Scansione automatizzata Slide e segmentazione nei tessuti fluorescente-identificati utilizzando un sistema di analisi di Widefield ad alto contenuto
3 maggio 2018
Qui descriviamo un protocollo per la segmentazione automatica dei tessuti fluorescente contrassegnati su diapositive utilizzando un sistema di analisi ad alto contenuto di widefield (WHCAS). Questo protocollo ha vaste applicazioni in qualsiasi campo che coinvolge la quantificazione di marcatori fluorescenti in tessuti biologici, tra cui le scienze biologiche, ingegneria medica e scienze della salute.
L'obiettivo generale di questo metodo di imaging e analisi è quello di generare un flusso di lavoro facile da configurare per la segmentazione automatica di qualsiasi campione di tessuto montato su vetrino marcato in fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle scienze biologiche su quanta parte di una data proteina si trova all'interno di un'area specifica di un campione di tessuto di interesse. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i protocolli di ottimizzazione del tempo per la segmentazione automatizzata possono essere risparmiati, consentendo l'applicazione di questo metodo ai successivi campioni di tessuto montati su vetrini marcati in fluorescenza.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando avevamo bisogno di quantificare nuove cellule nel tessuto cerebrale ad alto ingrandimento. Dopo aver importato i diari, aprire la finestra di dialogo Impostazione acquisizione lastre e aprire la scheda Obiettivo e fotocamera. Impostate l'ingrandimento su quattro volte, il binning della fotocamera su uno e il guadagno su due.
Aprire la scheda Scansione vetrini e inserire le impostazioni sperimentali appropriate. Nella scheda Siti da visitare, riempire i pozzetti in modo uniforme con i siti e aprire la scheda Modifica impostazioni fondo piastra per inserire i valori sperimentali appropriati. Dopo aver salvato queste impostazioni come Impostazione A, apri la scheda Obiettivo e fotocamera e imposta l'ingrandimento su 40 volte, il binning della fotocamera su uno e il guadagno su due.
Verificare che tutte le impostazioni nelle schede Scansione vetrino lastra e modificare le impostazioni inferiori della lastra siano le stesse inserite per l'impostazione A.E aprire la scheda Ciclo di acquisizione. Immettere il numero di lunghezze d'onda presenti nel campione e selezionare le opzioni Abilita messa a fuoco basata su laser e Abilita messa a fuoco basata su immagini. Quindi, salvare queste impostazioni come Impostazione B.Quindi, posizionare fino a tre diapositive, il vetrino coprioggetto rivolto verso il basso con l'etichetta sul lato della tacca nell'adattatore per diapositive.
E premi F4 per aprire il menu principale. Selezionare Scansione vetrini e fare clic su Apri porta Espelli vetrino per inserire l'adattatore per vetrini nel sistema di analisi ad alto contenuto ad ampio campo. Quindi fare clic su Chiudi scivolo di carico porta.
Per iniziare, assicurarsi che sia selezionata la lunghezza d'onda appropriata. Spostarsi in siti diversi all'interno dell'immagine live fino a quando non viene individuata l'area di interesse. Concentrati sulla regione.
Se non è a fuoco, utilizzare il pulsante Autofocus o regolare la dimensione del passo fino a quando non lo è. Utilizzare Snap per acquisire l'immagine, se si regola manualmente la messa a fuoco modificando la dimensione del passo. Per impostare una scansione precedente, caricare prima l'impostazione A e selezionare Anteprima diapositive.
Indicare il numero di diapositive e selezionare OK. Scegli quattro volte come ingrandimento. Quindi seleziona Vetrino coprioggetti in basso e continua a selezionare le impostazioni di base per la scansione precedente. Assicurarsi che sia l'impostazione di acquisizione che le calibrazioni siano selezionate prima di selezionare Annulla e premere Continua.
Nella scheda W1:DAPI, fai clic su Live e poi su Auto Expose, seguito da Snap. Successivamente, premere Chiudi. Selezionare la directory e immettere un nome di scansione precedente.
Apparirà automaticamente la finestra di dialogo Disegna regione. Utilizzare lo strumento regione rettangolare per selezionare l'intera area di scansione precedente e fare clic su Continua. Al termine della scansione precedente, caricare l'impostazione B e aprire la scheda Siti da visitare.
Per iniziare, assicurarsi che sia selezionata la lunghezza d'onda appropriata. Spostarsi in siti diversi all'interno dell'immagine live fino a quando non viene individuata l'area di interesse. Concentrati sulla regione.
Se non è a fuoco, utilizzare il pulsante Autofocus o regolare la dimensione del passo fino a quando non lo è. Utilizzare Snap per acquisire l'immagine, se si regola manualmente la messa a fuoco modificando la dimensione del passo. Quindi, nella scheda DAPI W1, fare clic su Esposizione automatica e verificare che l'immagine DAPI di Plate Acquisitions Snap sia nitida.
Nel menu principale, fare clic su Diario e selezionare Esegui diario nel menu a discesa. Fare doppio clic sul giornale di configurazione dell'acquisizione della regione del vetrino per avviare l'avvio e fare clic su Continua quando viene visualizzata la finestra di dialogo Imposta acquisizione della regione del vetrino. Quando richiesto, selezionare la scansione DAPI per selezionare l'immagine del vetrino a basso ingrandimento e fare clic su OK. Quando viene richiesto lo snap di acquisizione targhe, evidenziare lo snap di acquisizione lastre-DAPI e fare clic su OK. Quando viene visualizzata la casella Crea o carica regioni, utilizzare lo strumento Regione rettangolare per selezionare le regioni di interesse nella scansione DAPI e fare clic su Continua.
Utilizzando lo strumento di localizzazione, evidenziare la regione di interesse e fare clic su Continua, nella finestra di dialogo Seleziona regione. Quando viene visualizzata la casella Conferma regioni, fare clic su Continua e decidere se la regione deve essere salvata quando viene visualizzata la finestra di dialogo Salva regioni. Appariranno tre finestre di dialogo.
Fare clic su Continua per chiudere la casella Installazione completata. Per eliminare qualsiasi congettura di ricerca del sito di esempio, assicurarsi che l'opzione Visualizza immagini durante l'acquisizione nella scheda Impostazioni di visualizzazione sia selezionata e aprire la scheda Riepilogo per fare clic su Acquisisci piastra per posizionare la fase della regione di interesse preselezionata. Quando la fotocamera esegue una panoramica su un sito contenente le celle di interesse, fare clic su Annulla per interrompere l'acquisizione dell'immagine.
Non allarmarsi se l'immagine è sfocata. Questo passaggio serve esclusivamente a posizionare la fase del primo sito nell'area di interesse selezionata. Verificare che la fase si trovi sopra il campione e che il numero di siti sia stato immesso correttamente.
Ottimizza le impostazioni della lunghezza d'onda per garantire che si ottenga una messa a fuoco in un'immagine ad alta gamma dinamica. Quindi, apri nuovamente la scheda Riepilogo e fai clic su Acquisisci piastra. Al termine dell'analisi, selezionate la scheda Visualizza (Display).
Nel menu a discesa Sovrapposizione immagini, selezionare Mostra informazioni sul pozzetto per visualizzare i numeri del sito nell'angolo in alto a sinistra. Scorri i siti ed escludi tutti i siti che sono fuori fuoco e/o che contengono pieghe o bolle e lacerazioni del tessuto nel tessuto. In questa immagine rappresentativa, vengono mostrate le miniature ad alto ingrandimento di tutti i siti all'interno della regione di interesse definita.
Ogni sito deve essere esaminato per identificare i siti che devono essere esclusi dall'analisi. Ad esempio, in questo esperimento, il sito 149 era fuori fuoco, il sito 219 aveva bolle e il sito 54 conteneva una piega. Tutti e tre questi siti sono stati esclusi dall'analisi.
Qui, le sovrapposizioni corrispondenti generate dal modulo di punteggio cellulare a più lunghezze d'onda dimostrano i risultati della segmentazione automatizzata eseguita sul sito 59 come personalizzato in base alle specifiche sperimentali. Dopo la segmentazione, è possibile ottenere i dati quantitativi della percentuale di cellule che si colorano positivamente per ciascun marcatore, entrambi i marcatori, nessun marcatore, area colorata media e intensità media di fluorescenza. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come configurare il vostro sistema di analisi ad alto contenuto ad ampio campo per creare un flusso di lavoro automatizzato per l'imaging e la segmentazione di un campione di tessuto montato su vetrino.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la segmentazione automatizzata di tessuti marcati con fluorescenza mediante un sistema automatizzato ad alta capacità in campo chiaro (WHCAS). Questo metodo semplifica la quantificazione di marcatori fluorescenti nei tessuti biologici, risultando vantaggioso per diversi settori, tra cui le scienze biologiche e l'ingegneria medica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Scienze Biologiche
- Ingegneria Medica
- Scienze della Salute
Sfondo
- La segmentazione automatizzata migliora l'analisi dei tessuti marcati con fluorescenza.
- I sistemi di analisi ad alto contenuto facilitano l'imaging dettagliato di campioni biologici.
- La quantificazione delle proteine nei campioni di tessuto è fondamentale per comprendere i processi biologici.
- Questo metodo è stato sviluppato per affrontare le difficoltà nella quantificazione di nuove cellule nel tessuto cerebrale.
Scopo dello studio
- Creare un flusso di lavoro efficiente per la segmentazione automatica di campioni di tessuto.
- Migliorare l'accuratezza e la velocità nella quantificazione di marcatori fluorescenti.
- Fornire un protocollo standardizzato applicabile a diversi tipi di tessuto.
Metodi Utilizzati
- Configurazione di un sistema di analisi ad alta contenuto a campo ampio per l'acquisizione di immagini.
- Impostazione delle condizioni sperimentali per un'acquisizione ottimale delle immagini.
- Utilizzo di strumenti software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
- Implementazione dell'autofocus e di tecniche di messa a fuoco basate sulle immagini.
Risultati principali
- È stata raggiunta una segmentazione riuscita dei tessuti marcati con fluorescenza.
- L'imaging ad alta ingrandimento ha fornito viste dettagliate dei campioni di tessuto.
- Le regioni di interesse sono state identificate e analizzate con precisione.
- Sono stati stabiliti criteri di esclusione per immagini fuori fuoco o compromesse.
Conclusioni
- Il protocollo di segmentazione automatizzata riduce in modo significativo il tempo di analisi.
- Questo metodo può essere applicato a un'ampia gamma di tessuti biologici.
- Applicazioni future potrebbero migliorare la ricerca in diversi campi scientifici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La scansione automatica delle diapositive e la segmentazione mediante un sistema di analisi ad alto contenuto in campo chiaro (WHCAS) risolve il collo di bottiglia nella quantificazione di marcatori fluorescenti su ampie sezioni di tessuto, consentendo un'analisi riproducibile e ad alto rendimento per la validazione di bersagli e lo sviluppo di saggi. Standardizzando le procedure di acquisizione delle immagini e di segmentazione, questo metodo riduce la variabilità e accelera la valutazione preclinica di biomarcatori tissutali, supportando decisioni basate sui dati di tipo go/no-go nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando i modelli di espressione proteica in tessuti rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Riduce il tempo necessario per l'ottimizzazione dei protocolli in singoli esperimenti, permettendo un'applicazione rapida a diversi bersagli marcati con fluorocromi.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione dei rischi meccanicistici grazie a letture quantitative e riproducibili della localizzazione e dei livelli di espressione dei marcatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive generando immagini di tessuti standardizzate e segmentate, adatte a saggi ad alto contenuto informativo.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso la selezione automatica di regioni e l'esclusione di aree compromesse (ad esempio tessuti fuori fuoco, piegati o con bolle).
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su diversi marcatori e tipi di tessuto grazie a moduli software predefiniti per la localizzazione proteica, la proliferazione, la vitalità, l'apoptosi e l'angiogenesi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la coerenza dal momento della scoperta fino alla validazione preclinica, fornendo dati quantitativi sulle proporzioni di cellule positive ai marcatori, sull'area media colorata e sull'intensità di fluorescenza.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta il processo decisionale preclinico fornendo set di dati affidabili, filtrati per esclusione, che riflettono il vero segnale biologico.
- Sistema rilevante per la malattia: Dimostrata applicabilità nell'analisi di tessuti di tumori cerebrali, con possibilità di estensione a qualsiasi marcatore nucleare o citoplasmatico marcato fluorescentemente in tessuti su vetrino.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery attraverso l'Identificazione del Lead fino alla Ricerca Preclinica, consentendo un'analisi dei tessuti standardizzata a ogni fase.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi quantificando l'espressione dei marcatori in specifiche regioni di interesse del tessuto.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso segmentazione automatizzata e output quantitativi che permettono una valutazione affidabile dei composti in diversi siti.
- Analisi: Genera output misurabili, inclusa la proporzione di cellule positive, l'area media colorata e l'intensità media della fluorescenza, consentendo il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo dati tissutali quantitativi allineati ai biomarcatori, adatti per studi di validazione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come una capacità riutilizzabile in diversi progetti, sfruttando moduli software predefiniti e impostazioni salvate (Impostazione A e B) per una scansione dei vetrini e una segmentazione costanti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei saggi basati sui tessuti.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro per l'acquisizione e l'analisi delle immagini dei tessuti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione, efficienza del capitale grazie alla riduzione del tempo di ottimizzazione dei protocolli e riduzione del rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati tissutali quantitativi e validati per esclusione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso di sistemi di analisi ad alto contenuto in campo ampio e nella navigazione del software associato.
- Dipende da strumentazione in grado di eseguire la scansione di vetrini, l'acquisizione a multiple lunghezze d'onda e il fuoco basato su laser e su immagini.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i team per le impostazioni di acquisizione (ad esempio, ingrandimento, binning, guadagno) e i protocolli di definizione delle regioni di interesse.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a diversi tipi di tessuto, espressioni di marcatori o spessori dei vetrini.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di escludere manualmente le aree con artefatti (ad esempio, immagini fuori fuoco, pieghe del tessuto, bolle) nonostante l'acquisizione automatizzata.
