Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

L'obiettivo generale di questo nuovo test di ibridazione in situ dell'RNA è quello di visualizzare singole molecole di RNA in una specifica area cerebrale che sono fondamentali per chiarire la disfunzione dopaminergica durante la malattia del sistema nervoso centrale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come le anomalie dopaminergiche, la mediazione delle risposte comportamentali e la modulazione della funzione della memoria di lavoro. Il vantaggio principale di questo metodo è che fornisce una nuova tecnica di ibridazione in situ per studiare la disfunzione del sistema della dopamina durante la progressione delle malattie del sistema nervoso centrale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui livelli di espressione complessivi di un mRNA bersaglio in una data regione del cervello, può anche essere applicato per determinare come i trascritti di mRNA sono distribuiti tra le cellule di una data regione. Per iniziare questa procedura, entro cinque minuti dalla raccolta di un cervello di ratto adulto, immergerlo in azoto liquido per 15 secondi. Successivamente, equilibra il cervello a meno 20 gradi Celsius in un criostato per un'ora.

Dopo un'ora, tagliare sezioni di 30 micron contenenti nucleus accumbens da 2,76 millimetri a 2,28 millimetri anteriormente al bregma e montarle sui vetrini. Quindi asciugare le sezioni a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, immergere i vetrini in paraformaldeide pre-raffreddata al 4% per un'ora a quattro gradi Celsius.

Quindi, posizionare i vetrini in un gradiente crescente di etanolo a temperatura ambiente, quindi trasferire i vetrini in etanolo fresco al 100% per altri cinque minuti. Successivamente, posizionare i vetrini sulla carta assorbente per consentire l'asciugatura all'aria. Disegna una barriera attorno a ogni sezione con una penna barriera.

Lasciare asciugare completamente la barriera per un minuto. Per pretrattare le sezioni cerebrali, accendi il forno e imposta la temperatura a 40 gradi Celsius. Aggiungere tre gocce di reagente pre-trattamento su ciascuna sezione del cervello.

Quindi incubare le sezioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, immergere i vetrini in 1X PBS per un minuto a temperatura ambiente e trasferire i vetrini in 1X PBS fresco per un altro minuto. Le diapositive non devono rimanere in 1X PBS per più di 15 minuti.

Per eseguire il test multiplex, riscaldare la sonda target per 10 minuti a 40 gradi Celsius in un bagno d'acqua e quindi raffreddarla a temperatura ambiente. Posizionare il reagente RNA a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini con carta assorbente e riposizionarli sulla griglia dei vetrini.

Quindi aggiungere tre gocce di Drd1alpha come sonda su ogni fetta del campione e incubare i campioni per due ore a 40 gradi Celsius. Successivamente, lavare due volte i vetrini con un tampone di lavaggio 1X per due minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini con carta assorbente e riposizionarli sul rack dei vetrini.

Non lasciare che le sezioni cerebrali si asciughino tra le fasi di incubazione. Aggiungere tre gocce di AMP 1FL su ciascuna fetta del campione e incubare i campioni per 30 minuti a 40 gradi Celsius. Successivamente, lavare i vetrini due volte in un tampone di lavaggio 1X per due minuti ogni volta a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini con carta assorbente e riposizionarli sul rack dei vetrini. Successivamente, aggiungere tre gocce di AMP 2FL su ciascuna fetta di campione. Incubare i campioni per 15 minuti a 40 gradi Celsius.

Quindi, immergere i vetrini nel tampone di lavaggio 1X per due minuti a temperatura ambiente due volte. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini con carta assorbente e riposizionarli sulla griglia dei vetrini. Aggiungere tre gocce di AMP 3FL su ciascuna fetta di campione e incubare i campioni per 30 minuti a 40 gradi Celsius.

Quindi, lavare i vetrini in un tampone di lavaggio 1X per due minuti a temperatura ambiente due volte. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini con carta assorbente e riposizionarli sulla griglia dei vetrini. Quindi aggiungere tre gocce di AMP 4FL ALT A su ciascuna fetta del campione e incubare i campioni per 15 minuti a 40 gradi Celsius.

Lavare due volte il vetrino in un tampone di lavaggio 1X per due minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini e posizionare immediatamente due gocce di reagente di montaggio su ciascuna sezione. Quindi, posiziona un vetrino coprioggetti di 22 millimetri per 22 millimetri su ciascuna sezione del cervello.

Quindi conservare i vetrini al buio a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius fino a quando non sono asciutti. Per l'imaging, accendere il microscopio confocale e passare a un obiettivo 60X. Ottieni immagini dello stack Z e acquisisci immagini di cellule marcate con Drd1alfa nella regione del nucleo accumbens.

Per le immagini del nucleo accumbens che mostravano il modello di colorazione a punti discreti, l'intervallo dinamico di espressione è stato valutato utilizzando un'analisi semiquantitativa. Ad ogni cella è stato assegnato un punteggio da zero a nove in base al numero di punti per cella. Questo metodo di punteggio del segnale ibridato può quindi valutare l'estensione e la variabilità dell'espressione di Drd1alfa nelle singole cellule.

Ecco le immagini confocali rappresentative dell'espressione di Drd1alfa nei ratti maschi e femmine che hanno il modello di colorazione a punti discreti. Per tenere conto della struttura dei dati nidificati, sono stati calcolati i valori medi di conteggio per ciascuna categoria e utilizzati per l'analisi statistica. È stato condotto un test U di Mann-Whitney per valutare le differenze nella conta cellulare mediana nei ratti maschi e femmine.

La frequenza delle celle in ciascuna categoria viene analizzata utilizzando la frequenza relativa e la frequenza cumulativa. Le femmine hanno mostrato un cambiamento significativo nella distribuzione con la maggiore frequenza di cellule nelle categorie di ordine inferiore rispetto agli animali maschi. Nel complesso, i risultati suggeriscono chiare differenze di sesso nell'espressione di Drd1alfa nel nucleo accumbens.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente poiché i cambiamenti di temperatura o l'essiccazione del tessuto possono danneggiare l'mRNA e ostacolare la nostra capacità di ottenere un segnale affidabile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la tecnica di ibridazione in situ nei tessuti corticali, visualizzare in modo fluorescente i trascritti di mRNA del segnale all'interno di regioni cerebrali selezionate e caratterizzare la distribuzione dei trascritti di mRNA per l'analisi statistica.