposta a una lesione. Il vantaggio principale di questa tecnica è in primo luogo, lo studio della migrazione e della rigenerazione cellulare in un saggio di guarigione delle ferite, generato da cellule gastriche primarie di topo o di derivazione umana, e la seconda generazione di organoidi gastrici di derivazione umana per esperimenti su larga scala.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione dell'epitelio gastrico, può essere applicato anche ad altri sistemi come l'infezione da helicobacter pylori e le co-colture di cellule immunitarie epiteliali. A dimostrare la procedura sarà Emma Teal, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, raccogli il tessuto preparato in un grande contenitore di plastica riempito con DPBS privo di calcio e magnesio.Lasciare il contenitore di plastica sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Successivamente, con l'aiuto di una pinza, lavare energicamente il tessuto in un becher sterile contenente 100 millilitri di DPBS privo di calcio e magnesio per circa 30 secondi. Quindi utilizzare una garza sterile per rimuovere lo strato di muco dall'epitelio.Quindi, usa una pinza grande per tenere saldamente lo strato muscolare del tessuto, quindi usa una pinza emostatica curva grande e raschia l'epitelio con forza. Conservare l'epitelio raschiato in una capsula di Petri di polistirene sterile. Per ottimizzare la digestione dei tessuti, tritare il tessuto epiteliale in frammenti.Quindi lavare il fazzoletto con DPBS privo di calcio e magnesio integrato con antibiotici. Lavare più volte per rimuovere il sangue. Gettare il bucato in un bicchiere di scarico.Quindi raccogliere i frammenti epiteliali lavati in un pallone di vetro a fondo tondo da 125 millilitri con una barra di agitazione da 25 millimetri e un terreno di incubazione preriscaldato. Dopo aver raccolto i frammenti di tessuto, sigillare il pallone a fondo tondo con un setto. E poi usa i morsetti per fissare l'installazione a un supporto ad anello.Quindi inserire un ago spinale calibro 20 nei setti. Collegare i setti a una bombola di ossigeno con tubo di gomma. Inserire da 10 a 15 aghi di deflusso nei setti per prevenirne la rottura, l'interruttore sul deflusso dell'ossigeno è basso.Successivamente, calibrare il bagnomaria a 37 gradi Celsius su una piastra di agitazione per 30-45 minuti. Una volta calibrato, posizionare l'impianto nel bagnomaria. Dopo 15 minuti di incubazione, verificare la presenza di ghiandole dissociate.Dopo il tempo di incubazione desiderato, aggiungere 15 millilitri di DMEMF12 preriscaldato al terreno di incubazione utilizzando una pipetta sierologica. Successivamente, filtrare la miscela di ghiandole ottenuta attraverso una garza sterile in quattro tubi conici da 15 millilitri. Quindi incubare il filtrato su ghiaccio per 15 minuti.Ciò consentirà alla ghiandola di depositarsi sul fondo del tubo conico. Utilizzare una pipetta sierologica per scartare 40 millilitri di surnatante dalla parte superiore della sospensione ghiandolare. Risospendere i restanti 10 millilitri della miscela Glad in 10 millilitri di DPBS integrato con antibiotici.Quindi distribuire l'intera miscela in provette da cinque millilitri per colture cellulari. Centrifugare le provette a 65 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante.Sciogliere il pellet ghiandolare ottenuto con la matrice della membrana basale con un ampio puntale di pipetta da 200 microlitri. Mescolare la sospensione fino a renderla omogenea. Quindi, placcare le ghiandole in 15 microlitri della matrice della membrana basale con l'aiuto di una pipetta a punta larga.Per polimerizzare la matrice della membrana basale, incubare a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di terreno hFGO in ciascun pozzetto se coltivato in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Quindi coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari umidificato.Cambia il mezzo ogni 45 giorni. Dopo sei o sette giorni di coltura 3D di FGO derivata da topo o da uomo, iniziare a trasferire gli organoidi 3D nel monostrato 2D. Per fare ciò, aggiungi un millilitro di DPBS privo di calcio e magnesio al centro della bolla per rimuovere la bolla della membrana basale 3D dalla piastra.Quindi raccogliere la matrice della membrana basale e la miscela di organoidi nella provetta per coltura cellulare. Quindi centrifugare a 40 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, utilizzare un sistema a vuoto per rimuovere il surnatante e la maggior quantità possibile di matrice della membrana basale.Quindi, sciogliere il pellet in quattro millilitri di DPBS privo di calcio e magnesio. Assicurati di rimuovere il più possibile la matrice basale dopo aver raccolto gli organoidi in preparazione per il monostrato. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare preriscaldata a 37 gradi Celsius in ciascuna provetta.Quindi mescolare il contenuto del tubo capovolgendolo più volte. Infine, incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Per ottenere una sospensione a singola cellula, aggiungere i due millilitri di DPBS privo di calcio e magnesio direttamente in ciascuna delle provette.Quindi utilizzare un ago calibro 26 per mescolare la sospensione due o tre volte. Dopo la miscelazione, centrifugare la sospensione cellulare, quindi sciogliere il pellet cellulare in terreno FGO 2D. Per ottenere l'intero organoide, piastrate la sospensione cellulare su piastre rivestite.Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius per circa quattro giorni. Cambia il supporto se il colore diventa giallo. Non appena la coltura raggiunge il 100% di confluenza, grattare il monostrato usando una lama di rasoio.Quindi fissare i monostrati utilizzando il 3,7% di paraformaldeide a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, permeabilizzare i monostrati con Triton X-100 per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la permeabilizzazione, bloccare i monostrati con il due percento di siero d'asina per un'ora.Dopo un'ora di blocco, incubare il monostrato con una soluzione di anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte. Avvolgere il monostrato in parafilm per evitare l'evaporazione e l'essiccazione della coltura durante la notte. Il giorno successivo, lavare con lo 0,1% di detersivo non ionico in PBS.Quindi, incubare con anticorpi secondari e 10 microgrammi per millilitro di nuclei di cellule ospiti colorano per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, colora le cellule. Quindi, identificare le cellule mucose superficiali nella coltura monostrato gastrica 2D di derivazione umana al microscopio confocale.Infine, acquisisci immagini della ferita ogni poche ore. Queste immagini provenienti dall'analisi time lapse mostrano la formazione di FGO umani. Questi organoidi vengono trasferiti in un monostrato epiteliale gastrico su vetrini a camera codificati con matrice di membrana basale.Il monostrato epiteliale gastrale viene analizzato ogni otto ore per un giorno. L'immagine mostra che l'area della ferita continua a diminuire e scompare completamente nella coltura in un solo giorno. Questa colorazione immunol florescence mostra la presenza di un monostrato positivo per E-caderina che consiste nelle cellule mucose superficiali.Ciò indica la rigenerazione del monostrato epiteliale gastrico. I nuclei presenti sono colorati con hoechst. Quindi, l'analisi RTPCR viene eseguita utilizzando l'RNA estratto dal monostrato epiteliale gastrico umano per confermare l'espressione delle cellule mucose, principali e del collo parietali della superficie.La presenza di ATPa e PgC, mostra la presenza rispettivamente di cellule parietali e principali. La presenza di MUC5AC e MUC6 mostra la presenza rispettivamente di muco superficiale e cellule mucose del collo. In questa immagine di florescenza immunolica, la proliferazione delle cellule nella coltura di monostrato epiteliale gastrico umano è mostrata dalla pronta captazione di EdU.Queste immagini di fluorescenza immunolica mostrano la rigenerazione dell'epitelio gastrico e l'espressione delle cellule mucose superficiali e parietali a zero, otto, 16 e 24 ore dopo la ferita da graffio. Una volta padroneggiato, il trasferimento da 3D a 2D può essere effettuato entro un'ora se viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavare via la maggior parte della matrice della membrana basale dagli organoidi raccolti prima del trasferimento 2D.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'infezione da helicobacter pylori in monostrati e le co-colture di cellule immunitarie monostrato per rispondere a ulteriori domande, come le interazioni tra ospite e patogeno. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della gastroenterologia per esplorare le malattie e la rigenerazione nello stomaco. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come la tecnica sterile e le misure di protezione personale.

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