Name: Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri un metodo di microscopia a fluorescenza senza etichette per analizzare la microarchitettura di collagene ed elastina nelle arterie di resistenza umane sotto pressione. Questa tecnica consente di studiare la biomeccanica vascolare in vivo.

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Gli autori ringraziano il centro di Imaging biomedico di danese molecolare presso la facoltà di scienze naturali, Università della Danimarca meridionale, per l'utilizzo di laboratori e microscopi. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior sono riconosciuti per l'eccellente assistenza tecnica con la pressione myography e imaging.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo lavoro rappresenta la nostra proposta per un standardizzato combinato imaging e pressione myography approccio, prezioso per la valutazione simultanea delle proprietà meccaniche di resistenza arterie e pressione relativi cambiamenti nella struttura dell'arterioso parete in un intervallo di pressione da 0 a 100 mmHg. L'approccio presentato è stato sviluppato utilizzando attrezzature costruzione personalizzata, tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi myograph di pressione che si inserisce su un microscopio di fluor...

Il contributo patogeno e gli effetti della resistenza dell'arteria rimodellamento sono documentati nell'ipertensione essenziale, diabete e sindrome metabolica1,2,3,4,5. Decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare è essenziale per lo sviluppo di modelli matematici di questa associazione. Tali modelli miglioreranno la comprensione del processo di rimodellamento e sosterranno lo sviluppo di modelli di silico utile per testare strategie farmacologiche malattia targeting relativo rimodellamento della parete arteriosa.
Precedenti studi focalizzati a comprendere come la microarchitettura della parete arteriosa si riferisce alla meccanica della parete arteriosa incorporando misure meccaniche e la microarchitettura della matrice extracellulare (ECM) vengono eseguite quasi esclusivamente su grande , le arterie elastiche condotto da topi o suina6,7,8,9,10,11. Formazione immagine di microstrutture della parete viene in genere eseguita utilizzando tecniche ottiche non lineari, approfittando del autofluorescence di elastina e di generazione di seconda armonica da collagene. In questo modo spatiotemporal imaging dei due componenti principali della matrice extracellulare, elastina e collagene, senza la necessità di macchiatura. Imaging della parete arteriosa in tutto il suo spessore è una sfida nelle arterie di grande condotto a causa di dispersione della luce nella spessa tunica media. Tuttavia, per determinare la correlazione tra la microarchitettura delle componenti strutturali della parete arteriosa e le proprietà meccaniche osservate, informazioni tridimensionali devono essere ottenuti durante le prove meccaniche. Per grandi arterie come l'aorta umana, questo richiede montaggio biassiale, prove meccaniche e imaging delle regioni di interesse in pezzi di2 : 1-2 cm della parete arteriosa7,9,10, 12. solo una parte del muro può essere imaged e meccanicamente testata.
Per più piccole arterie di qualsiasi specie (ad es., pericardico umano13, polmonare14 e sottocutaneo15 arterie, ratto arterie mesenteriche16,17,18, 19 , 20, mouse cremaster, mesenterico, cerebrale, femorale e arterie carotiche21,22,23,24,25,26, 27) imaging dello spessore della parete intera è possibile e può essere combinato con prove meccaniche. Questo permette la registrazione simultanea di proprietà meccaniche e i dispositivi strutturali all'interno della parete. Tuttavia, una modellazione matematica diretta della relazione tra le alterazioni osservate nella struttura tridimensionale della ECM e cambiato proprietà meccaniche della parete arteriosa resistenza, è al meglio della nostra conoscenza solo stato segnalato su recentemente in resistenza umana arterie13,15.
In questo lavoro, è descritto un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e formazione immagine tridimensionale simultanea della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per ottenere misure di angoli ramificazione lamina elastica interna e collagene adventitial rettilineità13 utilizzando Fiji28. Densità di volume di collagene ed elastina sono determinati utilizzando Ilastik software29 e infine, l'inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa.
L'obiettivo di descrivere le analisi di imaging e immagine tecniche in combinazione con modellazione matematica è quello di fornire gli investigatori un approccio sistematico per descrivere e comprendere osservato cambiamenti di pressione indotta nel ECM di arterie di resistenza. Il metodo descritto è focalizzato nel quantificare i cambiamenti in ECM in una nave durante la pressurizzazione, confrontando la struttura dell'ECM a 20, 40 e 100 mmHg. Queste pressioni sono stati scelti per la determinazione della struttura della parete arteriosa al suo più compatibile (20 mmHg), rigido (100 mmHg) e stato intermedio (40 mmHg), rispettivamente. Tuttavia, qualsiasi processo nella parete vascolare delle arterie dal vivo, tra cui i cambiamenti indotti da componenti vasoattivi, isteresi e flusso, può essere quantificato, a seconda l'ipotesi di ricerca in questione dallo sperimentatore.
L'uso di microscopia di fluorescenza del due-fotone eccitazione (TPEM) in combinazione con un myograph di pressione per lo studio di pressione (o altro) ha indotto cambiamenti in ECM delle arterie dal vivo è data risalto a. In primo luogo, perché questo consente acquisizione simultanea della struttura nel complesso tridimensionale della parete arteriosa (diametro e spessore della parete) con acquisizione tridimensionale privo di etichetta di alta qualità, immagini del collagene e dell'elastina dettagliate microarchitetture come descritto13 sfruttando l'autofluorescenza di elastina e collagene seconda generazione armonica segnale (SHG)30. In secondo luogo, TPEM consente è consentito l'uso della luce di eccitazione di bassa energia vicino infrarosso, minimizzando photodamage di tessuti e dunque, formazione immagine ripetuta esattamente nella stessa posizione all'interno della parete vascolare, che consente analisi di misure ripetute di osservato modifiche.
L'uso di un approccio alternativo usando la formazione immagine confocal di pressione fissata arterie è discusso per consentire agli utenti senza accesso ai TPEM l'opportunità di utilizzare il metodo descritto pure. Informazioni sulla densità di struttura e volume di ECM possono essere recuperate anche dalle analisi bidimensionale dei tessuti sezionati in serie, ad esempio come descritto da31,32. Tuttavia, a causa della mancanza di possibilità di recuperare informazioni strutturali tridimensionali sopra le scale di lunghezza dell'arteria, così come durante il cambiamento delle condizioni di utilizzo di questo metodo, si consiglia di non utilizzare questo approccio per le indagini di pressione e il trattamento ha indotto cambiamenti tridimensionale in ECM.
Il requisito minimo per l'investigatore applicare il metodo qui descritto è l'accesso a un programma di installazione per inserimento di una canula e pressurizzazione delle arterie in combinazione con un microscopio a fluorescenza confocale o due-fotone eccitazione. Il programma di installazione descritto nel protocollo seguente è un myograph di pressione su misura con un trasduttore di forza longitudinale, costruito per adattarsi su un microscopio di fluorescenza di eccitazione del due-fotone costruito su ordinazione invertito.

<table><tbody><tr><td>Strumenti di Fine Science</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di Fine Science</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>761028</td><td>per dissezione</td><td></td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Danimarca</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths medical Intl, Regno Unito</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom built</td><td></td><td>DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>Mettler toledo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Danimarca</td><td>1.00496.9010</td><td>Fosfato tamponato (pH 6,9) Soluzione di formaldeide al 4%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>P9666</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tocris Bioscience, Bristol, Regno Unito</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Physics, Mountain View, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersione) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Danimarca</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Germania).</td><td>ChromaET 460 nm passa-lungo passamento dicroico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Germania).</td><td>Filtro Semrock FF01-520/35-25 BrightLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Germania).</td><td>Chroma ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr> Lo spessore del vetrino coprioggetti <tr><td>Scotch TM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>deve corrispondere all'obiettivo utilizzato sul microscopio (#1 o #1,5), in alternativa, impostare il collare di regolazione in modo che corrisponda al vetrino</td><td></td><td></td> coprioggetti</tr></tbody></table>

valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Il contributo di patogeno della resistenza dell'arteria rimodellamento è documentato nell'ipertensione essenziale, il diabete e la sindrome metabolica. Le indagini e lo sviluppo di modelli matematici microstructurally motivati per comprendere le proprietà meccaniche delle arterie di resistenza umana nella salute e nella malattia hanno il potenziale per aiutare la comprensione come malattia e trattamenti medici influenzare la microcircolazione umana. Per sviluppare questi modelli matematici, è essenziale per decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare. In questo lavoro, descriviamo un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e simultaneo imaging tridimensionale privo di etichetta della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per quantificare le modifiche i) pressione indotta in angoli ramificazione lamina elastica interna e rettilineità adventitial collagene utilizzando Fiji e densità di volume ii) collagene ed elastina determinato utilizzando il software Ilastik. Preferibilmente tutte le misure di formazione immagine e meccaniche vengono eseguite sulle arterie live, irrorate, tuttavia, è un approccio alternativo utilizzando pressione standard video-microscopia myography in combinazione con post-fissazione formazione immagine dei vasi ri-pressurizzati discussi. Questo metodo alternativo fornisce agli utenti con diverse opzioni per approcci di analisi. L'inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa, e lo sviluppo futuro e aggiunte al protocollo sono proposti.

Il myograph di pressione su misura per l'imaging utilizzato in questo lavoro è illustrato nella Figura 1. Un'attenzione particolare per la progettazione del myograph è stata pagata ai) camera con un piccolo volume (2 mL) e ii) la possibilità di posizionamento cannule vicino a e in parallelo con il fondo di vetro (Figura 1B). Parte inferiore della camera di misura 50 × 24 mm #1.5 vetrino coprioggetti (sostituibile). Il regolatore ...

Descriviamo le prove meccaniche simultanea e live imaging 3D della parete arteriosa di isolato, arterie di resistenza umana e Fiji e Ilastik analisi di immagine per la quantificazione di elastina e collagene densità di volume e di organizzazione spaziale. Discutiamo l'uso di questi dati in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa.

Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di fornire una procedura standardizzata per ottenere immagini di arterie di resistenza umane vive per l'analisi della relazione tra la microarchitettura della matrice extracellulare e la meccanica della parete arteriosa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia e nella meccanica vascolare, come il modo in cui la pressione induce cambiamenti nella geometria complessiva e nella microarchitettura della parete vascolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è necessario etichettare il campione per l'imaging.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla meccanica dell'arteria di resistenza, una versione modificata del protocollo può essere applicata ad altri organi tubolari come i bronchi o a strisce dalla vescica umana o dalla parete intestinale. Per iniziare, raccogliere campioni di tessuto di interesse immediatamente dopo la loro escissione durante l'intervento chirurgico e preparare i vasi come descritto nel protocollo di testo allegato. Pressurizzare un'arteria cannulata a cinque millimetri di mercurio.Quindi impostare il percorso ottico per l'imaging attivando il laser a due fotoni e impostando la lunghezza d'onda di eccitazione a 820 nanometri. Inserire uno specchio dicroico a passaggio lungo da 460 nanometri per dividere la luce di emissione tra i fotomoltiplicatori e raccogliere l'emissione contemporaneamente in due canali. Utilizzare filtri passa-banda larghi da 30 a 60 nanometri centrati a 520 nanometri per raccogliere l'autofluorescenza dell'elastina e un altro centrato a 410 nanometri per raccogliere il segnale di generazione della seconda armonica del collagene.Ora imposta il tempo di permanenza del laser e i pixel su 10 microsecondi. Impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel per il campo visivo del 100%. Abilita la scansione continua e utilizza il più basso possibile la potenza della luce di eccitazione e il tempo di permanenza dei pixel per evitare che le foto danneggino l'arteria in tensione.Quindi scansiona manualmente l'arteria per trovare l'aereo con il diametro massimo. Quindi, scegli una fetta rettangolare che copra il diametro più largo dell'arteria e scansiona un singolo fotogramma con una dimensione dei pixel di 300 nanometri per pixel o meno. Salvare questa immagine per l'analisi in un secondo momento.Per determinare il diametro del lume e lo spessore della parete al diametro massimo dell'arteria, caricare prima l'immagine nelle Fiji. Imposta la scala facendo clic sul menu principale e quindi vai su analizza seguito da imposta scala. Qui inserisci il micrometro per pixel e il rapporto pixel.Quindi, scegli lo strumento Linea Fiji e traccia una linea tra le due lamina elastica interna su ciascun lato del lume arterioso. Quindi fare clic su Control M per riportare la lunghezza nella tabella dei risultati. Continua a tracciare più linee per misurare lo spessore di ogni parete e salvare la misurazione finale.Passa a un obiettivo 60X con un'apertura numerica di uno o superiore. Immagina la microarchitettura del collagene e dell'elastina a cinque millimetri di mercurio scansionando l'intero spessore della parete arteriosa. Quindi, definisci la profondità iniziale e finale dello stack Z e la spaziatura dei passi Z e la densità dei pixel.Quando si progettano gli stack Z, assicurarsi che l'area di interesse sia sufficientemente piccola da evitare qualsiasi inferenza di curvatura nell'analisi successiva. Al termine, impostare ciascun canale da salvare separatamente. Infine, trova da una a tre diverse regioni di interesse e ottieni pile di immagini 3D di buona qualità.Se l'autofluorescenza dell'elastina è sbiancante, stai utilizzando una potenza luminosa di eccitazione troppo elevata. Questo dovrebbe essere evitato. Per completare l'esperimento in corso, è possibile aggiungere una concentrazione diluita di eosina per migliorare l'autofluorescenza dell'elastina.Al termine, ripetere l'intero processo a pressioni che variano fino a 100 millimetri di mercurio, sostituendo il tampone nella camera del miografo con un fresco HBS a 37 gradi Celsius dopo ogni fase di pressione. Per iniziare l'analisi dell'immagine, apri lo stack di immagini dell'elastina nelle Fiji. Quindi vai su immagine, fai clic su pile e seleziona Progetto Z per scegliere le immagini con cui lavorare e scegliere l'intensità massima per il tipo di proiezione.Salva la proiezione dell'intensità massima come immagine TIFF. Quindi scegli il maggior numero possibile di punti di ramificazione della fibra di lamina elastica interna e misurali utilizzando lo strumento angolare. Lavora sistematicamente su ogni immagine e, una volta terminato, salva il foglio dei risultati delle Figi.Per misurare l'ondulazione del collagene avventiziale, apri la pila di immagini del collagene nelle Fiji. Quindi, vai su immagine fino alle pile e seleziona Progetto Z per scegliere le immagini con cui lavorare e per impostare la proiezione dell'intensità massima. Ora cambia il tipo di immagine in un'immagine TIFF a otto bit facendo clic su immagine, tipo, quindi su otto bit.Salva la proiezione dell'intensità massima come immagine TIFF. Apri il plug-in Neuron J facendo clic su Fiji e selezionando Neuron J in plugin. Quindi apri il file TIFF a otto bit in Neuron J.Una volta aperto, fai clic su aggiungi tracciati e seleziona le fibre da analizzare facendo clic sull'inizio e sulla fine di ciascuna fibra.Quindi, vai a Traccia di misurazione e scegli Traccia visualizzazione e Misure dei vertici nella finestra di dialogo. Per calcolare la rettilineità delle fibre del collage, copiare prima i valori nella finestra Tracciati Fiji in Excel. I valori di lunghezza nella finestra dei tracciati sono misure dell'intera lunghezza delle fibre di collagene analizzate Lf.Secondo, copia per ogni fascio di fibre di collagene analizzato la prima e l'ultima coordinata XY della finestra dei vertici delle Figi per Excel.Quindi calcola la lunghezza della linea retta che collega ciascuna estremità della fibra di collagene analizzata L0 utilizzando il teorema di Pitagora. La rettilineità della fibra di collagene viene infine calcolata come L0/Lf. Seguendo il protocollo appena mostrato, è stata identificata la parte più larga dell'arteria e a questo punto l'arteria è stata scansionata utilizzando la microscopia a fluorescenza label-free per misurare il diametro massimo del vaso e lo spessore della parete del vaso.Utilizzando un ingrandimento più elevato per un obiettivo ad alta apertura numerica, è possibile misurare non solo il diametro del vaso e lo spessore della parete, ma anche le microarchitetture del collagene e dell'elastina. Le microarchitetture degli angoli di ramificazione delle fibre di elastina e la rettilineità del collagene possono essere determinate in sezioni consecutive dell'immagine utilizzando il software di analisi delle immagini appropriato. Ciò consente un'analisi diretta della relazione tra le variazioni indotte dalla pressione nelle microarchitetture del collagene e dell'elastina e il modulo elastico incrementale a pressioni diverse.Seguendo questa procedura, è possibile estrarre anche altre informazioni dalle immagini. Potrebbe trattarsi degli angeli di orientamento del collagene avventiziale lungo l'asse longitudinale del vaso o della microarchitettura della matrice extracellulare nella tunica media. Le misure quantitative estratte dalle immagini utilizzando questo metodo possono essere inserite in modelli matematici al fine di chiarire come la circolazione umana sana e quella deceduta rispondono a condizioni diverse.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una conoscenza approfondita di come progettare i tuoi esperimenti di imaging e la successiva analisi delle immagini al fine di estrarre informazioni su come la pressione induce cambiamenti nella microarchitettura della parete dell'arteria di resistenza. Ricorda che devi evitare qualsiasi esposizione alla luce visibile e invisibile quando lavori con la microscopia a fluorescenza a eccitazione a due fotoni.

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