Name: Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dellAdenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara l'immunofenotipaggio di tumori pancreatici ortotopici in modelli murini KPC tramite citometria a flusso. Questo metodo consente di analizzare il microambiente immunitario tumorale per studi oncologici traslazionali.

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Gli autori vorrei ringraziare Dr. Jody Barbeau - per la lettura critica e di editing del manoscritto e grazie Ralph Manuel per la progettazione di opere d'arte. Gli autori vorrei anche ringraziare il team corona Bioscience oncologia Immuno-Oncology Biomarker e oncologia In Vivo , per i loro grandi sforzi tecnici.

Tutti i protocolli e integrazioni o procedure che coinvolgono la cura e l'uso di animali saranno riesaminate e approvate dalla corona Bioscience istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) prima lo svolgimento degli studi. La cura e l'uso degli animali sarà solitamente condotta conformemente alle linee guida internazionali AAALAC (associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care) come riportato nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, ricerca nazionale Consiglio (2011). Tutte le procedure sperimentali animali saranno in condizioni di sterilità presso strutture di SPF (specifico patogeno-libera) e condotta in stretta conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da diverse istituzioni (ad es. Il National Institutes of Health). Il protocollo dovranno essere approvati dal Comitato per l'etica di animale esperimenti presso l'Istituto di struttura (ad es. Comitato istituzionale IACUC).
1. preparazione per il trapianto di tumore
<ol><li>
Custodia degli animali
	<ol>
<li>Ottenere topi C57BL/6 generici da un fornitore di allevamento commerciale.</li>
		<li>Mouse della casa (5) in gabbie individuali ventilate alle seguenti condizioni: temperatura: 20 – 26 ° C; umidità 30 – 70%; ciclo di illuminazione: 12h di luce e 12 ore di buio.</li>
		<li>Uso mais pannocchia biancheria è cambiata settimanalmente.</li>
		<li>Per la dieta, fornire cibo secco granello irradiazione sterilizzato durante l'intero periodo di studio.</li>
		<li>Per acqua, fornire animali libero accesso all'acqua potabile sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di frammento del tumore donatore
	<ol>
<li>Iniziare con il monitoraggio del peso corporeo (BW), tramite pesatura utilizzando un equilibrio e il volume del tumore (TV), tramite la misura di calibro, dei topi del tumore-cuscinetto donatore.</li>
		<li>Quando la TV raggiunge 500 – 1.200 mm3, eutanasia l'animale in una cappa biohazard come da protocollo.</li>
		<li>Sterilizzare la pelle intorno al tumore utilizzando tamponi di iodophor.</li>
		<li>Rimuovere chirurgicamente il tumore (dettagli descritti nella sezione 3: raccolto l'autopsia e del tumore) e posizionare il tumore in una piastra Petri contenente 20 mL di PBS (pre-raffreddare il supporto o il tampone a 4 ° C prima dell'eutanasia di animali).</li>
		<li>Se c'è sangue contaminanti, trasferire il tumore in un'altra piastra di Petri e lavare il tumore con PBS.</li>
		<li>Tagliare il tumore a metà, rimuovendo qualsiasi pelle supplementare, vasi, calcificazione e/o necrosi.</li>
		<li>Scegliere solo i parti intatte del tumore e inserirli in una provetta sterile da 50 mL e aggiungere 20 mL di PBS quindi il tubo per un animale separato per gli studi di farmacologia di trasporto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Orthotopic ed Engraftment sottocutanea (SC)
<ol><li>
Inoculazione di SC
	<ol>
<li>Tagliare i tumori in 2 mm diametro pezzi usando un bisturi, mettere 1 pezzo in ogni trocar, per l'impianto SC o per successive orthotopic l'impianto (Vedi sotto).</li>
		<li>Anestetizzare l'animale destinatario con isoflurano 5%, che è mantenuta da un cono di naso all'1%. L'animale sarà iniziare a rilassarsi, a perdere loro riflesso di raddrizzamento e alla fine diventare immobile. A questa profondità dell'anestesia può facilmente essere risvegliati da stimoli dolorosi; consentire l'anestesia ad approfondire fino a quando tali risposte al dolore sono assenti.</li>
		<li>Una volta anestetizzato, fissare i topi su una scheda di esperimento nella posizione laterale di destra. Sterilizzare il mouse utilizzando tamponi di iodophor, particolarmente nelle aree che circonda i tumori.</li>
		<li>Con un bisturi, fare un'incisione della pelle di 0,5-1,0 cm sul fianco sinistro, appena cranico all'anca.</li>
		<li>Tunnel sotto la pelle verso la zampa anteriore, due-tre centimetri, con forcipe smussato.</li>
		<li>Asetticamente trasferire un cubo di tumore dal mezzo e posizionarla dentro il tunnel sottocutaneo.</li>
		<li>Confermare visivamente che il tumore è profondo nel tunnel (e non presso l'incisione cutanea).</li>
		<li>Chiudere la ferita con clip di ferita.</li>
		<li>Monitorare l'inoculazione di post di animali fino a quando non riacquistano la coscienza sufficiente per mantenere recumbence sternale. Riportare gli animali alla loro gabbia solo dopo il loro completo recupero dall'anestesia. Completare il registro di anestesia e avviare il grafico di salute animale. Pesare gli animali destinatari ogni giorno per tre giorni</li>
		<li>Per una procedura standard, inoculare 5-10 topi per gruppo per il monitoraggio di crescita del tumore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impianto ortotopico del pancreas
	<ol>
<li>Anestesia e Analgesia<ol>
<li>Utilizzare un 2ml ketamina iniezione e iniezione di xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) mescolato in 5.91 acqua sterile per iniezione o soluzione fisiologica ad un volume di dose di 0.06-0.1 mL/20-25 g di peso di corpo. Nota: Secondo al benessere degli animali, l'analgesia è necessario sia pre e post operazione. 0,05-0,1 mg/kg la buprenorfina, SC. La prima dose è pre operazione e quindi somministrato 3 volte ogni 4 ore post operazione continuamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Operazione chirurgica per l'impianto ortotopico<ol>
<li>Anestetizzare topi tramite iniezione intramuscolare (IM) al punto 2.2.1.</li>
			<li>Dopo che gli animali sono completamente anestetizzati, fissare i topi su una scheda di esperimento nella posizione laterale di destra.</li>
			<li>Mantenere i topi nella posizione laterale di destra. Disinfettare la pelle intorno alla milza con iodio quindi de-iodinate con alcool etilico al 75%.</li>
			<li>Trovare il punto medio della milza e praticare un'incisione verticale di 1 cm sull'addome per esporre la milza.</li>
			<li>Estrarre una parte di tessuto pancreatico sotto la milza delicatamente con una pinzetta piatto-punta e suturare un pezzo di tumore omotrapianto di mouse da mouse seme sul pancreas del destinatario mouse da sutura chirurgica riassorbibile di 9-0.</li>
			<li>Doppia cucitura nelle vicinanze l'addome con una sutura in seta 6-0. Raggiungere l'omeostasi di compressione.</li>
			<li>Dopo finitura impianto del tumore, in caso di sanguinamento né tumore perdite di tessuto, tenere gli animali in una gabbia calda.</li>
			<li>Monitorare l'animale fino a quando riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale; restituire l'animale per stanza animale dopo il completo recupero dall'anestesia. Monitorare il tumore topi del cuscinetto di palpazione dell'addome vicino la milza e seleziona i topi che sopportano i tumori ortotopico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Del tumore-cuscinetto topi salute monitoraggio
	<ol>
<li>Controllare il consumo di acqua e cibo tutti i giorni.</li>
		<li>Esaminare l'aspetto del mouse per un pelo Ted, grumi, magrezza, respiro anormale o ascite.</li>
		<li>Palpare l'addome per verificare se ci sono tumori spontanei sul fegato o milza.</li>
		<li>Pesare topi settimanale usando una bilancia.</li>
		<li>Se uno qualsiasi dei seguenti segni clinici si osservano i topi sono sacrificati per la raccolta del campione e l'autopsia: perdita di BW > 20%; Difficoltà di deambulazione (non in grado di mangiare o bere); Impossibile spostare normalmente a causa di ascite significativo e addome allargata; sforzo nella respirazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. l'autopsia e tumore Harvest
<ol><li>Ispezionare visivamente e mediante palpazione per la presenza di tumori evidenti prima della terminazione.</li>
	<li>Per la terminazione, prima eutanasia topi secondo il protocollo approvato e aprire l'addome ed esaminare visivamente il pancreas per i tumori.</li>
	<li>Tagliare il tumore dalla chirurgia mortale dell'alberino e aggiungerlo al PBS freddo. Posizionare tutti gli animali in una camera pulita, senza carica, traslucido eutanasia con un coperchio speciale con una porta per la consegna dell'anidride carbonica per essere utilizzato.</li>
	<li>Gas di scarico nella camera ad una portata che produce incoscienza rapida con minimo disagio per l'animale. La portata ottimale per CO2 dovrebbe essere di circa 2 – 2,5 L/min.</li>
	<li>Osservare visivamente ogni animale durante la procedura di eutanasia per assicurare tutti gli animali ricevono le concentrazioni di gas adeguata e non riacquistare coscienza durante la procedura di euthanize.</li>
	<li>Mantenere il flusso di gas per almeno 1 min dopo l'apparente morte clinica per minimizzare la possibilità che un animale può recuperare (se apneica ma non è morto).</li>
	<li>Rimuovere tessuti non tumorali adiacenti. Tumore puliti possa essere fotografati rapidamente. Mettere i tessuti del tumore in RPMI-1640 e tenere il ghiaccio prima di dissociazione. Nota: Le carcasse di animali sono insaccate e conservate nel congelatore appropriato in attesa di rimozione.</li>
</ol>4. tumore del tessuto dissociazione e preparazione singola cella
<ol><li>
Preparazione dei reagenti Nota: Il Kit di dissociazione del tumore contiene 2 flaconi di enzima D (polvere liofilizzata), 1 flacone di enzima R (polvere liofilizzata), 1 flacone di enzima A (polvere liofilizzata) e 1 mL di tampone A.<ol>
<li>Preparare enzima D mediante la ricostituzione della polvere liofilizzata in ogni flaconcino con 3 mL di RPMI-1640. Preparare le aliquote di un volume adeguato per evitare freeze-thaw-cicli ripetuti.</li>
		<li>Preparare enzima R mediante la ricostituzione della polvere liofilizzata nel flaconcino con 2,7 mL di RPMI 1640. Preparare le aliquote di un volume adeguato per evitare freeze-thaw-cicli ripetuti.</li>
		<li>Preparare enzima A ricostituire la polvere liofilizzata nel flacone con 1 mL di tampone A fornito nel kit. Non centrifugare. Preparare le aliquote di un volume adeguato per evitare ripetute gratis-disgelo-cicli.</li>
		<li>Preparare la miscela di enzima aggiungendo 2,35 mL di RPMI-1640, 100 µ l di enzima D, 50 µ l di enzima R e 12,5 µ l della A enzima in ogni gentleMACS C-tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissociazione di tumore
	<ol>
<li>Per ogni tumore preparare uno C-tubo con mix di digestione di tumore, fare riferimento alla sezione 4.1 per la preparazione e la diluizione del tampone di digestione.</li>
		<li>Tampone di digestione di 3ml di uso per i frammenti di tumore < 0,8 g e garantire il tumore è completamente digerito.</li>
		<li>Etichetta con il codice di studio, tumore, ID del mouse, gruppo di trattamento e peso del tumore.</li>
		<li>Raccogliere il tumore dal mouse, lavare il tumore in PBS freddo e ripulire il tessuto fissato sul tumore (ad esempio, vasi sanguigni, grasso, cover, ecc.).</li>
		<li>Mettere il tumore nei media di digestione in un pozzetto di una piastra sterile di ben 6.</li>
		<li>Tenere il tumore in luogo con pinzette/pinze sterili e fetta con un bisturi. Affettare il tumore abbastanza bene per rompere in pezzi più piccoli (~ 1 mm3).</li>
		<li>Inserire nuovamente i pezzi di tumore il C-tube e utilizzare il buffer di digestione restanti per lavare la piastra e poi trasferire il liquido in C-tubo che viene inserito sul ghiaccio finché la digestione.</li>
		<li>Accendere il dissociatore con riscaldatori.</li>
		<li>Dissociazione del tumore C-tubi upside-down in maniche di posizioni vacanti e regolare lo stato delle posizioni di tubo da Free to Selected. Scegliere un programma di dissociazione (37_c_m_TDK_1), seguito dalla selezione della cartella richiesta, dove viene visualizzato l'elenco dei programmi.</li>
		<li>Dopo il termine del programma, togliere il dissociatore e spin brevemente (300 x g, 4 ° C) a pellet il campione C-tubi.</li>
		<li>Risospendere i campioni e mettere in un colino di cella sopra un tubo da 50 mL. Lavare le cellule attraverso il filtro delle cellule con 10 mL di tampone di lavaggio per fornire una sospensione unicellulare.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e risospendere le cellule con 5 mL di tampone di lavaggio, conteggio di cellule vitali utilizzando trypan blu e/o di contatore di cellule e regolare la concentrazione cellulare di 1 x 106 cellule per tubo o per campione. Comprendono gli anticorpi di controllo isotipo corretta per garantire la macchiatura è specifica</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sistema immunitario pannello Design e acquisizione di dati di flusso
<ol><li>
Design del pannello
	<ol>
<li>Vedere tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Campione di cellule FC-Block: risospendere le cellule in 200 µ l di tampone con 1 µ g/mL Fc-blocco, seguita da incubazione su refrigerazione ghiaccio o a 4 ° C per 15 min al buio di colorazione.</li>
		<li>Macchia le celle utilizzando i pannelli di anticorpo/fluorescenza desiderato (ad es. T-Cell pannello, pannello del macrofago, ecc.): aggiungere la miscela di anticorpo diluita in tampone bloccante Fc per ogni campione, macchia per almeno 30 min in ghiaccio al buio.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS freddo ghiaccio in ogni provetta e Risospendere delicatamente, le cellule seguita da centrifugazione a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante risultante.<ol>
<li>Ripetere l'operazione per lavare le cellule due volte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mordente per marcatori intracellulari, se necessario, segue 6-10, altrimenti saltare al passaggio 10.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare di impulso vortice e aggiungere 200 µ l di soluzione di lavoro di fissazione/Permeabilization preparata per ogni campione. Vortice di impulso nuovamente e poi incubare a 4 ° C durante la notte (preferito) o 30 min a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Rotazione verso il basso le cellule ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare due volte, aggiungendo 1 mL di tampone di permeabilizzazione (fatto da 10 x Permeabilization Buffer, diluito con acqua distillata H2O) 1x seguita da centrifugazione e decantazione del surnatante.</li>
		<li>Aggiungere intracellulare marker della malattia in 1 x Permeabilization Buffer e incubare a temperatura ambiente per 30 min al buio.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte con 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare e decantare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 150 µ l di tampone di macchiatura e analizzare su un citometro. A causa della procedura di fissazione e permeabilizzazione, FSC (avanti-luce XY) / SSC (dispersione laterale) distribuzione della popolazione cellulare sarà diversa da cellule vive. Di conseguenza, il cancello e tensioni dovranno essere modificati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FMO controlli (fluorescenza meno un controllo) Nota: L'analisi di flusso multi-color è particolarmente importante per l'analisi di tumore-infiltrazione di cellule immunitarie. Di conseguenza, c'è la necessità di trovare un modo per identificare e cancello le cellule nel contesto dati sparsi a causa i fluorocromi multiple in un oggetto panel specificato. Controllo FMO (fluorescenza Minus One) è un approccio importante per questo scopo.<ol>
<li>A tal fine, di topi supplementari in ogni gruppo per controlli FMO (almeno 2 a Rx) e processo individualmente per ogni tessuto. Dopo dissociazione, tessuti di piscina. Ad esempio, in uno studio con 4 gruppi di Rx, 8 ulteriori tumori dovrebbero essere elaborati individualmente e poi riuniti in un campione per protocolli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Messa in funzione del flusso
	<ol>
<li>Fare compensazione perline mentre la macchina si sta riscaldando (almeno 20 min).</li>
		<li>Usare le perline di CS & T per verificare le prestazioni.</li>
		<li>Le impostazioni di tensione e compensazione: utilizzare UltraComp perline, vortice il Comp perline accuratamente prima dell'uso.</li>
		<li>Etichettare una provetta per campioni separati 12 x 75 mm2 per ogni fluorocromo-coniugate dell'anticorpo.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di buffer per ogni tubo di colorazione. Aggiungere 1 goccia completo (circa 60 µ l) di perline in ogni provetta.</li>
		<li>Aggiungere gli anticorpi ed eseguire la procedura di colorazione esattamente come il processo di esempio indicato nella sezione 4.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di buffer ogni, per completamente risospendere il pellet perlina via vortice di colorazione.</li>
		<li>Impostare la tensione PMT citometro a flusso al tessuto dell'obiettivo per l'esperimento dato.</li>
		<li>Attraversano il citometro a flusso per l'acquisizione di dati, di gating sulla popolazione di perlina di singoletto a letture FSC e SSC.</li>
		<li>Tasso di flusso set intorno a 200 – 300 eventi/s.</li>
		<li>Impostare una compensazione adeguata per una determinato della fluorescina [CIC]-anticorpo coniugato, uso un FL1 vs FL2 dot plot.</li>
		<li>Posto un cancello quadrante affinché perle negativi sono all'interno del quadrante inferiore sinistro e le perle positive sono in alto o più basso proprio quadrante. Regolare i valori di compensazione fino a quando l'intensità della fluorescenza media (MFI) di ogni popolazione (come mostrato nella finestra Statistiche del quadrante) è circa uguale (cioè per FL2-% FL1, FL2 IFM di entrambi i talloni dovrebbe essere simile).</li>
		<li>Ripetere i passaggi 5.4.11 e 5.4.12 per tutte le provette.</li>
		<li>Procedere all'acquisizione l'effettivo macchiato campioni. Eseguire la procedura guidata di compensazione e salvare le impostazioni con il formato "data di sperimentare le proprie iniziali".</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. flusso dati analisi e presentazione
<ol><li>Analizzare i dati da Flowjo e/o Kaluza.</li>
</ol>

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</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti a tempo pieno di corona Bioscience, Inc.

Sebbene più facilmente vengono condotti studi utilizzando i tumori SC, orthotopically impiantati tumori modelli possono essere potenzialmente più rilevanti per gli studi di farmacologia preclinica (in particolare le indagini di I/O) per fornire una maggiore traducibilità. Questo rapporto mira ad aiutare i lettori/pubblico interessato di essere in grado di visualizzare direttamente le procedure tecniche che possono essere utilizzate nelle loro rispettive ricerche. Nostri protocolli dimostrano che orthotopic l'impianto del...

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) fa sì che quasi la metà un milione mortalità universalmente ogni anno, uno dei top 5 cancro killer. Ci sono poche opzioni terapeutiche efficaci e nessun immunoterapie approvati; di conseguenza, nuovi trattamenti sono disperatamente necessari. I cancri sempre più stanno riconoscendi come malattie immunologiche, tra cui PDAC, oltre le malattie genetiche come la conosciamo oggi. Fattori immunologici e genetici probabilmente sarebbero determinare prognosi della malattia così come il trattamento dei risultati. I tumori eludere la sorveglianza immunitaria ospite e finalmente avanzano per causare la morte. Molti di questi processi immunitari si verificano all'interno del microambiente tumorale (TME)1,2,3,4 dove diversi tipi di cellule immunitarie interagiscono con le cellule del tumore, con l'altro e con altri del tumore componenti stromal, direttamente o indirettamente tramite citochine che determinano l'esito della malattia. Di conseguenza, caratterizzazione dei componenti immunitarie tumore della TME o tumore immunophenotyping, tra cui la definizione di sottotipo, la numerazione e la localizzazione degli stirpi differenti delle cellule immuni, è fondamentale per comprendere l'immunità anti-tumorale. Nel caso di PDAC, è stato proposto che elevati di tumore-infiltrazione di macrofagi soppressivi (TAM) e cellule di B hanno portato alla prevenzione di infiltrazione a cellula T e/o attivazione e alti livelli di fibrosi5,6.
L'approccio comune per indagare sperimentalmente TMEs immuni sarebbe utilizzando modelli animali preclinici di surrogato del tumore, il tumore del mouse principalmente i modelli7, particolarmente del mouse syngeneic (omotrapianto) o modelli murini geneticamente (GEMM) di cancri, sulla presunta somiglianza di mouse e umani per tumori e immunità8,9. È inteso in realtà che ci sono differenze intrinseche tra le due specie10,11.
Tumori trapiantati del topo hanno notevoli vantaggi operativi rispetto tumori spontanei7, vale a dire lo sviluppo del tumore sincronizzata, in contrasto con lo sviluppo di tumore spontaneo GEMM parentale. Gli omotrapianti di tumori murini spontanei sono considerati tumori primari non essendo mai stato manipolato in vitroe tumore del mirroring del mouse originale histo- / molecolare patologia7, nonché possibili profili immuni. Questi omotrapianti murini sono spesso considerati "una versione del mouse degli xenotrapianti paziente-derivati (PDXs)". Hanno quindi probabilmente una migliore traducibilità rispetto convenzionale delle cellule syngeneic del mouse linea-derivato tumori12. In particolare, molti gli omotrapianti sono derivati da GEMM specifici dove meccanismi di malattia umana specifica, ad esempio mutazioni oncogeniche driver, sono progettati e questi omotrapianti dovrebbero quindi avere vantaggi per la loro rilevanza clinica. In particolare, KPC GEMM sviluppano mouse PDAC entro 15-20 settimane di età, che ricapitola morfologicamente malattia umana con prevalentemente bene - a-differenziato moderatamente architettura ghiandolare e altamente arricchito lo stroma. Questo modello inoltre ricapitola le caratteristiche genetiche più comuni del PDAC umana, vale a dire Kras attivazione mutazione e P53 perdita di funzione, che si presentano nel 90% e 75% di umano PDAC, rispettivamente5,6.
Siti di trapianto sono stati suggeriti anche a svolgere un ruolo in traducibilità modello. Ambiente specifico per il tessuto circostante, ad esempio un ambiente di orthotopic corrispondente, potrebbe essere una nicchia per tumori specifici per ambienti di progresso, in contrasto con l'uniforme sottocutanea (SC) per i tumori comunemente trapiantati. Sarebbe di particolare interesse se, e/o, che differenza esiste tra i due siti di trapianto, in termini di immunitario-microambiente e la rilevanza di cancro umano, ad es. nel caso di PDAC.
Uno degli aspetti più importanti di profilazione immuni, o immunophenotyping, consiste nel determinare il tumore-infiltrazione di cellule immuni di stirpi differenti, i numeri, percentuale relativa all'interno dei tumori, così come loro Stati di attivazione e luoghi. Questo include il tumore-infiltratrating lymphoctyes (TILs, sia T - e B-), tumore-infiltrazione macrofagi (TAMs), tumore-infiltrazione di cellule di assassino naturali (NKs) e tumore-residente dendritiche cellule3,13,14 , 15 , 16 , 17e la localizzazione subcellulare di determinate cellule18,19,20, ecc. Fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) o flusso cytometry è una tecnologia di rilevamento a cella singola che è comunemente usata per misurare i parametri specifici di una cella. Multi-colore flusso cytometry misure marcatori multipli in una singola cella3,4,21 ed è il metodo più comunemente utilizzato per determinare i numeri e la percentuale relativa delle diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie, compresi quelli all'interno dei tumori.
Questo rapporto descrive le procedure per la profilatura di tumore-infiltrazione di cellule immuni: 1) l'impianto di orthotopic PDAC topo tumore gli omotrapianti, insieme con l'impianto di SC; 2) tumore del tessuto raccolto e preparazione di singola cellula tramite dissociazione del tumore; 3) analisi di citometria a flusso di tutte le cellule derivate da tumori come una linea di base; 4) confronto dei profili di linea di base di entrambi gli approcci di trapianto.

<table><tbody><tr><td>Macchina per anestesia</td><td>\</td><td>SAS3119</td><td>\</td></tr><tr><td>Trocar 20</td><td>\</td><td>\</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>\</td><td>\20</td> <td>mm</td></tr><tr><td>100x antibiotici e antimicotici</td><td>\</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>\Tamponi iodophor\</td><td></td><td>\</td><td>Acquisto quotidiano in farmacia</td></tr><tr><td>Tamponi imbevuti di alcol</td><td>\</td><td>\Acquisto</td><td></td></tr> <tr><td>giornaliero in farmaciaAzoto liquido</td><td>Aria chimica</td><td>\</td><td>\Cappa</td></tr> di <tr><td>biosicurezza</td><td>AIRTECH</td><td>BSC-1300IIA2</td><td>\</td></tr><tr><td>FACS macchina LSRFortessa X-20</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>\</td></tr><tr><td>anticorpi</td><td>BD</td><td>\</td><td>\</td></tr><tr><td>Trevigen MD o BD Matrigel Basement Membrane Matrix Alta concentrazione</td><td>BD</td><td>354248</td><td>\</td></tr><tr><td>FACS tamponi</td><td>BD</td><td>554656</td><td>Tampone di macinazione</td></tr><tr><td>Brilliant Staining Buffer</td><td>BD</td><td>563794</td><td>\</td></tr><tr><td>Mouse BD Fc Block</td><td>BD</td><td>553142</td><td>\</td></tr><tr><td>cell filters</td><td>BD-Falcon</td><td>352350</td><td>70 &micro; m</td></tr><tr><td>provetta di routine</td><td>BD-Vacutainer</td><td>365974</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman</td><td></td><td>vs 1,5</td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>\</td></tr><tr><td>Foxp3 Kit Fix/Perm</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>\</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>ebioscience</td><td>01-2222-42</td><td>\</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R,5920R</td><td>\</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>FlowJo LLC</td><td>\</td><td>vs 10.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30809.01</td><td>\</td></tr><tr><td>Bisturi sterili usa e getta</td><td>Jin zhong</td><td>J12100</td><td>11#</td></tr>manico <tr><td>di coltello</td><td>Jin zhong</td><td>J11010</td><td>\</td></tr><tr><td>forbici e pinzette per gli occhi</td><td>Jin zhong</td><td>Y00030</td><td>Forbici per gli occhi 10 cm</td></tr><tr><td>Forbici per gli occhi e pinzette</td><td>Jin zhong</td><td>JD1060</td><td>Pinzette per gli occhi 10 cm con denti</td></tr><tr><td>Serbatoio portatile di azoto liquido</td><td>Jinfeng</td><td>YDS-175-216</td><td>\</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Metter Toledo</td><td>AL204</td><td>0-100 g</td></tr><tr><td>Miltenyi C-tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-334</td><td>\</td></tr><tr><td>Miltenyi Gentle MACS con blocchi riscaldanti</td><td>Miltenyi</td><td>120-018-306</td><td>\</td></tr><tr><td>Kit di dissociazione tumorale</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-730</td><td>\</td></tr><tr><td>Contatore cellulare</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometro</td><td>Cellometro Auto T4</td></tr><tr><td>provetta per crioconservazione</td><td>Nunc</td><td>375418</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td><td>PathClear</td><td>3442-005-01</td><td>\</td></tr><tr><td>siringhe</td><td>Shanghai MIWA industria medica</td><td>\</td><td>1-5 mL</td></tr><tr><td>Studylog software</td><td>Studylog</td>\<td>software</td><td></td></tr> <tr><td>Studylog-Balance e supporto USB</td><td>OHAUS</td><td>SE601F</td><td>Balance e supporto USB</td></tr><tr><td>Studylog-Linea dati di calibri a corsoio</td><td>Sylvac</td><td>926.6721</td><td>Linea dati di calibri a corsoio</td></tr><tr><td></td><td>Sylvac</td><td>910.1502.10</td><td>Sylvac S-Cal pro</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga sterilizzate</td><td>Thermo</td><td>339653</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga sterilizzate</td><td>Thermo</td><td>339651</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Thermo</td><td>KLCS-288</td><td>4 gradi C</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Thermo</td><td>PLF-276-20</td><td> C</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Thermo</td><td>DW-862626-80</td><td> C</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo</td><td>am7021</td><td>\</td></tr></tbody></table>

immunophenotyping di orthotopic omotrapianto (syngeneic) dell'adenocarcinoma ductal pancreatico murino primario kpc tramite flusso cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Omotrapianto (syngeneic) tumori sono il cavallo di battaglia di ricerca preclinica di immuno-Oncologia (i/o) di oggi. Il microambiente tumorale (TME), in particolare sua immunitario-componenti, è di vitale importanza per la prognosi e la previsione di risultati di trattamento, specialmente quelli di immunoterapia. TME immunitario-componenti sono composte di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie tumore-infiltrazione valutabile da FACS multi-colore. L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra i più letali malignances mancano opzioni di buon trattamento, così un'esigenza medica urgente e insoddisfatta. Una ragione importante per la sua non-risposta alle varie terapie (chemio-, mirati, I/O) è stata la sua abbondante TME, composto da fibroblasti e leucociti che proteggono le cellule del tumore da queste terapie. Orthotopically PDAC impiantato è creduto per più accuratamente riconquistare la TME di cancri del pancreas umani rispetto ai modelli convenzionali sottocutanei (SC).
Tumori dell'omotrapianto (KPC) sono trapianti di mouse spontanea PDAC originari da KPC-topi geneticamente ingegnerizzati (ras diKG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Il tessuto del tumore primario è tagliato in piccoli frammenti (~ 2 mm3) e trapiantato per via sottocutanea (SC) ai destinatari syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 settimane di età). Gli omotrapianti erano quindi chirurgicamente orthotopically trapiantato sul pancreas dei topi C57BL/6 nuovi, insieme a SC-impianto, che ha raggiunto volumi del tumore di 300 – 1.000 mm3 da 17 giorni. Solo i tumori di 400 – 600 mm3 sono state raccolte per la procedura di analisi approvati e puliti per rimuovere i tessuti non tumorali adiacenti. Essi fossero dissociati per protocollo utilizzando un dissociatore di tessuto in sospensioni unicellulari, seguite dalla macchiatura con pannelli designati di anticorpi fluorescente-etichetta per i vari indicatori di diverse cellule immunitarie (linfoidi, mieloidi e NK, DCs). I macchiato campioni sono stati analizzati utilizzando multi-colore FACS per determinare i numeri delle cellule immuni di stirpi differenti, come pure la loro percentuale relativa all'interno dei tumori. I profili immuni di orthotopic tumori poi sono stati confrontati a quelli dei tumori SC. I dati preliminari hanno dimostrato significativamente elevata infiltrazione TILs/TAMs nei tumori sopra pancreas e infiltrazione della B-cellula superiore orthotopic piuttosto che i tumori SC.

Impianto di orthotopic del PDAC ha provocato sviluppo veloce del tumore simile a quello visto per l'impianto di SC. Dopo i frammenti di tumore donatore sono stati impiantati in topi destinatari, sia per via sottocutanea e orthotopically secondo i protocolli descritto ai punti 2.1 e 2.2, i tumori di omotrapianto KPC impiantati dimostrato a rapida crescita come mostrato in figura 1A . Tumori dell'omotrapianto KPC raccolti in diversi momenti sono mostrati in <st...

La procedura sperimentale su immunophenotyping di omotrapianti PDAC murino ortotopico mira a profilatura immuno-microambiente tumorale. I tumori sono orthotopically impiantato tramite intervento chirurgico. Tumori di 200 – 600 mm3 dimensioni sono state raccolte e dissociati per preparare sospensioni unicellulari, seguite da analisi dell'indicatore multi-immuni FACS usando diversi anticorpi fluorescente etichettati.

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Questo messaggio può aiutare a rispondere alle domande chiave nell'immunofenotipizzazione nei modelli Murine, come i marcatori utilizzati per identificare diversi lignaggi di immunità e strategie di invecchiamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il marcatore e le stategie di invecchiamento, durante l'immunofenotipizzazione, possono essere applicati a una varietà di modelli murini. Monitorare il peso corporeo dei topi C57 Black 6 utilizzando un equilibrio.Inoltre, monitorare il volume tumorale del tumore variando i topi donatori per misura del calibro. Dopo l'eutanasia dell'animale in un cappuccio a rischio biologico secondo il protocollo, sterilizzare la pelle intorno al tumore usando tamponi Iodophor. Dopo aver rimosso chirurgicamente il tumore come descritto nel protocollo di testo, posizionare il tumore in una piastra di Petri contenente 20 millilitri di PBS che è stato pre-refrigerato a 4 gradi Celsius.Se c'è sangue contaminante, trasferire il tumore in un'altra piastra di Petri e lavare il tumore con PBS. Taglia il tumore a metà. Rimuovere la pelle, i vasi, la calcificazione e la necrosi extra.Scegli solo pezzi intatti di tumore e mettili in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di PBS prima di trasportare il tubo in una stanza separata per gli studi farmacologici. Per prepararsi all'impianto ortotopico, fissare un mouse completamente anestetizzato su una scheda di esperimento nella giusta posizione laterale.Disinfettare la pelle intorno alla milza con idodina e poi de-iodinato con alcool etilico al 75%. Trova il punto mediano della milza e fai un'incisione verticale di 1 centimetro sull'addome per esporre la milza. Delicatamente, estraggono parte del tessuto del pancreas sotto la milza usando una pinzetta a punta piatta.E il tumore dell'omoinnesto del topo sutro dal topo C al pancreas del topo ricevente per sutura chirurgica bsorbibile 9-O. Chiudi l'addome con una sutura di seta 6-O con doppia cucitura. Ottenere l'omeostasi per compressione.Dopo aver terminato l'impianto tumorale, tenere l'animale in una gabbia calda finché non si verifica sanguinamento o perdite di tessuto tumorale. Monitorare l'animale fino a quando non riacquistano sufficiente coscienza per mantenere la rimo clemenza sternale. Riportare l'animale nella stanza degli animali dopo il pieno recupero dall'anestesia.Monitorare il tumore variando i topi palpando l'addome vicino alla milza e selezionare i topi che portano tumori ortotopici. Per ogni tumore, preparare un tubo C con tampone di digestione tumorale. Utilizzare 3 millilitri di tampone di digestione per frammenti tumorali inferiori a 0,8 grammi per garantire che il tumore sia completamente digerito.Etichettare il tumore con il codice di studio, il tumore, l'ID mouse, il gruppo di trattamento e il peso del tumore. Raccogli il tumore dal topo. Lavare il tumore in PBS freddo e pulire il tessuto attaccato al tumore.Posizionare il tumore nei mezzi di digestione in un pozzo di una piastra sterile a 6 po '. Tenere il tumore in posizione con pinzette sterili o pinze e affettare con un bisturi. Affettare il tumore abbastanza bene da rompersi in pezzi più piccoli.Ora, riposizionare i pezzi tumorali nel tubo C e utilizzare il tampone di digestione rimanente per lavare la piastra. Trasferire il fluido nel tubo C e posizionare sul ghiaccio fino alla digestione. Quindi accendere il dissociatore con riscaldatori.Posizionare il tubo C di dissociazione tumorale capovolto nella manica della posizione vacante. Regola lo stato della posizione del tubo da Libero a Selezionato. Scegliere un programma di dissociazione seguito dalla selezione della cartella richiesta in cui viene visualizzato l'elenco dei programmi.Dopo la chiusura del programma, togliere il tubo C dal dissociatore e girare brevemente per pallettizzazione del campione. Ora, sospendete i campioni e metteteli in un colino cellulare sopra un tubo da 50 millilitri. Lavare la cella attraverso il filtro cellulare con 10 millilitri di tampone di lavaggio per fornire una sospensione a cella singola.Dopo aver centrifugato il tubo a 300 G per 5 minuti, scartare il supernatante e sospendere di nuovo le celle con 5 millilitri di tampone di lavaggio. Contare le cellule vitali e regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule per tubo o per campione. Eseguire il design del pannello immunitario, l'immunostaining e la fluorescenza meno un controllo come dettaglio nel protocollo di testo.Preparare le perline UltraComp mentre gli strumenti di flusso si stanno riscaldando in vortice prima dell'uso. Etichettare un tubo campione separato di 12 x 75 millimetri per ogni anticorpo coniugato fluorocromi. Aggiungere 100 microliter di tampone di colorazione a ciascun tubo seguito da una goccia completa delle perline.Aggiungere anticorpi ed eseguire la procedura di colorazione come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone di colorazione a ogni pellet di perline e sospendere completamente tramite vortice. Ora, impostare la tensione PMT della citometria di flusso per tessuto bersaglio per l'esperimento dato.Eseguire il campione attraverso il campione attraverso la citometria Flow per l'acquisizione dei dati guadagnando sulla popolazione di perline singoletta per dispersione in avanti e letture a dispersione laterale. Impostare la portata da 200 a 300 eventi al secondo. Impostare la compensazione appropriata per un determinato anticorpo di coniugazione FITC fluoresceina utilizzando un grafico a punti FL1 contro FL1.Posizionare un cancello del quadrante in modo che le perline negative si trovano all'interno del quadrante in basso a sinistra e le perline positive si trovano all'interno del quadrante superiore o inferiore destro. Regolare i valori di compensazione fino a quando l'intensità mediana della fluoresceina di ogni popolazione è approssimativamente uguale. Ripetere questi passaggi per tutti i tubi.Ora, procedi all'acquisizione di campioni di macchie reali. Eseguire la Creazione guidata retribuzione e salvare l'impostazione con il formato:data, esperimento e le iniziali. L'impianto ortotopico dell'adenocarcinoma duttale pancreatico ha portato a una rapida crescita tumorale simile a quella osservata nell'impianto sottocutaneo.Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione di ematossilina ed eosina e dimostrano una crescita simile di impianti sottocutanei e ortotopici. Le rese delle cellule vitali ragionevolmente elevate sono state ottenite dal campione tumorale di entrambi i tipi di impianto. La piattaforma rappresentante FACS mostra cellule vitali dal tumore separate dalle cellule morte e dai detriti cellulari.Mostrato qui, è un tumore che si infiltra in un confronto del profilo immunitario della popolazione cellulare maggiore e numeratore di diversi sottoinsiemi chiave delle cellule immunitarie tumorali. Vengono mostrati omologhi sottocutanei contro ortotopici del cancro al pancreas. I dati mostrano chiaramente che il tumore ha aumentato significativamente l'infiltrazione delle cellule immunitarie rispetto al pancreas di topi sani.Inoltre, diverse percentuali di sottogrumi di cellule immunitarie infiltrate nel tumore sono state trovate negli omoinnesti ortotopici rispetto a quelli sottocutanei. Ad esempio, ci sono molto più cellule B in ortotopico che sottocutanee. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di preparare in anticipo tutti i materiali e i reagenti associati.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi FACS per i modelli murini.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Cellule staminali tumorali (CSC), sono stati identificati in una serie di tumori maligni. In questo protocollo si descrive un metodo di citometria a flusso utilizzando aldeide deidrogenasi attività e CD44 e CD24 espressione di isolare dal CSC xenotrapianti adenocarcinoma pancreatico umano. Queste cellule vitali possono poi essere utilizzati in studi funzionali e di analisi.

Isolamento di cellule staminali da xenotrapianti di cancro pancreatico umano

Il video spiega un metodo chirurgico graduale per l'impianto ortotopico di un frammento tumorale da un donatore canceroso al pancreas di un topo ricevente non canceroso per lo sviluppo del cancro al pancreas. Il PDAC impiantato ortotopicamente potrebbe ricatturare il microambiente tissutale dei tumori del pancreas umano rispetto ai modelli sottocutanei convenzionali (SC) in modo più accurato.

Trapianto di tumore omotrapianto ortotopico: una tecnica per generare modelli murini di tumore pancreatico

La generazione di un modello di ratto ortotopico di pleurico mesotelioma maligno da impianto di II-45 cellule di mesotelioma nella cavità pleurica di topi immunocompetenti è presentato. Metodo citometria di flusso per analizzare sette sottoinsiemi di cellule immunitarie di questi animali da un campione di sangue di 25 ml è anche descritto.

Ortotopico impianto e periferico immunitario monitoraggio cellulare nel Modello II-45 Singenico Rat mesotelioma

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Qui descriviamo un modello di trapianto orthotopic syngeneic minimamente invasiva delle cellule di adenocarcinoma del polmone del topo come un modello di tempo - e riduzione dei costi per studiare il cancro del polmone non a piccole cellule.

Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1

Descriviamo un protocollo per l'impianto guidato ad ultrasuoni di linee cellulari adenocarcinoma pancreatiche derivate da murini direttamente nel sito tumorale nativo. Questo approccio ha portato a tumori pancreatici rilevabili dalla scansione a ultrasuoni entro 2-4 settimane dall'iniezione, e ha ridotto significativamente la proporzione di semina delle cellule tumorali sulla parete peritoneale rispetto all'impianto ortotopico chirurgico.

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

Questo protocollo descrive la generazione chirurgica di tumori pancreatici ortotopici e la rapida digestione di tumori pancreatici del murino appena isolati. Dopo la digestione, le popolazioni di cellule immunitarie vitali possono essere utilizzate per ulteriori analisi a valle, tra cui la stimolazione ex vivo delle cellule T per il rilevamento della citochina intracellulare mediante citometria di flusso.

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto tumorale per la caratterizzazione di linfociti infiltrati tumorali intrinseci e periferici derivati dal tumore in un modello di tumore murino. Il tracciamento specifico dell'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente con citometria a flusso rivela la dinamica dei cambiamenti fenotipici e funzionali di queste cellule durante le risposte immunitarie antitumorali.

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

Gli allotrapianti ortotopici singeneici di topo dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) ricapitolano la biologia, i fenotipi e le risposte terapeutiche dei sottotipi di malattia. Grazie alla loro progressione tumorale rapida e riproducibile, sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici. Qui, mostriamo pratiche comuni per generare questi modelli, iniettando colture di PDAC murino singeneico nel pancreas.

Allotrapianti ortotopici singeneici di topo per modello di cancro del pancreas

Descriviamo un metodo per utilizzare i linfociti infiltranti il tumore (TIL) dai topi attraverso la citometria a flusso per il trasferimento di cellule adottive. Questo protocollo mira a verificare la citotossicità specifica dei TIL contro i tumori in un modello murino di carcinoma pancreatico singenico, fornendo informazioni sullo sviluppo di terapie cellulari adottive per il cancro del pancreas.

Isolamento basato sulla citometria a flusso e valutazione terapeutica dei linfociti infiltranti il tumore in un modello murino di carcinoma pancreatico

Qui, viene descritto un metodo basato sulla citometria a fosfoflusso per analizzare la segnalazione a valle delle vie mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK in cellule di leucemia mieloide umana acuta xenotrapiantate in topi e ottenute da aspirati di midollo osseo. I livelli di p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 vengono misurati simultaneamente utilizzando un citometro a flusso spettrale di nuova generazione ad alta sensibilità.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

Impara l'immunofenotipaggio di tumori pancreatici ortotopici in modelli murini KPC tramite citometria a flusso. Questo metodo consente di analizzare il microambiente immunitario tumorale per studi oncologici traslazionali.

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dellAdenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry (Video) | JoVE Journal

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

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