Immagine-Guida di resezione del Glioblastoma e l'impianto intracranico di terapeutica delle cellule staminali-seminato ponteggi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di resecare chirurgicamente il cancro al cervello nei topi e di impiantare un'impalcatura seminata con cellule staminali terapeutiche di homing tumorale nella cavità di resezione postoperatoria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia cellulare e della neuro-oncologia, come ad esempio il modo in cui la resezione chirurgica influisce sull'impianto cellulare nella cavità chirurgica, l'efficacia dei nuovi agenti terapeutici sul cancro cerebrale post-chirurgico e il modo in cui i sistemi di somministrazione basati su scaffold influenzano i risultati terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli interventi sul cancro al cervello possono essere studiati nei topi in un modo che imita da vicino lo standard clinico di cura nei pazienti umani.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla terapia con cellule staminali somministrata su scaffold, può essere applicato anche ad altri interventi, come nanoparticelle, piccole molecole, virus oncolitici o altre terapie emergenti. Preparare gli scaffold 48 ore prima dell'impianto nei topi tagliando prima gli scaffold in PLA in pezzi delle dimensioni di una cavità di resezione di circa due per due millimetri. Sterilizzare gli scaffold immergendoli in etanolo al 70% per 15 minuti.

Dopo 15 minuti, immergere gli scaffold in PBS. Quindi posizionare gli scaffold nel terreno di Eagle's modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina mentre si preparano le cellule per la semina. Per preparare le cellule, prima sollevare le MSC in coltura utilizzando lo 0,05% di tripsina.

Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, assicurarsi che le cellule si siano sollevate. Quindi aggiungere DMEM al pallone per inattivare la tripsina.

Quindi, trasferire il contenuto del pallone in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi pellettare cinque volte da 10 al quinto MSC per ogni impalcatura tramite centrifugazione a 100 volte g per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le MSC in cinque microlitri di DMEM per cinque volte 10 fino alla quinta cellula. Quindi rimuovere un'impalcatura dall'immersione in DMEM con una pinza e posizionarla sul coperchio della piastra a sei pozzetti. Solleva l'impalcatura dal coperchio, lasciando dietro di sé una goccia di DMEM in eccesso.

Riposizionare l'impalcatura sul coperchio in un luogo nuovo e asciutto. Ripeti da tre a cinque volte. Quindi posizionare l'impalcatura parzialmente essiccata in una nuova piastra a sei pozzetti per la semina.

Un'impalcatura parzialmente essiccata fornisce risultati ottimali di semina cellulare. Se l'impalcatura è troppo bagnata, le celle scivoleranno via dall'impalcatura e aderiranno alla piastra sottostante. Se l'impalcatura è troppo secca, la gocciolina non si diffonderà sull'intero impalcatura, con conseguente scarsa distribuzione iniziale delle cellule.

Usando una pipetta, mescolare delicatamente la provetta di MSC per omogeneizzare la sospensione, poiché alcune cellule potrebbero essersi depositate sul fondo. Pipettare lentamente 2,5 microlitri di sospensione di MSC appena miscelata direttamente sullo scaffold, creando una piccola gocciolina sopra lo scaffold. Aggiungere 300 microlitri di DMEM ai bordi di ciascun pozzetto per evitare la rapida evaporazione della gocciolina cellulare.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, consentendo alle cellule di attaccarsi all'impalcatura. Dopo l'incubazione, utilizzare una pinza per capovolgere delicatamente gli scaffold nella piastra a pozzetti. Semina 2,5 microlitri di sospensione di MSC appena miscelata per ottenere un totale di cinque volte 10 alla quinta cellula seminata per impalcatura.

Dopo un'incubazione di 30 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi all'impalcatura, coprire gli scaffold in DMEM aggiungendo due millilitri a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Sollevare delicatamente le impalcature per consentire ai fluidi di fluire sotto di esse. Incubare a 37 gradi Celsius in questo stato per 48 ore prima dell'intervento di impianto.

Inizia posizionando la cornice stereotassica sul tavolino di uno stereomicroscopio a fluorescenza da dissezione. Quindi fissare il topo anestetizzato nel telaio stereotassico con l'alimentazione continua di anestesia inalatoria tramite un adattatore per cono nasale in isoflurano. Mantenere la temperatura corporea con un termoforo.

Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza della cornea. Quindi sterilizzare il sito di incisione del cuoio capelluto con una serie di tre salviette alcoliche e tre salviette Betadine. Eseguire il test del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi su ciascun arto e confermare la risposta negativa per garantire una corretta anestesia.

Usando una pinza, pizzicare e sollevare delicatamente il cuoio capelluto. Dopo aver praticato un'incisione rostrale-caudale lineare della linea mediana con le forbici chirurgiche, irrigare il sito dell'incisione con PBS e rimuovere il grasso sottocutaneo con un applicatore a punta di cotone con un movimento circolare di spazzolatura. Disporre la pelle in modo che la finestra cranica precedentemente stabilita sia completamente visibile.

Usa un ago calibro 18 per perforare delicatamente la dura madre appena all'interno dei bordi della finestra cranica. Ripetere fino a quando l'incisione non traccia completamente l'interno della finestra. Rimuovere la dura madre staccandola con una pinza fine, rivelando il parenchima e il tumore sottostanti.

Quindi, abbassa le luci della stanza e attiva la modalità di fluorescenza dello stereomicroscopio. Localizzare il tumore U87 mCherry e lucciola che esprime la luciferasi. Caricare un puntale per pipetta da 200 microlitri all'estremità del tubo di una pompa per vuoto.

Quindi accendere la pompa del vuoto. Resecare il tumore aspirando delicatamente il tessuto fluorescente fino a quando non rimane alcun segnale. Per controllare l'emorragia, irrigare con PBS freddo e applicare una pressione costante con un applicatore con punta di cotone.

Utilizzare una combinazione di soluzione fisiologica, pressione costante con un applicatore con punta di cotone e/o un agente emostatico, come SURGICEL, per fermare l'emorragia prima di impiantare l'impalcatura. Se non lo si controlla adeguatamente, può formarsi un ematoma potenzialmente pericoloso. Dopo la resezione, spegnere la pompa del vuoto ed eliminare il puntale della pipetta.

Disattiva la fluorescenza e la stanza si illumina di nuovo. Immediatamente prima dell'impianto, immergere lentamente un'impalcatura in PLA seminata con MSC in PBS per rimuovere i terreni indesiderati e i componenti associati. Impiantare l'impalcatura nella cavità di resezione.

Se necessario, aggiungere un microlitro di fibrinogeno seguito da un microlitro di trombina per fissare l'impalcatura in posizione. Con la dura madre rimossa e il lembo osseo dalla finestra cranica già scartato, sigillare la ferita chiudendo la pelle e applicando la colla chirurgica. Rimuovere l'animale dall'anestetico inalato e lasciarlo riprendersi su una superficie riscaldata.

Queste immagini a contrasto di fase, fluorescenti e combinate mostrano cellule tumorali U87 ingegnerizzate con costrutti lentivirali per esprimere i marcatori di luciferasi mCherry e lucciola. Queste immagini a contrasto di fase, fluorescenti e combinate mostrano immagini corrispondenti di cellule staminali ingegnerizzate per esprimere la luciferasi diagnostica GFP-Renilla o la GFP-TRAIL terapeutica seminate sul materiale dell'impalcatura PLA. Questa immagine in campo chiaro e fluorescente mostra la posizione del tumore.

Qui si vede la cavità di resezione post-chirurgica con focolai tumorali residui. Questa immagine mostra l'impalcatura in PLA impiantata seminata con MSC-TRAIL. Qui, il tessuto cerebrale post-mortem è visibile con l'impalcatura sovrapposta.

Questa sovrapposizione fluorescente evidenzia le celle GFP-TRAIL. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti per ogni topo, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ci sarà una variabilità intrinseca nell'entità della resezione raggiunta da topo a topo, simile a quella che si vede nelle cliniche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una resezione chirurgica di un tumore cerebrale e valutarne l'impatto sugli interventi terapeutici che includono la terapia con cellule staminali basata su scaffold.