Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere l'impatto delle sostanze tossiche sulla fitness nelle diverse fasi dello sviluppo ed esaminare l'effetto dell'esposizione agli inquinanti attraverso le generazioni. A dimostrare la procedura saranno due studenti universitari nel mio laboratorio di ricerca che fanno parte delle comunità per costruire un impegno attivo nelle discipline stem presso la Colorado State University Pueblo, Hugh Long e Tyler Harvey. Per iniziare a lavorare con un contaminante ambientale di interesse, determinare prima la dose letale del 50% del composto Drosofilia.

Utilizzare metodi consolidati per creare una curva dose-risposta. Successivamente, preparare il terreno di coltura con il composto alla concentrazione desiderata. Ad esempio, aggiungere il composto nell'aliquota dell'acqua quando si prepara il mezzo istantaneo.

In parallelo, rendere il mezzo di controllo senza il composto aggiunto. Per impostare la coltura da cui raccogliere gli animali da esperimento, trasferire gli adulti riproduttivi nel terreno di coltura utilizzando metodi standard. Standardizzare il numero di mosche per fiala ed evitare il sovraffollamento degli adulti.

Quindi, incubare le mosche in condizioni standard da uno a quattro giorni. Dopo l'incubazione, scartare gli adulti, lasciando le uova fecondate a maturare per il test. Quindi, rimettere le fiale nell'incubatrice.

L'esposizione può essere impostata in qualsiasi fase dello sviluppo. Inoltre, i soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase di sviluppo a seconda degli obiettivi sperimentali. Controlla quotidianamente gli animali in via di sviluppo per identificare il primo segno dello stadio di interesse, come le larve vaganti del terzo stadio.

Per testare gli effetti dell'esposizione allo stadio di larve erranti del terzo stadio, raccogliere le larve entro un'ora dall'accensione delle luci, quando iniziano a emergere dal substrato alimentare. Quindi, versa l'acqua e sposta le larve in un fazzoletto di laboratorio per rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso. Una volta asciugate, trasferire le larve nelle apposite provette per la raccolta.

Per testare gli effetti dell'esposizione sugli adulti, raccogliere gli adulti appena chiusi; L'anestesia con anidride carbonica va bene. Assicurati di raccogliere le mosche prima che siano mature dal punto di vista riproduttivo e inizino l'accoppiamento. Dividi i moscerini in gruppi specifici per sesso e trasferiscili in fiale caricate con il mezzo di controllo o contaminato sperimentale in modo che corrispondano all'esposizione preesistente.

Successivamente, 24 ore prima di misurare i contaminanti nelle mosche adulte, trasferire gli adulti sia nel terreno di controllo che in quello contaminato in una fiala caricata con il mezzo di controllo per consentire agli adulti di rimuovere il terreno in eccesso dai loro corpi. Dopo 24 ore di toelettatura, le mosche possono essere testate utilizzando il metodo appropriato. Ad esempio, i cambiamenti comportamentali possono essere testati utilizzando un saggio di scelta dell'accoppiamento.

Utilizzando questi metodi, gli studi sugli effetti transgenerazionali dell'esposizione ai contaminanti sono molto facili. È sufficiente impostare gli incroci tra adulti esposti sul terreno di controllo e studiare gli effetti dell'esposizione a Fnot sulla loro progenie. Questo protocollo è stato utilizzato per valutare l'accumulo, l'eliminazione e il sequestro del piombo all'interno della stessa generazione di prole.

La Drosophila accumulava facilmente piombo a diverse dosi, stadi di sviluppo e scale evolutive. Utilizzando un'esposizione multigenerazionale, è stato riscontrato che l'esposizione dei genitori non viene trasmessa alla prima generazione di prole adulta. Pertanto, utilizzando questo protocollo, è possibile testare le risposte adattative a diverse scale evolutive, nonché gli effetti transgenerazionali Fnot di esposizione.

Successivamente, le mosche sono state allevate dallo stadio di uovo all'età adulta con terreno di controllo o con piombo e testate dopo 24 ore di depurazione, è stata testata la preferenza del compagno. Le femmine sono state allevate con un terreno piombato, accoppiate preferenzialmente con maschi esposti al piombo rispetto ai maschi esposti al controllo. D'altra parte, i maschi non hanno mostrato lo stesso pregiudizio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allevare e raccogliere la Drosophila per rispondere a varie domande e tossicologia. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in uno o due mesi se viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare delicatamente le mosche, in modo da non indurre stress inutili.

Seguendo questa procedura, è possibile testare altre domande come quelle comportamentali, genetiche e neurologiche. Non dimenticare che lavorare con i contaminanti può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale e preparare contaminanti in un cappuccio.