Name: Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore allinterno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri una nuova tecnica di ibridazione in situ RNA per visualizzare molecole singole nel nucleus accumbens di ratti adulti. Questo metodo consente di studiare l'espressione del recettore D1-alpha e le differenze sessuali nella funzione dopaminergica.

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Le opere presenti sono state sostenute dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624. Fondo parziale è stato fornito da una sovvenzione di formazione NIH T32 nella scienza biomedica-comportamentale.

Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla cura degli animali e uso Committee (IACUC) presso la University of South Carolina (numero di assicurazione federale: A3049-01).
1. preparazione di sezioni di cervello congelato fresco
<ol><li>Utilizzare il ceppo di ratti F344/N: tre ratti di ogni sesso, Guida in linea di 13 mesi di età, circa 320 g di peso corporeo.</li>
	<li>Regolare la concentrazione di sevoflurane al 5% (sovradosaggio del sevoflurano). Continuare l'esposizione sevoflurano dopo respiro si ferma per un minuto.</li>
	<li>Decapitare il ratto e rimuovere il cervello.</li>
	<li>Immergere il cervello di ratto in azoto liquido per 15 s entro 5 min di raccolta del tessuto.</li>
	<li>Equilibrare il cervello a-20 ° C in un criostato per 1 h.</li>
	<li>Tagliare 30 µm sezioni e trasferire sui vetrini (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Scegliere le sezioni della regione di nucleo accumbens, circa 2,76 mm a 2,28 mm anteriore al Bregma14.</li>
	<li>Continuamente fetta cervello del ratto dal bulbo olfattivo attraverso la regione di nucleo accumbens secondo la struttura stereotassica cerebrale del ratto.</li>
	<li>Montare i campioni sulle diapositive. Mantenere le sezioni a-20 ° C per 10 minuti ad asciugare.</li>
	<li>Immediatamente immergere i vetrini nel paraformaldeide 4% pre-refrigerati per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Porre i vetrini in un gradiente crescente di etanolo a temperatura ambiente (TA): 50% EtOH per 5 min; 70% EtOH per 5 min; e 100% EtOH per 5 min.</li>
	<li>Ripetere con il fresco 100% EtOH.</li>
	<li>Mettere i vetrini su carta assorbente e lasciare asciugare all'aria.</li>
	<li>Disegnare una barriera intorno ogni sezione con una penna di barriera (Vedi Tabella materiali). Lasciate la barriera asciugare completamente per 1 min.</li>
</ol>2. pretrattamento delle sezioni del cervello
<ol><li>Accendere il forno e impostare la temperatura a 40 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di pretrattamento 4 reagente (Vedi Tabella materiali) su ogni sezione del cervello (una sezione per ogni diapositiva).</li>
	<li>Incubare le sezioni per 30 minuti a TA.</li>
	<li>Immergere i vetrini in 1X PBS per 1 min a RT. Repeat con PBS 1X fresco. Nota: Diapositive non dovrebbero stare in PBS 1X per più di 15 min.</li>
</ol>3. determinazione del RNA In Situ ibridazione fluorescente Multiplex
<ol><li>Riscaldare la sonda di destinazione per 10 min a 40 ° C a bagnomaria e poi raffreddare a RT.</li>
	<li>Posizionare il reagente di RNA (ad es., Amp FL 1-4) a TA.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso da diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Aggiungere 3 gocce (90 µ l) della sonda Drd1α (C1) sulla fetta di campione. Incubare per 2 ore a 40 ° C.</li>
	<li>Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 1-FL sulla fetta di campione. Incubare per 30 min a 40 ° C.</li>
	<li>Immergere i vetrini in tampone di 1 lavaggio per 2 min a RT. Repeat con buffer di 1wash fresco.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 2-FL sulla fetta di campione. Incubare per 15 min a 40 ° C.</li>
	<li>Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 3-FL sulla fetta di campione. Incubare per 30 min a 40 ° C.</li>
	<li>Immergere i vetrini in 1x tampone di lavaggio per 2 min a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 4-FL-Alt A sulla fetta di campione. Incubare per 15 min a 40 ° C.</li>
	<li>Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso da diapositive e collocare immediatamente 2 gocce di reagente di montaggio (Vedi Tabella materiali) su ogni sezione.</li>
	<li>Porre un coprivetrino 22 mm 22 mm (Vedi Tabella materiali) sopra ogni sezione del cervello.</li>
	<li>Archiviare le diapositive al buio a 2-8 ° C fino a secco.</li>
	<li>Accendere il microscopio confocale e passare a un obiettivo 60x.</li>
	<li>Ottenere immagini dello stack Z con un microscopio confocale. Vedere il video supplementare per una procedura di dettaglio dell'imaging confocale.</li>
	<li>Acquisire immagini della Drd1α etichettati cellule nella regione di accumbens del nucleo (eccitazione: 488 nm; Emissione: 515/30 nm). Nota: Non lasciare che cervello sezioni asciugare tra fasi di incubazione.</li>
</ol>4. analisi dei dati
<ol><li>Semi-quantitativamente analizzare il pattern di colorazione: "punti discreti".<ol>
<li>Per identificare la cella singola dall'immagine, eseguire DAPI colorazione come marcatore nucleare. Tuttavia, è ancora difficile da analizzare alcune parti del tessuto cerebrale, in quanto ha più tipi di cellule con forma irregolare di nuclei e/o cellule. Qui, due ricercatori esperti assegnare separatamente ogni cella da immagini per definire la regione di cella.</li>
		<li>Punteggio visivamente ogni cella all'interno delle immagini confocale rappresentative basato sul numero di punti per cella utilizzando i criteri specifici (Figura 1B).</li>
		<li>Determinare il numero totale delle cellule in ogni categoria e dividere per il numero totale delle cellule x100 per creare grafici di frequenza relativa che visualizzare la frequenza percentuale di cellule all'interno di ogni categoria per tutte le sezioni di tessuto (Figura 2A) e per maschi e femmine separatamente (Figura 2E).</li>
		<li>Dividere la somma delle celle all'interno di tutte le categorie precedenti per il numero totale delle cellule x100 per determinare la frequenza cumulativa delle cellule per tutte le sezioni di tessuto (Figura 2B) e per maschi e femmine separatamente (Figura 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare statisticamente i "puntini discreti" metodo di colorazione (facoltativo).<ol>
<li>Esaminare il numero di punti per cella per fornire una variabile categorica che è ordinale in natura (vale a dire, il numero di celle che rientrano in ciascuna categoria di rango da minima espressione delle cellule (1) alla più alta espressione delle cellule (9)) per ulteriori analisi statistiche.</li>
		<li>Dopo l'esame di statistica descrittiva, utilizzare tre approcci principali: una statistica di Mantel-Haenszel, un test di Mann-Whitney U e un test di Kruskal-Wallis. Sebbene l'approccio statistico preciso sarà dipende la domanda di design e ricerca sperimentale di interesse, un albero di decisione statistica (Figura 4) può essere di aiuto nel prendere le decisioni per quanto riguarda di uno approccio analitico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificare l'intensità di segnale della regione di interesse (ROI) per il modello di macchiatura: "cluster".<ol>
<li>Calcolare l'intensità del segnale di ogni immagine utilizzando la seguente equazione: L'intensità del segnale = totale intensità dell'immagine ROI - (zona di immagine totale del × di intensità di fondo media)</li>
		<li>Contare il numero totale di celle all'interno di immagine ROI per calcolare l'espressione del segnale approssimativo per la cellula. Le differenze del gruppo in intensità segnale/immagine, nonché il numero di cellule/immagine possono essere di interesse a considerare i meccanismi che possono contribuire alle differenze di gruppo vista in segnale espressione/cella (Figura 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare statisticamente i "cluster" metodo di colorazione (facoltativo).<ol>
<li>Esaminare l'espressione/cella di segnale per fornire una variabile continua per ulteriori analisi statistiche. Uso due approcci, tra cui un test t per campioni indipendenti e analisi della varianza (ANOVA), basato sul numero di fattori tra soggetti inclusi nella progettazione. Un albero di decisione statistica (Figura 4) può essere di aiuto nel prendere le decisioni per quanto riguarda l'approccio statistico più appropriato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

Non ci sono nessun conflitti di interesse di dichiarare.

In questo protocollo, descriviamo una tecnica novella di ibridazione in situ per fette di cervello fresco congelato per valutare l'espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l'espressione di tirosina idrossilasi (TH) in regione della substantia nigra (SNR). Forniamo anche i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: "discreto punto" o "cluster".
I passaggi critici per un'analisi di fluorescenza multisala successo RNA in situ di ibridazi...

Disfunzione del sistema della dopamina striatale è coinvolto nella progressione dei sintomi clinici osservati nelle malattie neurocognitive multiple. I ricevitori della dopamina D1 sono presenti nella corteccia prefrontale (PFC) e regioni striatal del cervello e influenzano pesantemente i processi cognitivi1, compreso il funzionamento memoria, elaborazione temporale e comportamento locomotiva2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. precedenti studi chiarito che le modifiche dei ricevitori della dopamina D1 sono state associate con la progressione di attenzione iperattività di deficit disorder (ADHD)8, i sintomi neurocognitivi nella schizofrenia9, 10 e lo stress suscettibilità11. In particolare, nella schizofrenia, tomografia a emissione di positroni (PET) studi hanno indicato che la capacità di legame dei recettori D1 della dopamina nelle cortecce prefrontali era altamente relative al deficit cognitivi e la presenza di sintomi negativi11. La crescita dendritica dei neuroni eccitatori nella corteccia prefrontale regolato dal recettore della dopamina D1 allevia lo stress suscettibilità. Inoltre, l'atterramento del recettore D1 in neuroni corticali prefrontale mediale (mPFC) potrebbe migliorare la sconfitta sociale indotta da stress sociale evitare12.
Qui, presentiamo una nuova tecnica di RNA in situ ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in una cella con campioni di tessuto fresco congelato. La tecnica attuale ha molteplici vantaggi rispetto ai metodi che esistono all'interno della letteratura corrente. In primo luogo, l'attuale procedura per mantenere il contesto spaziale e morfologico del tessuto ed è stata effettuata su campioni di tessuto fresco congelato affinché altre procedure che richiedono fresco, non incorporati tessuti possono essere combinati con i metodi attuali. Procedure analoghe nei tessuti formalina-fisso e paraffina-incastonati hanno illustrato che risoluzione singola trascrizione può essere realizzato usando un RNA in situ ibridazione tecnica13. Rilevamento del RNA a livello di singola trascrizione fornisce una sensibilità superiore alla espressione di numero di copia basso così come l'opportunità di confrontare l'espressione genica a livello di singole cellule che non possono essere raggiunti da altri metodi di rilevazione dell'acido nucleico, quali tecniche di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Inoltre, il metodo corrente mantiene immagini con un elevato rapporto segnale-rumore attraverso le sonde del RNA altamente specifiche che sono ibridate di trascritti di RNA bersaglio singolo e associate in sequenza con una cascata di molecole di amplificazione del segnale nella rilevazione sistema. Infine, l'attuale tecnologia offre l'opportunità di valutare più sistemi biologici con sue sonde proprietarie di target-specifici, piuttosto che limitare la nostra ricerca ad una sola classe di indicatori relativi al sistema quali il rilevamento di proteine di metodi di esame immuno-istochimico.
Nel nostro studio, abbiamo usato questa romanzo ibridazione in situ per RNA per valutare l'espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l'espressione di tirosina idrossilasi (TH) nella substantia nigra (SNR) dei ratti F344/N sia maschili che femminili. L'innovativo ibridazione in situ per RNA permesso di studiare i meccanismi che influenzano sia DA assorbimento e rilascio di DA simultaneamente, migliorando la nostra comprensione della complessità del sistema striatal del DA. Qui, descriviamo la procedura per fette di cervello fresco-congelato e fornire i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: "discreto punto" o "cluster".

<table><tbody><tr><td>Sistema di forni HybEZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope - Rn-DRD1A</td><td>Diagnostica cellulare avanzata&nbsp;</td><td>317031</td><td>Sonda RNAscope verde canale 1</td></tr><tr><td>a colori - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Canale colore 2,</td></tr><tr><td>RNAscope arancione Kit di reagenti multiplex fluorescenti</td><td>Diagnostica cellulare avanzata&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Penna Barriera Idrofobica</td><td>Vettore Laboratorio</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Vetrini</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek verticale 24 vetrini</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Piatto colorante Tissue-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Baths</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pretrattamento 4</td><td>Diagnostica cellulare avanzata&nbsp;</td><td>320850</td><td>parti di kit</td></tr><tr><td>Reagente anti-sbiadimento ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>parti di kit</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>parti di kit</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>parti di kit</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>parti di kit</td></tr><tr><td>pacchetto software EZ-C1</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>versione 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>versione 9.4</td></tr></tbody></table>

identificazione della dopamina d1-alfa del ricevitore all'interno del roditore nucleus accumbens da un innovativo rna in situ detection technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Nel sistema nervoso centrale, il recettore di sottotipo D1-alfa (Drd1α) è il più abbondante recettore della dopamina (DA), che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dello sviluppo e crescita neuronale. Tuttavia, i meccanismi alla base di Drd1α anomalie di recettori che mediano le risposte comportamentali e modulazione della funzione di memoria di lavoro sono ancora poco chiari. Usando un romanzo RNA in situ ibridazione analisi, lo studio corrente ha identificato dopamina Drd1α del recettore e la tirosina idrossilasi (TH) espressione del RNA da correlati DA circuiti nella zona di nucleo accumbens (NAc) e regione di substantia nigra (SNR), rispettivamente. Drd1α espressione nel NAc Mostra un "discreto punto" modello di macchiatura. Sono state osservate differenze di sesso chiaro nell'espressione di Drd1α. Al contrario, TH Mostra un pattern di colorazione "cluster". Per quanto riguarda l'espressione TH, ratti femminili visualizzata un' più alta espressione di segnale per cella rispetto gli animali maschii. I metodi presentati qui forniscano una tecnica di romanzo in situ di ibridazione per indagare i cambiamenti nella disfunzione del sistema della dopamina durante la progressione di malattie del sistema nervoso centrale.

Lo studio corrente ha osservato un "punti discreti" metodo di colorazione per l'espressione di RNA nei recettori della dopamina D1-alfa (Drd1α) del NAc in ratti F344/N (Figura 1A). Segnali di fluorescenza individuali sono stati identificati facilmente e possono essere visto come unica "puntini", ognuno dei quali rappresenta una singola trascrizione di RNA all'interno della cellula. Per le immagini da NAc che visualizzano i "puntini discreti" modello di macchi...

Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

L'obiettivo generale di questo nuovo test di ibridazione in situ dell'RNA è quello di visualizzare singole molecole di RNA in una specifica area cerebrale che sono fondamentali per chiarire la disfunzione dopaminergica durante la malattia del sistema nervoso centrale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come le anomalie dopaminergiche, la mediazione delle risposte comportamentali e la modulazione della funzione della memoria di lavoro. Il vantaggio principale di questo metodo è che fornisce una nuova tecnica di ibridazione in situ per studiare la disfunzione del sistema della dopamina durante la progressione delle malattie del sistema nervoso centrale.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui livelli di espressione complessivi di un mRNA bersaglio in una data regione del cervello, può anche essere applicato per determinare come i trascritti di mRNA sono distribuiti tra le cellule di una data regione. Per iniziare questa procedura, entro cinque minuti dalla raccolta di un cervello di ratto adulto, immergerlo in azoto liquido per 15 secondi. Successivamente, equilibra il cervello a meno 20 gradi Celsius in un criostato per

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Questo video mostra l'impianto di elettrodi e cannule in un ratto anestetizzato per misurare il rilascio di dopamina nel nucleo accumbens utilizzando un potenziostato e l'infusione di farmaci per modulare l'attività dopaminergica nell'area tegmentale ventrale.

Monitoraggio del rilascio di dopamina in un modello di ratto con manipolazione del recettore dei neuroni dopaminergici VTA

Questo video mostra il rilevamento della sintesi dell'RNA del recettore della serotonina utilizzando sonde oligonucleotidiche nel tessuto cerebrale di ratto affetto da sindrome serotoninergica. Il protocollo include il pretrattamento tissutale, l'ibridazione della sonda e il rilevamento enzimatico per visualizzare e quantificare l'espressione dell'RNA del recettore della serotonina al microscopio.

Ibridazione in situ mediante sonde oligonucleotidiche per studiare l'espressione dell'RNA in sezioni cerebrali di ratto

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in Drosophila melanogaster

L'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici o l'area tegmentale ventrale con immunoistochimica diretta o indiretta è dimostrata tramite microdissezione laser. Parametri per isolamento di tessuto da un vetrino utilizzando un laser a infrarossi e da diapositive membrana utilizzando la combinazione di un laser infrarosso ed ultravioletto sono discussi.

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione, il rilevamento, l'analisi e il monitoraggio del traffico di mRNA endogeno nel vivo Drosophila melanogaster camera d'uovo utilizzando fari molecolari, microscopia confocale del disco rotante, e analisi open-source software.

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.

Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini

L'ibridazione multiplex in situ (ISH) è stata impiegata per visualizzare simultaneamente i trascritti per due recettori accoppiati a proteine G e un fattore di trascrizione nell'intero complesso gangliare vagale del topo adulto. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.

Rilevazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G nei neuroni afferenti vagali di topo utilizzando l'ibridazione multiplex in situ

Questo studio presenta un metodo robusto per isolare gli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi, permettendo la separazione totale tra neuroni e neuriti e la purificazione dell'RNA. Combinato con RTddPCR, l'approccio consente la quantificazione assoluta di trascritti a bassa copia, facilitando studi sul trasporto e la traduzione locale dell'mRNA con alta sensibilità, riproducibilità e ampia applicabilità sperimentale.

Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR

Scopri una nuova tecnica di ibridazione in situ RNA per visualizzare molecole singole nel nucleus accumbens di ratti adulti. Questo metodo consente di studiare l'espressione del recettore D1-alpha e le differenze sessuali nella funzione dopaminergica.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore allinterno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology (Video) | JoVE Journal

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

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