Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di fornire una procedura standardizzata per ottenere immagini di arterie di resistenza umane vive per l'analisi della relazione tra la microarchitettura della matrice extracellulare e la meccanica della parete arteriosa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia e nella meccanica vascolare, come il modo in cui la pressione induce cambiamenti nella geometria complessiva e nella microarchitettura della parete vascolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è necessario etichettare il campione per l'imaging.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla meccanica dell'arteria di resistenza, una versione modificata del protocollo può essere applicata ad altri organi tubolari come i bronchi o a strisce dalla vescica umana o dalla parete intestinale. Per iniziare, raccogliere campioni di tessuto di interesse immediatamente dopo la loro escissione durante l'intervento chirurgico e preparare i vasi come descritto nel protocollo di testo allegato. Pressurizzare un'arteria cannulata a cinque millimetri di mercurio.

Quindi impostare il percorso ottico per l'imaging attivando il laser a due fotoni e impostando la lunghezza d'onda di eccitazione a 820 nanometri. Inserire uno specchio dicroico a passaggio lungo da 460 nanometri per dividere la luce di emissione tra i fotomoltiplicatori e raccogliere l'emissione contemporaneamente in due canali. Utilizzare filtri passa-banda larghi da 30 a 60 nanometri centrati a 520 nanometri per raccogliere l'autofluorescenza dell'elastina e un altro centrato a 410 nanometri per raccogliere il segnale di generazione della seconda armonica del collagene.

Ora imposta il tempo di permanenza del laser e i pixel su 10 microsecondi. Impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel per il campo visivo del 100%. Abilita la scansione continua e utilizza il più basso possibile la potenza della luce di eccitazione e il tempo di permanenza dei pixel per evitare che le foto danneggino l'arteria in tensione.

Quindi scansiona manualmente l'arteria per trovare l'aereo con il diametro massimo. Quindi, scegli una fetta rettangolare che copra il diametro più largo dell'arteria e scansiona un singolo fotogramma con una dimensione dei pixel di 300 nanometri per pixel o meno. Salvare questa immagine per l'analisi in un secondo momento.

Per determinare il diametro del lume e lo spessore della parete al diametro massimo dell'arteria, caricare prima l'immagine nelle Fiji. Imposta la scala facendo clic sul menu principale e quindi vai su analizza seguito da imposta scala. Qui inserisci il micrometro per pixel e il rapporto pixel.

Quindi, scegli lo strumento Linea Fiji e traccia una linea tra le due lamina elastica interna su ciascun lato del lume arterioso. Quindi fare clic su Control M per riportare la lunghezza nella tabella dei risultati. Continua a tracciare più linee per misurare lo spessore di ogni parete e salvare la misurazione finale.

Passa a un obiettivo 60X con un'apertura numerica di uno o superiore. Immagina la microarchitettura del collagene e dell'elastina a cinque millimetri di mercurio scansionando l'intero spessore della parete arteriosa. Quindi, definisci la profondità iniziale e finale dello stack Z e la spaziatura dei passi Z e la densità dei pixel.

Quando si progettano gli stack Z, assicurarsi che l'area di interesse sia sufficientemente piccola da evitare qualsiasi inferenza di curvatura nell'analisi successiva. Al termine, impostare ciascun canale da salvare separatamente. Infine, trova da una a tre diverse regioni di interesse e ottieni pile di immagini 3D di buona qualità.

Se l'autofluorescenza dell'elastina è sbiancante, stai utilizzando una potenza luminosa di eccitazione troppo elevata. Questo dovrebbe essere evitato. Per completare l'esperimento in corso, è possibile aggiungere una concentrazione diluita di eosina per migliorare l'autofluorescenza dell'elastina.

Al termine, ripetere l'intero processo a pressioni che variano fino a 100 millimetri di mercurio, sostituendo il tampone nella camera del miografo con un fresco HBS a 37 gradi Celsius dopo ogni fase di pressione. Per iniziare l'analisi dell'immagine, apri lo stack di immagini dell'elastina nelle Fiji. Quindi vai su immagine, fai clic su pile e seleziona Progetto Z per scegliere le immagini con cui lavorare e scegliere l'intensità massima per il tipo di proiezione.

Salva la proiezione dell'intensità massima come immagine TIFF. Quindi scegli il maggior numero possibile di punti di ramificazione della fibra di lamina elastica interna e misurali utilizzando lo strumento angolare. Lavora sistematicamente su ogni immagine e, una volta terminato, salva il foglio dei risultati delle Figi.

Per misurare l'ondulazione del collagene avventiziale, apri la pila di immagini del collagene nelle Fiji. Quindi, vai su immagine fino alle pile e seleziona Progetto Z per scegliere le immagini con cui lavorare e per impostare la proiezione dell'intensità massima. Ora cambia il tipo di immagine in un'immagine TIFF a otto bit facendo clic su immagine, tipo, quindi su otto bit.

Salva la proiezione dell'intensità massima come immagine TIFF. Apri il plug-in Neuron J facendo clic su Fiji e selezionando Neuron J in plugin. Quindi apri il file TIFF a otto bit in Neuron J.Una volta aperto, fai clic su aggiungi tracciati e seleziona le fibre da analizzare facendo clic sull'inizio e sulla fine di ciascuna fibra.

Quindi, vai a Traccia di misurazione e scegli Traccia visualizzazione e Misure dei vertici nella finestra di dialogo. Per calcolare la rettilineità delle fibre del collage, copiare prima i valori nella finestra Tracciati Fiji in Excel. I valori di lunghezza nella finestra dei tracciati sono misure dell'intera lunghezza delle fibre di collagene analizzate Lf.Secondo, copia per ogni fascio di fibre di collagene analizzato la prima e l'ultima coordinata XY della finestra dei vertici delle Figi per Excel.

Quindi calcola la lunghezza della linea retta che collega ciascuna estremità della fibra di collagene analizzata L0 utilizzando il teorema di Pitagora. La rettilineità della fibra di collagene viene infine calcolata come L0/Lf. Seguendo il protocollo appena mostrato, è stata identificata la parte più larga dell'arteria e a questo punto l'arteria è stata scansionata utilizzando la microscopia a fluorescenza label-free per misurare il diametro massimo del vaso e lo spessore della parete del vaso.

Utilizzando un ingrandimento più elevato per un obiettivo ad alta apertura numerica, è possibile misurare non solo il diametro del vaso e lo spessore della parete, ma anche le microarchitetture del collagene e dell'elastina. Le microarchitetture degli angoli di ramificazione delle fibre di elastina e la rettilineità del collagene possono essere determinate in sezioni consecutive dell'immagine utilizzando il software di analisi delle immagini appropriato. Ciò consente un'analisi diretta della relazione tra le variazioni indotte dalla pressione nelle microarchitetture del collagene e dell'elastina e il modulo elastico incrementale a pressioni diverse.

Seguendo questa procedura, è possibile estrarre anche altre informazioni dalle immagini. Potrebbe trattarsi degli angeli di orientamento del collagene avventiziale lungo l'asse longitudinale del vaso o della microarchitettura della matrice extracellulare nella tunica media. Le misure quantitative estratte dalle immagini utilizzando questo metodo possono essere inserite in modelli matematici al fine di chiarire come la circolazione umana sana e quella deceduta rispondono a condizioni diverse.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una conoscenza approfondita di come progettare i tuoi esperimenti di imaging e la successiva analisi delle immagini al fine di estrarre informazioni su come la pressione induce cambiamenti nella microarchitettura della parete dell'arteria di resistenza. Ricorda che devi evitare qualsiasi esposizione alla luce visibile e invisibile quando lavori con la microscopia a fluorescenza a eccitazione a due fotoni.