Name: De Novo Generazione di cellule staminali somatiche da YAP/TAZ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Scopri come riprogrammare cellule differenziate in progenitori usando il fattore di trascrizione YAP. Questo metodo innovativo genera cellule staminali somatiche per la medicina rigenerativa e lo studio della plasticità cellulare.

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Si ringrazia F. Camargo per il dono di tetO-YAPS127A topi; R26-rtTAM2 topi (stock #006965) sono stati acquistati presso il laboratorio di Jackson. Ringraziamo Chiara Frasson e Giuseppe Basso per aiuto con le procedure di FACS. Questo lavoro è supportato da AIRC speciale programma oncologia molecolare clinica ' 5 per mille ' e un PI-Grant AIRC per s. p ed Epigenetics Flagship progetto CNR-Miur concede a S.P. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) sotto ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea e il programma per l'innovazione (di sovvenzione DENOVOSTEM n. 670126).

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
<li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui presentiamo i protocolli per riprogrammare le cellule epiteliali ex vivo terminalmente differenziate dei tessuti differenti in loro corrispondente tessuto-specifica del progenitor (o ySCs) di espressione transiente di YAP, come riferito precedentemente1. Noi abbiamo dettagliato due procedure: uno che consente la riprogrammazione delle cellule di FACS-purificato con vettori lentivirali e una seconda che evita l'infezione virale e si avvale di transgenici YAP espressione. Ogni protocollo presenta una strategia efficace per isolare e cellule differenziate primario di cultura e una strategia per forzare esogeno YAP espressione genica in cellule differenziate, generando de novo tessuto-specifici espandibile cellule staminali somatiche (Vedi schemi in figure 1A e 2A).
Abbiamo dimostrato che le strategie di isolamento qui presentate efficacemente isolare una popolazione pura di cellule differenziate, come dimostrato dal fatto che non abbiamo mai rilevato qualsiasi escrescenza da campioni di controllo negativo (figure 1 e 2 C).
I vettori lentivirali utilizzati in questo studio per la riprogrammazione delle cellule mammarie primarie di LD sono doxiciclina inducibile, offrendo la possibilità di uno stretto controllo dell'espressione del transgene; Questo permette di accendere e fuori esogeno YAP espressione a volontà. Particolare attenzione deve essere posto in evitando l'uso di un titolo virale eccessivo, come questo può essere dannoso in termini di efficienza di riprogrammazione. Nel caso di cellule acinose primarie, siamo passati ad un approccio completamente transgenico per ottenere una riprogrammazione di YAP-dipendente con manipolazioni minime. Questa strategia di quest'ultima inoltre è particolarmente adatta a primario dei acini pancreatici, come cluster acinose isolato sono molto fragili e scarsamente suscettibili di infezione lentivirale. La strategia transgenica impiegata offre lo stesso vantaggio di doxiciclina-dipendente vettori lentivirali per il controllo stretto dell'espressione genica. Inoltre, la strategia transgenica sfruttata con acini pancreatici primari porta il vantaggio aggiuntivo di un efficienza riprogramma molto più alta per la riprogrammazione indotta da virale delle cellule mammarie di LD. Oltre la plasticità intrinseca diversa associata a cellule derivate dai tessuti differenti, il più alto tasso di riprogrammazione del pancreas potrebbe essere derivato dalla maggiore efficienza di espressione associata all'espressione di YAP uniforme e autonoma in tutte le cellule espiantate. In particolare, abbiamo dimostrato che YAP esogeno non è più necessaria dopo la generazione del ySCs (colonie di yMaSC e yDucts), senza compromettere la loro capacità di auto-rinnovamento. Questo è perché ySCs riattivazione endogena YAP/TAZ e utilizzarli per il auto-rinnovamento quando esogeno YAP è spento1.
Abbiamo validato la nozione che ySCs emergono infatti da cellule differenziate controllando la cellula dell'origine dei nostri esperimenti riprogrammazione tramite genetica lignaggio traccia convalide1.
Ampia caratterizzazionedi ySCs Mostra che indotta da YAP riprogrammazione genera SCs somatiche normale1 come mi) a livello di trascrittomica, ySCs visualizzare massicce sovrapposizioni con SCs nativo; II) ySCs visualizzare potenziale differenziativo e può generare una progenie multilineare sempre limitata all'identità del loro tessuto di origine; III) ySCs sono non trasformate e non tumorigeniche quando trapiantate in vivo.
Qui descriviamo anche procedure per mantenere ed espandere la cultura sia yMaSCs e yDucts come organoids incorporato in idrogel di matrice della membrana dello scantinato di 100%. Queste condizioni consentono l'auto-organizzazione dei ySCs in organoids tridimensionali che assicurano il mantenimento delle proprietà di staminalità a lungo termine nella cultura, consentendo di espandere queste derivano popolazioni a volontà per analisi successive e applicazioni. Per ragioni sconosciute, non siamo riusciti a ottenere yMaSC organoids inserendo LD cellule direttamente in condizioni di coltura organoid infette 7 giorni dopo il trattamento doxiciclina nella piastra di coltura del tessuto plastica; in altre parole, il passaggio intermedio di crescita in condizioni di Colonia mammaria è essenziale. Nelle nostre mani, anche nativi popolazione richiedono condizioni di Colonia mammaria prima di passaggio nella cultura organoid. Inoltre, la conseguenza più efficiente di organoid è ottenuta quando noi evitare dissociare le colonie primarie in singole celle, ma piuttosto trasferire le colonie intatte in condizioni di coltura organoid.
Condizioni di coltura organoid sopportare anche il vantaggio di dare la possibilità di crioconservare ySCs, purché l'organoids sono recuperati da loro matrici, evitando la dissociazione di cella prima della crioconservazione in bagno di azoto.
Il YAP riprogrammazione procedura presentata in grado di convertire tipi distinti delle cellule differenziate derivati da diversi tessuti adulti loro corrispondente tessuto-specifici sulle cellule staminali (abbiamo testato utilizzando cellule mammarie, pancreatiche e neuronale)1. A differenza da iPSCs o altri sforzi di riprogrammazione, YAP/indotto SCs può mantenere i ricordi del loro tessuto di origine. Della nota, de-differenziazione delle cellule somatiche in cellule con proprietà simil-staminali è l'unica forma di plasticità di destino delle cellule e riprogrammazione osservati in vivo, per esempio dopo danno di tessuto e di sostenere la cicatrizzazione5,17 , 18 , 19 , 20. è degno di nota che YAP e TAZ sono in gran parte superflui per l'omeostasi normale ma cruciale per riparazione tissutale in molteplici tessuti11,21. Costantemente con una funzione fisiologica della riprogrammazione procedura qui descritta, YAP/TAZ sono stati recentemente indicati per essere richiesto nella rigenerazione intestinale in modelli murini di pazienti di colite ulcerosa causando una conversione delle cellule intestinali adulte in un epitelio di riparazione che visualizza le caratteristiche del budello fetale19. YAP riprogrammazione amplia così le attuali strategie di plasticità indotta delle cellule fornendo un mezzo per generare cellule staminali somatiche, uno stato che è stato finora impegnativo per catturare in vitro. Questo approccio, se esteso anche alle cellule di derivazione umana, potrebbe avere ampia rilevanza da applicazioni di medicina rigenerativa allo studio dello stato somatico staminalità e per l'espansione di somatico stelo cellule in vitro.

Le cellule staminali somatiche tessuto-specifici (SCs) sono critiche per la riparazione e rinnovamento tissutale dopo la ferita. La possibilità di isolare facilmente e illimitatamente espandere ex vivo somatico SCs rappresenta un problema critico per potenziali terapie rigenerative, nonché per applicazioni di SC in ricerca di base e modellazione di malattia. Progressi in questa direzione, tuttavia, sono stato limitato dalla difficoltà di acquisire lo stato di SC di vari organi epiteliali in vitro. Infatti, nei diversi tessuti adulti residenti SCs può non esiste, o non essere prontamente disponibili, o loro numero e del potenziale rigenerativo può essere eroso dalle condizioni di invecchiamento o di malattia. Nel 2016, abbiamo iniziato a colmare questa lacuna segnalando che l'espressione di un singolo coactivator transcriptional, YAP (YES-associated protein) o sue proteine strettamente correlate TAZ (attivatore trascrizionale con un motivo PDZ), nelle cellule terminalmente differenziate in modo efficiente crea popolazioni di cellule funzionali, espandibile, non tumorigeniche, autologo che sono funzionalmente e molecolarmente indistinguibili da loro corrispondente tessuto-specifici SCs1. Un impulso di sostenuta YAP o attività TAZ per pochi giorni è sufficiente per indurre la comparsa di autorinnovanti SCs somatiche. Si tratta di una condizione stabile che non è più dipendente da espressione del transgene continuo, come esso può essere trasmesso attraverso generazioni di cellulari senza ulteriore espressione ectopica YAP/TAZ1. Il protocollo presentato qui dettagli la procedura utilizzata per generare cellule staminali/progenitrici epiteliali de novo del ghiandola mammaria e del pancreas, a partire da cellule differenziate di questi tessuti. Questa procedura si riempie una scatola nera nell'arena riprogrammazione/transdifferenziazione corrente. Gli sforzi principali in queste direzioni hanno infatti finora centrato sulla transizione di cella a uno stato di (iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, seguito dalla conversione di questi embrionali e pluripotenti SCs in cellule più differenziate. Tuttavia, iPSCs sono tumorigeniche una volta introdotto nei tessuti adulti, alzando la necessità di sviluppare protocolli per la loro differenziazione completa ed efficiente2. Tuttavia, questo passaggio di differenziazione, anche quando possibile, è disponibile al prezzo di potenziali ripopolamento a lungo termine dell'organo, auto-organizzazione ed espandibilità. Questi sono gli attributi essenziali per la rigenerazione dell'organo che in realtà sono tipici solo di SCs endogena di tessuto-specifica e di SCs indotta da YAP attualmente descritto (ySCs). Allo stesso modo, transdifferenziazione diretta di tipo di una cella in un altro utilizzando cocktail di trascrizione vari fattori anche generano differenziato cellule che mancano essenziale potenziale proliferativo e staminalità3.
La procedura qui descritta sfrutta anche la tecnologia di recente introduzione organoid, da cui SCs endogena può essere ampliato e differenziato ex vivo4. SCs YAP-indotta può generare SCs organoid-formando anche in condizioni sperimentali, biologico o malattia in cui SCs endogeno non sono presenti. Vorremmo sottolineare che, a differenza con altre procedure di riprogrammazione, il tipo della plasticità delle cellule impartita da YAP può corrispondere all'unica forma di reversione ad uno stato di SC-like che si verifica nei tessuti viventi. Riacquisizione dei tratti di SC-come è stato associato con la riparazione dei tessuti o l'attivazione oncogenica5. Anche se superfluo per l'omeostasi dei tessuti adulti diversi, YAP e/o TAZ sono assolutamente essenziali per la rigenerazione, la crescita del tumore e l'espansione di SCs somatiche in vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>Siringhe sterili da 10 mL</td><td>Raggi</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare da 100 mm</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche sterili da 15 mL Piastre di</td> attacco ultra basse <td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Costar</td><td></td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari da 40 mm</td><td>Piastre multipozzetto Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche sterili da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Piastre multipozzetto a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco 12634028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi, tipo I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doxiciclina iclato</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Provette FACS (con tappi filtro)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td><td>usato come controllo negativo</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84008</td><td>usato come controllo negativo</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td><td>usato come controllo negativo (mutante YAP trascrizionalmente morto)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>eparina sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>umano R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi da testicoli bovini</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo K-14</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo K-8</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (cocktail di anticorpi per lignaggio di topo alloficocianina [APC])</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; Fattore di crescita Matrice della membrana basale ridotta, Corning senza rosso fenolo</td><td></td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>adesivo non cellulare 10 cm piastre (piastra di Petri in polistirolo sterile &oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Criceto Anti-Topo CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-topo/ratto CD29 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Collagene a coda di ratto I (rivestimento)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagene a coda di ratto I per coltura 3D</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>umano ricombinante FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>umano ricombinante Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>recombinante murino EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante murino FGF basico (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Inibitore della tripsina da Glicina max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth medio</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo generazione di cellule staminali somatiche da yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Qui presentiamo protocolli per isolare cellule differenziate primarie e girare che li in cellule staminali/progenitrici (SCs) della stessa stirpe di espressione transitoria del fattore di trascrizione YAP. Con questo metodo, Luminale cellule differenziate di (LD) della ghiandola mammaria del mouse vengono convertite in cellule che esibiscono proprietà molecolari e funzionali di mammaria SCs. YAP inoltre si trasforma completamente differenziato pancreatica esocrina cellule nel pancreas condotto-come progenitori. Allo stesso modo, al SCs endogeno, naturale, YAP-indotta di cellule staminali-simili ("ySCs") possono essere alla fine ampliate come organoid colture a lungo termine in vitro, senza ulteriore bisogno di ectopico YAP/TAZ, come ySCs sono dotati di uno stato ereditabile autorinnovabile SC.
La procedura di riprogrammazione qui presentata offre la possibilità di generare ed espandere in vitro cellule progenitrici delle varie fonti di tessuto a partire da cellule differenziate. La semplice espansione di cellule somatiche ex vivo ha implicazioni per la medicina rigenerativa, per comprendere i meccanismi dell'inizio del tumore e, più in generale, per cellulare e gli studi di biologia dello sviluppo.

Generazione di yMaSCs Una panoramica della strategia sperimentale per riprogrammare cellule mammarie a LD primarie di espressione transiente di YAP è presentata in Figura 1A. Cellule epiteliali mammarie primarie di LD sono purificate da fluorescente-attivata cella ordinamento13. Figura 1B rappresenta una tipica procedura di ordinamento per ottenere tre distinte sottopopolazioni: cellule basali (EpCAMbassoCD49faltaCD61–), le cellule progenitrici Luminal (LP) (EpCAMaltaCD49fbassoCD61+ ) e le cellule LD (EpCAMaltaCD49fbassoCD61–). Attenzione gating di tre sottopopolazioni è indispensabile per isolare una preparazione pura di cellule di LD, che sono completamente differenziate e completamente crescita arrestato quando seminati in condizioni (Vedi Figura 1, pannello sinistro) di formazione di colonie di ghiandola mammaria. Al contrario, quando indotte per esprimere esogeno YAP, LD cellule iniziano a proliferare per formare colonie epiteliali densi facilmente riconoscibile in colture in sospensione matrice della membrana dello scantinato di 5% (Figura 1). L'efficienza della riprogrammazione, attestata intorno al 3% per un tipico esperimento, possono essere segnati contando il numero di colonie sopra il numero di singole cellule originariamente seminati in colture in sospensione matrice della membrana dello scantinato (Figura 1). Cellule riprogrammate luminale (yMaSCs) possono essere quindi il passaggio in 100% della membrana dello scantinato matrice organoid condizioni di coltura (Vedi schema in Figura 1A), auto-organizzazione in complesse organoid-come le strutture che si sviluppano attorno più lumen e visualizzare la capacità di auto-rinnovamento notevole anche in assenza di doxiciclina (cioè in assenza di espressione di YAP transgenici) (Figura 1E). Istologicamente, yMaSC-derivati organoids visualizzare uno strato basale (K14 positivo), affrontando la matrice della membrana basale ricostituita ECM e uno strato di luminal (K8 positivo), affrontando le cavità lumen-come all'interno di organoid (Figura 1F). Questa architettura è indistinguibile da quella dei organoids formata da popolazione nativa (Figura 1F).
Generazione di yDucts Una panoramica della strategia sperimentale per riprogrammare i acini pancreatici primari di espressione transiente di YAP è presentata nella Figura 2A. Interi gruppi acinose sono isolati dalla massa del tessuto pancreatico tramite una combinazione di lieve dissociazione e l'esclusione di dimensione attraverso la filtrazione. Una preparazione tipica è presentata nella Figura 2B. Dopo l'isolamento, i cluster di cellule acinose dovrebbero apparire come una sospensione di esocrino acinose unità di dimensioni omogenee, senza contaminazione di endocrino isolotti di Langerhans o frammenti del albero duttale pancreatico e minima dissociazione di singole cellule. Contaminazione da isolotti endocrini o frammenti ductal è un'indicazione di filtrazione selettiva carenti (passo 2.1.10), probabilmente a causa di manipolazione duro; dissociazione indesiderati di acinose cluster da singole cellule potrebbe essere dovuto trattamento eccessivo collagenasi o unbuffered attività degli enzimi proteolitici rilasciato dal tessuto, che può essere frenato dal trattamento SBTI supplementare.
Un tipico esperimento di riprogrammazione acinoso è presentato in Figura 2; entro 5-7 giorni di cultura in collagene 3D-ho basato idrogel in presenza di doxiciclina, acini pancreatici derivati da topi R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A facilmente trasformano in condotto-come cluster (che abbiamo chiamato yDucts), composto da un sottile monostrato di cellule epiteliali che proliferano intorno a una cavità centrale in espansione. L'efficienza di riprogrammazione, che è circa il 70% per un tipico esperimento, può essere facilmente misurato segnando il numero di cluster condotto-come oltre il numero totale di teste di serie dei acini (Figura 2D). Il controllo negativo cellule, cioè R26-rtTAM2 / + cellule o R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A celle a sinistra senza doxiciclina, invariabilmente rimangono come post-mitotici acinose cluster in queste condizioni di coltura, come precedentemente segnalate1 ,14,15. Riprogrammate yDucts può quindi essere attraversate a livello di singola cellula in basati su Matrigel organoid cultura condizioni16 (Vedi schema in Figura 2A), visualizzazione di capacità di auto-rinnovamento notevole anche in assenza di doxiciclina (vale a dire in assenza di espressione di YAP transgenici) (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figura 1: Cellule staminali: cellule isolamento di LD mammario primario e l'induzione di mammaria. (A) rappresentazione schematica delle procedure sperimentali adottate per riprogrammare le cellule mammarie primarie di LD. (B) rappresentante FACS-piazzole che illustra una tipica procedura di ordinamento per purificare le cellule LD. i) dissociate cellule sono gated secondo scatter avanti e laterali per cellule vive (P1; blu); II) popolazione P1 è poi ulteriormente recintata in base al relativo profilo di Lin: la sottopopolazione delle cellule Lineage-negative (P2; grigio) è selezionata, escluse le cellule ematopoietiche Lineage-positive; III) popolazione P2 viene poi separata in un EpCAMalta (P3; giallo + verde) e unbasso (P6; rosso) sottopopolazioni di EpCAM; IV) P3 e P6 sono quindi ulteriormente gated secondo il loro profilo di CD61/CD49f in tre sottopopolazioni: EpCAMbassoCD49faltaCD61 cellule basali– (P7; rosso), EpCAMaltaCD49fbassoCD61+ LP cellule (P8; giallo) ed EpCAMaltaCD49fbassoCD61 cellule di LD– (P9; verde). (C) immagini sono illustrative della capacità delle cellule di LD, infettati con i costrutti indicati, di formare colonie mammarie 15 giorni dopo la semina in mezzo Colonia mammaria. Solo YAP-esprimendo le cellule diventano formanti colonie cellule, considerando che cellule di controllo negativo (EGFP-infettati) rimangono come celluli crescita-arrestato. Barra della scala = 50 μm. (D) quantificazione della Colonia formando la capacità delle cellule indicate, come in (C). I dati sono presentati come media + s.d. e sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti, ciascuno con sei repliche tecniche. (E) immagine rappresentativa di YAP-riprogrammato cellule staminali-come delle cellule mammarie (yMaSCs) dopo 12 giorni in condizioni di coltura organoid in fresco idrogel dei matrice tridimensionale 100% della membrana dello scantinato in assenza di doxiciclina. Scala bar = 100 μm. (F) immagini di immunofluorescenza rappresentativo per il marcatore basale K14 (verde) e l'indicatore di luminal K8 (rosso) dei organoids derivano dalle cellule indicate, dopo 12 giorni in condizioni di coltura organoid. Barra della scala = 10 μm. Questa figura è riprodotto da Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figura 2 : Isolamento delle cellule acinose pancreatiche primarie e l'induzione dei progenitori del pancreas. (A) rappresentazione schematica delle procedure sperimentali adottate per riprogrammare le cellule acinose esocrine pancreatiche primarie. (B) immagine rappresentativa dei acini pancreatici primari subito dopo la procedura di isolamento (passo 2.1.14). La preparazione acinosa dovrebbe apparire come una sospensione omogenea di cluster acinose, con minima presenza di singole cellule. Barra della scala = 400 μm. (C) immagini rappresentative dei acini pancreatici primari derivata da R26-rtTAM2 (pannelli superiori)o R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (inferiore pannelli) topi e coltivate in 3-d collagene I-base di idrogel per 5 giorni con o senza Doxiciclina (doxy), come indicato. YAP-esprimendo i acini primari convertire solo in cellule che crescono come ciste-come organoid dopo aggiunta di doxiciclina. Scala bar = 70 μm. (D) quantificazione della capacità dei acini pancreatici per formare ductal organoids su transgenici YAP sovraespressione come in (C). I dati sono presentati come media + s.d. e sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti, eseguita con quattro ripetizioni di tecniche. (E) immagine rappresentativa YAP-riprogrammata ductal-come delle cellule (yDucts) dopo tre passaggi in fresco idrogel dei matrice tridimensionale 100% della membrana dello scantinato in assenza di doxiciclina. Barra della scala = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento delle cellule mammarie primarie</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 + soluzione di chelatazione</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagene sono soluzione di rivestimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido acetico 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagene di coda di ratto (rivestimento)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di dispase</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio di dissociazione</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di riserva di ialuronidasi</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emolitica soluzione</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di NH4Cl</td>
			<td>1 parti</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 parti</td>
		</tr>
<tr>
<td>aggiustare il pH a 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di riserva di ialuronidasi</td>
			<td>Filtro 0,2 µm, conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ialuronidasi dai testicoli bovini (polvere)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone fosfato di sodio 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di NH4Cl</td>
			<td>Conservare a T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>regolare il pH a 7.65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>L'ordinamento di soluzione</td>
			<td>Filtro 0,2 µm, conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavare mezzo #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavare medio #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Terreno di coltura 2D mammaria</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>eparina</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutammina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induzione e Passaging di yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammari Colonia Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>eparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutammina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (aggiungere immediatamente prima della semina)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammari Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 avanzata</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>eparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin umano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: generazione di yMaSCs. Composizione di tutti i diversi terreni di coltura e soluzioni necessarie per l'isolamento delle cellule mammarie primarie di LD e induzione di yMaSCs (sezione 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento dei acini pancreatici primari</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Terreno di coltura acinose</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desametasone</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medium di Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinose lavaggio medio</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medium RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinose recupero medio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Terreno di coltura acinose</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenasi ho soluzione A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinose lavaggio medio</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>Conservare a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi, tipo io (polvere)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaggio dei organoids del pancreas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenasi ho soluzione B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pancreatico Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avanzata DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrina</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 umano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin umano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetilcisteina</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinammide</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: generazione di yDucts. Composizione di tutti i diversi terreni di coltura e soluzioni necessarie per l'isolamento di cellule acinose primarie e induzione e passaggio di yDucts (sezione 2).

Disponibilità di SCs somatiche è fondamentale per la medicina rigenerativa, modellazione di malattia e per ottenere informazioni sulle proprietà di SC. Qui presentiamo strategie sperimentali per riprogrammare, in vitro, differenziato cellule adulte nelle loro cellule tessuto-specifici espandibile staminali/progenitrici corrispondente dall'espressione transitoria co-dell'attivatore trascrizionale unico YAP.

De Novo Generazione di cellule staminali somatiche da YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasformare le cellule primarie differenziate in cellule progenitrici dello stesso lignaggio mediante l'espressione transitoria del fattore di trascrizione YAP. Questa procedura di riprogrammazione offre la possibilità di generare in vitro cellule progenitrici simili o staminali di vari tessuti a partire dalle loro controparti differenziate, anche quando le cellule staminali endogene sono rare o difficili da identificare. La possibilità, qui esterna, di espandere le cellule somatiche ex vivo ha implicazioni per la medicina rigenerativa, per la comprensione dei meccanismi di plasticità cellulare che è rilevante anche nel cancro e per il tessuto cellulare e lo sviluppo di studi di biologia.Questa procedura riempie una scatola nera nell'attuale arena della riprogrammazione, poiché non miriamo a produrre cellule specializzate attraverso la differenziazione delle cellule staminali embrionali, ma cellule staminali specifiche del tessuto da cellule differenziate. Dopo aver sacrificato 10 topi femmina secondo il protocollo di testo, sezionare le ghiandole mammarie praticando un'incisione a forma di Y lungo la pelle addominale. Quindi utilizzare una pinza Dumont per separare con cura le ghiandole dal peritoneo tirando delicatamente.Posizionare le ghiandole sezionate in una capsula adesiva non cellulare con 10 millilitri di HBSS+PS ghiacciato. Sotto una cappa di coltura tissutale, utilizzare 10 millilitri di HBSS+PS fresco per lavare ogni ghiandola una volta e metterle in una capsula adesiva vuota non cellulare. Quindi usa due bisturi sterili per tritare finemente le ghiandole in frammenti di un millimetro cubo.La corretta macinazione delle ghiandole è essenziale per un efficiente isolamento cellulare. Unire 20 ghiandole e cercare di eseguire questo passaggio entro tre-cinque minuti per una vitalità cellulare ottimale. Utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri e 10 millilitri di terreno di dissociazione, recuperare il tessuto tritato da ciascuna piastra e trasferire la sospensione in una provetta conica da 50 millilitri pipettando almeno cinque volte per disaggregare i grumi di tessuto.Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per un'ora agitando continuamente e vigorosamente. Quindi centrifugare il fazzoletto digerito a 400 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare tre millilitri di soluzione emolitica per risospendere il tessuto e incubare su ghiaccio per tre minuti.Successivamente, con 10 millilitri di mezzo di lavaggio numero uno, lavare le celle. Dopo aver centrifugato il tessuto digerito e scartato il surnatante, risospendere il pellet di tessuto in 10 millilitri di terreno di lavaggio numero due e piastrare le cellule in piastre di coltura tissutale da 10 centimetri. Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora.Recuperare la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare il tubo a 400 volte g per cinque minuti. Quindi utilizzare 10 millilitri della soluzione chelante del calcio per risospendere il pellet. Dopo la centrifugazione e dopo aver ripetuto il lavaggio, risospendere il pellet in cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%.Dopo aver incubato il campione, aggiungere cinque millilitri di soluzione di dispasi integrata con un microgrammo per millilitro di DNasi uno sopra la soluzione di tripsina. Per disaggregare i grumi, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per pipettare su e giù almeno cinque volte e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 10 minuti, agitando ogni tre minuti. Aggiungere 10 millilitri di terreno di lavaggio numero due e filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Quindi far girare la sospensione cellulare. Per eseguire la purificazione cellulare mediante FACS, utilizzare 200 microlitri di terreno di lavaggio numero uno per risospendere ogni pellet. Quindi aggiungere 44,5 microlitri di miscela di anticorpi, pipettare accuratamente e incubare il campione al buio su ghiaccio per 30 minuti.Diluire la sospensione cellulare in 10 millilitri di terreno di lavaggio numero uno e centrifugare il campione. Risospendere il pellet cellulare in due millilitri di soluzione di selezione e filtrare attraverso un tubo FACS con filtro a tappo prima di procedere alla separazione FACS delle popolazioni cellulari. Utilizzare la soluzione di lavaggio numero uno per lavare le cellule recuperate dal FACS.Dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare il terreno di coltura mammaria 2D per risospendere il pellet cellulare e piastrarne 500 microlitri per pozzetto su una piastra trattata con collagene. Sette giorni dopo l'induzione con doxiciclina delle cellule LD primarie infettate da lentivirali, aggiungere 150 microlitri per pozzetto di tripsina-EDTA allo 05% alle cellule e incubarle a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta che le cellule sono state lavate e contate, utilizzare il terreno di colonia di memoria, integrato con due microgrammi per millilitro di doxiciclina per risospenderle.Quindi seminare 1.000 cellule per pozzetto in piastre di attacco ultra basse da 24 pozzetti per la coltura di colonie simili a maschere che esprimono YAP. Per sottocolture y maschere, raccogliere ogni campione e aggiungere un volume di 10 a uno di HBSS ghiacciato, quindi incubare i campioni su ghiaccio per un'ora al fine di solubilizzare la matrice della membrana basale. Dopo aver centrifugato le colonie, usa l'HBSS ghiacciato per lavare le celle tre volte.Quindi aggiungere lo 05% di tripsina-EDTA alle colonie e incubarle a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Passare le colonie attraverso un puntale per pipetta P1000 10 volte per ottenere una sospensione a cellula singola. Quindi contare e riseminare le cellule nel terreno della colonia mammaria senza doxiciclina in piastre a bassissimo attacco da 24 pozzetti a una densità colongenica di 1.000 cellule per pozzetto.Prima del terzo passaggio, trasferire le colonie in condizioni di coltura di organoidi recuperando le colonie dal terreno della colonia mammaria e utilizzare la matrice della membrana basale ridotta al 100% con fattore di crescita per risospenderle. Dopo l'incubazione, quando la matrice della membrana basale si è solidificata, sovrapporre i gel con 500 microlitri di terreno organoide mammario. Passaggio delle colture raccogliendo ogni campione di organoide e incubandolo in un volume in eccesso di HBSS su ghiaccio per un'ora.Quindi utilizzare l'HBSS ghiacciato per lavare gli organoidi tre volte. Tripsinizzare gli organoidi come dimostrato in precedenza in questo video e riseminare le sospensioni di singole cellule in una goccia di matrice di membrana basale ridotta al 100% del fattore di crescita, quindi utilizzare 500 microlitri di terreno organoide mammario per sovrapporre i gel. Dopo aver lavato il tessuto pancreatico di topo digerito secondo il protocollo di testo, utilizzare sei millilitri di terreno di recupero acinose per risospendere con cura il tessuto digerito e dividerlo tra due pozzetti di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti.Al microscopio stereomicroscopio, valutare attentamente la qualità dell'isolamento acinare e rimuovere eventuali grossi grumi di tessuto eventualmente presenti. Per seminare gli acini pancreatici primari, dopo aver incubato i grappoli per due ore per il recupero cellulare, raccogliere la sospensione cellulare acinare in una provetta conica e centrifugare i campioni a 100 volte g e 18 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver risospeso gli acini in terreno di coltura acinar, diluire la sospensione con un volume uguale di soluzione neutralizzata di collagene di coda di ratto, mantenendo le provette in ghiaccio.Mescolare con cura e rapidamente e seminare la sospensione cellulare in 16 pozzetti sopra il cuscino di collagene. Per una semina ottimale degli acini pancreatici è fondamentale tenere tutte le provette in ghiaccio prima della placcatura e procedere con velocità ma allo stesso tempo un attento pipettaggio per evitare la formazione di bolle d'aria è fondamentale per creare una matrice di collagene omogenea. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire la formazione di un idrogel.Quindi, per indurre gli organoidi pancreatici, sovrapporre gli idrogel di collagene con 500 microlitri di terreno di coltura acinarare integrato con doxiciclina. Per sottocoltivare gli organoidi, scartare il terreno di coltura, estrarre con cura gli idrogel e trasferirli in provette coniche contenenti quattro millilitri di soluzione B di collagenasi I, quindi incubare le provette a 37 gradi Celsius agitando vigorosamente per 30 minuti prima di far girare le cellule e rimuovere il surnatante. Dopo aver tripsinizzato le cellule e rimosso il surnatante PBS, utilizzare una matrice di membrana basale ghiacciata per risospendere il pellet cellulare e seminare la sospensione in piastre di attacco ultra basse.Lasciare solidificare l'idrogel della matrice della membrana basale incubando le piastre a 37 gradi Celsius per 40 minuti e poi sovrapporle con un organoide pancreatico. I dotti cresceranno come organoidi simili a cisti in sette-10 giorni. Un attento gating delle cellule epiteliali LD mammarie primarie nelle tre sottopopolazioni mostrate qui è essenziale per isolare una preparazione pura di cellule LD che sono completamente differenziate e completamente bloccate dalla crescita quando seminate in condizioni di formazione di colonie di ghiandole mammarie.Al contrario, quando indotte ad esprimere YAP esogeno, le cellule LD iniziano a proliferare per formare colonie epiteliali dense facilmente riconoscibili in colture in sospensione della matrice di membrana basale al 5%. In condizioni di coltura di organoidi della matrice della membrana basale, le cellule luminali riprogrammate si auto-organizzano in strutture complesse simili a organoidi che si sviluppano attorno a più lumi e si autorinnovano anche in assenza di doxiciclina. Entro i cinque-sette giorni di coltura in idrogel a base di collagene 3D I in presenza di doxiciclina, gli acini panrcreatici differenziati si trasformano prontamente in cluster simili a dotti o yDucts composti da un sottile monostrato di cellule epiteliali che proliferano attorno a una cavità centrale in espansione.L'efficienza della riprogrammazione può essere facilmente misurata valutando il numero di cluster simili a dotti rispetto al numero totale di acini seminati. Gli yDucts riprogrammati possono quindi essere fatti passare a livello di singola cellula in condizioni di coltura di organoidi basati su matrigel, mostrando una notevole capacità di autorinnovamento anche in assenza di espressione endogena di YAP. Abbiamo dettagliato due procedure.Uno ha permesso la riprogrammazione di cellule purificate con FACS attraverso vettori lentivirali e un secondo che evita l'infezione virale e sfrutta l'espressione transgenica di YAP. Quando si tenta la riprogrammazione delle cellule mammarie è importante evitare l'uso di un titolo virale eccessivo in quanto ciò può essere dannoso per l'efficienza della riprogrammazione. La strategia completamente transgenica è appropriata per gli acini pancreatici primari in quanto questi sono scarsamente suscettibili all'infezione lentivirale.Offre anche lo stesso vantaggio dei vettori lentivirali dipendenti dalla doxiciclina per il controllo del tipo di espressione genica. Oltre agli esempi qui dimostrati, questo protocollo di riprogrammazione YAP si è dimostrato efficace per convertire i neuroni differenziati in neuroni proliferanti stessi. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una riprogrammazione YAP dipendente per convertire tipi di cellule differenziate da diversi tessuti adulti nelle corrispondenti cellule staminali tessuto-specifiche.Questa procedura amplia le attuali strategie di riprogrammazione fornendo un mezzo per generare cellule staminali somatiche che possono avere rilevanza per la medicina rigenerativa per lo studio della staminalità somatica e per l'espansione delle cellule staminali somatiche in vitro. Si prega di considerare che la manipolazione del preparato lentivirale può essere estremamente pericolosa e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre misure di livello due per il livello due.

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