Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di assemblare e purificare prototipi di intasomi virali schiumosi che possono essere utilizzati per studi biochimici, strutturali e cinetici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della retrovirologia, come la meccanica e la dinamica dell'integrazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento di complessi di integrazione piuttosto che una miscela eterogenea di specie.

La dimostrazione visiva di questo metodo è vantaggiosa in quanto il recupero e la solubilizzazione dei complessi di integrazione sono fondamentali per garantire una resa ottimale dell'intasoma. Per iniziare, combina il tampone 1XTEN, 10 micromolari oligo-1 e 10 micromolari oligo-2 in un volume finale di 1,5 millilitri. Quindi, aliquotare 25 microlitri della miscela in 60 provette di reazione per il cambio della polimerasi da 0,2 millilitri.

Ricuocere il DNA utilizzando un termociclatore con i tempi e le temperature riportate nel protocollo di testo. Dopo la reazione, combinare le reazioni di ricottura di tutte le 60 provette. Quindi caricare 500 microlitri di due unità di concentrazione del filtro ultracentrifugo con taglio del peso molecolare da 0,5 millilitri e tre kilodalton.

Concentrare il DNA virale ricotto mediante centrifugazione in una microcentrifuga a 14.000 volte per g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver eliminato il flusso, aggiungere 250 microlitri del DNA virale ricotto rimanente in ciascuna unità filtrante. Ripetere la centrifuga fino a quando rimangono circa 50 microlitri e scartare il flusso.

Quindi, il bugger scambia il campione in tampone TE lavando tre volte con 450 microlitri di TE. Dopo la sostituzione del tampone, capovolgere l'unità filtro e centrifugare a 1000 volte g per due minuti a temperatura ambiente. Il volume finale di filtrazione per ciascuna unità filtrante deve essere di circa 50 microlitri. Unire i retentati e trasferirli in un tubo con tappo a vite da 1,5 millilitri.

Infine, misurare l'assorbanza ultravioletta di 260 nanometri del DNA virale per calcolare la concentrazione di DNA. Per assemblare gli intasomi, combinare 50 millimolari di bis-tris propano pH 7,5, 500 millimolare di cloruro di sodio, 120 micromolari di PFV integrasi e 50 micromolari di DNA virale in un volume totale di 150 microlitri. Pulire un pezzo lungo 10 centimetri di diametro da sei a otto kilodalton di tubo per dialisi con taglio del peso molecolare e le clip associate con acqua distillata doppia o con l'acqua con la massima purezza disponibile.

Agganciare un'estremità del tubo, sciacquare l'interno del tubo per dialisi tre volte con uno o due millimetri di tampone di risciacquo. Rimuovere la maggior parte possibile del tampone di risciacquo con la pipetta e il puntale di caricamento del gel sottile. Quindi, trasferire il gruppo intasome nel tubo di dialisi con la pipetta e un sottile puntale di caricamento del gel.

Assicurarsi che il gruppo venga espulso direttamente nella parte inferiore del tubo di dialisi. Agganciare l'estremità aperta del tubo per dialisi, riducendo al minimo la quantità di aria introdotta all'interno del tubo. Quindi posizionare il tubo nel tampone per dialisi.

Dializzare durante la notte con agitazioni delicate in modo che il tubo ruoti ma non sia in un vortice. Assicurarsi che il tubo per dialisi sia sommerso e mobile. Dopo circa un'ora, il precipitato dovrebbe essere visibile all'interno del tubo.

Preparare due puntali per pipette a foro largo rimuovendo da due a quattro millilitri dall'estremità di un puntale da 200 microlitri con un nuovo rasoio o una lama di bisturi su una superficie pulita. Rimuovere il tubo per dialisi dal tampone per dialisi. Per evitare la diluizione del campione intasoma con il tampone per dialisi che potrebbe rimanere all'estremità del tubo vicino alla clip, utilizzare una micropipetta con una piccola punta per pipetta per rimuovere il tampone per dialisi in eccesso.

Rimuovere la clip da questa estremità del tubo di dialisi. Quando si recupera l'assemblaggio, è importante raccogliere la maggior parte della soluzione e precipitare il più possibile. Utilizzare la punta dell'elica a foro largo per trasferire il campione, compreso il precipitato, all'interno del tubo di dialisi, in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio.

Annotare il volume totale del materiale recuperato. Il volume totale è in genere di circa 140 microlitri. Il campione con precipitato è a 200 millimolari di cloruro di sodio.

Aumentare il sale fino a una concentrazione finale di 320 millimolari di cloruro di sodio aggiungendo il volume appropriato di una soluzione madre di cloruro di sodio a cinque molari. Trasferire il secchiello del ghiaccio con il campione in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius. Utilizzare il puntale della pipetta a foro largo per risospendere e solubilizzare il precipitato mediante pipettaggio.

Ripetere ogni 20 minuti per almeno un'ora. La maggior parte del precipitato dovrebbe andare in soluzione. Per purificare l'intasoma, equilibrare una cromatografia reticolata ad esclusione dimensionale di agarosio o una colonna SEC con tampone SEC in esecuzione a una velocità di flusso di 0,4 millilitri al minuto.

Centrifugare il campione di intasoma in una microfuge a 14.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare il precipitato rimanente. Dopo aver rimosso con cura il surnatante, caricarlo su un circuito di iniezione da 200 microlitri. Applicare l'esempio alla colonna SEC.

Eluire con 25 millilitri di tampone di corsa SEC e raccogliere 95 frazioni da 270 microlitri. Si noti che il cromatogramma SEC mostra tre picchi A280 e A260. Combina due microlitri di ciascuna frazione di picco dell'intasoma in 50 nanogrammi di DNA plasmatico super avvolto a tre kilobasi in tampone di reazione in un volume di reazione finale di 15 microlitri.

Includere anche un controllo negativo senza PFV aggiunto intasome. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Arrestare la reazione con 0,75 microlitri di proteinasi K e 0,75 microlitri di SDS.

Quindi incubare il campione a 55 gradi Celsius per un'ora. Quindi, aggiungi tre microlitri di glicerolo al 50% a ciascuna reazione di integrazione. Caricare l'intero volume di reazione a un 1% in peso per volume di gel di agarosio.

Inoltre, caricare un microlitro di marcatore di dimensioni del DNA di 10 kilobasi sulle corsie su entrambi i lati dei campioni. In una corsia esterna, caricare sei microlitri di colorante G arancione. Far funzionare il gel a tensione costante, 10 volt per centimetro, a temperatura ambiente per un'ora, o fino a quando il fronte del colorante arancione G raggiunge la fine del gel.

Acquisire immediatamente l'imaging del gel di agarosio con uno scanner fluorescente impostato per rilevare il bromuro di etidio. Questa immagine dovrebbe mostrare l'integrazione concertata come una banda che corre fedele alle dimensioni a tre kilobasi. Dopo aver quantificato le bande in ciascuna corsia con il software di imaging, selezionare le frazioni che hanno l'attività di integrazione più concertata.

Distribuire ogni frazione in aliquote da cinque microlitri. Infine, congelare le aliquote in azoto liquido prima di conservarle a meno 80 gradi Celsius. Viene mostrato un cromatogramma rappresentativo di una purificazione dell'assemblaggio di intasomi PFV.

Sono visibili tre picchi. Il picco centrale è correlato agli intasomi correttamente assemblati. Viene mostrata l'efficienza di integrazione come frazione dal picco cromatografico centrale.

Gli intasomi sono stati testati per l'attività senza e con congelamento e scongelamento. Il congelamento e lo scongelamento non hanno mostrato alcuna differenza nel gel di agraosio colorato con bromuro di etidio dei prodotti della reazione di integrazione. Qui sono indicati il plasbid super-avvolto, i prodotti di integrazione concertata, i prodotti di integrazione a metà vista e il DNA virale non reagito.

La quantificazione dell'efficienza di integrazione dall'immagine del bromuro di etidio conferma anche che non vi è alcuna perdita di attività di integrazione dopo il congelamento e lo scongelamento. Ciò consente una conservazione a lungo termine. La molecola e la posizione dell'etichetta influenzano l'efficienza dell'assemblaggio dell'intasoma PFV.

Gli intasomi non etichettati e un'etichetta Cy5 interna mostrano un'efficienza di assemblaggio equivalente. Tuttavia, l'etichetta terminale Cy5 o la biotina riducono l'efficienza dell'assemblaggio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi biochimici e a singola molecola, per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'integrazione, la cinetica e la dinamica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare, purificare e valutare funzionalmente gli intasomi PFV.