Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono esaminare l'attivazione dell'inflammasoma a livello di singola cellula tramite microscopia a fluorescenza e misurare la lisi durante la piroptosi mediante un saggio di rilascio di lattato deidrogenasi o LDH. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'inflammasoma, come ad esempio come viene regolata l'attivazione della caspasi-1. Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono all'utente di esaminare più passaggi dell'attivazione dell'inflammasoma e delle vie della piroptosi.

A dimostrare la procedura sarà Andreas den Hartigh, un ricercatore del mio laboratorio. Iniziare sostituendo il terreno di macrofagi derivati dal midollo osseo innescati con LPS seminati su vetrini coprioggetti con 290 microlitri di terreno DMEM 5, integrato con cinque nigericina micromolare e cinque millimolari di glicina, per pozzetto. Rimettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore per colture cellulari per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, aggiungendo 10 microlitri di 30X FAM-YVAD-FMK dopo i primi 15 minuti.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS freddo per pozzetto, tre volte per cinque minuti per lavaggio e fissare le cellule con 250 microlitri di paraformaldeide al 2% per pozzetto per 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce, marcando le cellule con un colorante nucleare a fluorescenza appropriato durante gli ultimi cinque minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS freddo come appena dimostrato e caricare ogni vetrino con sette microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento. Posizionare un vetrino coprioggetti su ogni vetrino e lasciare indurire il supporto di montaggio durante la notte prima di sigillare i vetrini coprioggetti con lo smalto per unghie.

Per visualizzare le cellule mediante microscopia confocale a fluorescenza, posizionare il vetrino di controllo non trattato sul tavolino del microscopio e mettere a fuoco manualmente le cellule. Utilizzando le impostazioni della tabella di ricerca al microscopio, regolare l'offset fino a quando non si osserva alcuna colorazione positiva della sonda nelle cellule non trattate. Successivamente, utilizzando un campione trattato con nigericina, individuare un campo che contiene cellule sia positive che negative per la colorazione della sonda e regolare il piano di imaging del canale della sonda sul piano che ha la più alta intensità di colorazione positiva.

Quindi regolare il guadagno fino a quando i fuochi sono visibili nelle cellule con nuclei condensati e ottenere immagini di cinque campi selezionati casualmente per vetrino con un ingrandimento totale di 100X. Per l'analisi immunofluorochimica delle cellule trattate con nigericina, lavare le cellule marcate con prop come appena dimostrato e incubare le cellule in 250 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione per pozzetto per 30 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce. Lavare i macrofagi altre tre volte con un tampone di lavaggio fresco ed etichettare le cellule con 250 microlitri di anticorpo primario contro una proteina speck-simile associata alla ptosi contenente un dominio di reclutamento della caspasi C-terminale, o ASC, per pozzetto, per un'ora sul ghiaccio.

Lavare le cellule al termine dell'incubazione ed etichettare i campioni con 250 microlitri di anticorpo secondario coniugato con colorante a fluorescenza appropriato per un'altra ora su ghiaccio, aggiungendo quattro microlitri di un colorante nucleare di colorazione a fluorescenza appropriato durante gli ultimi cinque minuti. Dopo aver lavato le cellule tre volte in tampone di lavaggio a freddo, montare i vetrini coprioggetti sui vetrini con sette microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento, come dimostrato, e visualizzare i macrofagi mediante microscopia confocale a fluorescenza. Per eseguire un test di rilascio di LDH, aggiungere 50 microlitri di terreno DMEM 5 integrato con 10 nigericina micromolare a ciascun pozzetto sperimentale e 50 microlitri di DMEM 5 ai pozzetti di controllo spontaneo e al 100% di lisi per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo 30 minuti, aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi 10X ai pozzetti di controllo della lisi al 100% e aggiungere 10 microlitri di terreno agli altri pozzetti. Al termine dell'incubazione, centrifugare la piastra e trasferire 50 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto a una piastra trasparente a fondo piatto. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di substrato appena scongelato e preparato a ciascun pozzetto per un'incubazione di 30 minuti al buio, controllando la piastra dopo 15 minuti per confermare che il segnale non supererà il limite di rilevamento del lettore di piastre.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzetto e misurare l'OD490 su un apposito lettore di piastre per consentire il calcolo della percentuale di lisi cellulare per pozzetto. Mentre i macrofagi di tipo esposti alla nigericina dimostrano la formazione di un focolaio di ASC nella regione perinucleare che contiene anche Caspasi-1 attiva, indicando che queste cellule sono in fase di piroptosi. Sebbene i macrofagi dei topi carenti di Caspasi-111 generino anche un focus ASC, queste cellule non hanno alcuna Caspasi-1 attiva associata a questo focus, come indicato dall'assenza di colorazione FAM-YVAD-FMK.

Né i nuclei di queste cellule sono condensati, indicando un'assenza di morte cellulare pirottotica. Inoltre, una grande percentuale di macrofagi wild type va incontro a morte cellulare dopo l'esposizione alla nigericina, come misurato dall'analisi del rilascio di LDH dei loro surnatanti di coltura, mentre i macrofagi carenti di Caspasi-1 non rilasciano LDH nel surnatante, indicando che le cellule sono ancora intatte. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare la formazione di inflammasomi mediante microscopia a fluorescenza e determinare il livello di lisi cellulare misurando il rilascio di LDH.

Questa procedura può essere modificata per l'uso di altri stimoli inflammasomici o interventi che alterano l'attivazione dell'inflammasoma o la piroptosi.