Name: Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Impara a rilevare l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi murini derivati dal midollo osseo mediante microscopia a fluorescenza e saggi di rilascio di LDH. Questo metodo consente di studiare la pirosi a livello di singola cellula.

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Tutta la microscopia è stato fatto presso il centro di microscopia di W. M. Keck con supporto di Nathaniel Peters e con il supporto del premio NIH S10OD016240. S.l.f. è supportato da NIH K08AI119142 e R21AI130281. Si ringraziano il Dr. Richard Flavell e Dr. Brad Cookson per topi caspase-1/11 e Dr. Brad Cookson per la condivisione di attrezzature e strutture di laboratorio.

Tutte le procedure di animali sono state approvate e condotti sotto Università di Washington istituzionale Animal Care e Comitato uso linee guida.
1. raccolta del midollo osseo
<ol><li>Asetticamente rimuovere il femore e la tibia da un mouse e pulire le ossa utilizzando strumenti sterili. Mettere le ossa pulite in 5 mM HEPES, Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) + 10% siero bovino fetale (FBS, DMEM-10 completa) + 0,2 mg/mL L-Glutammina + 0,05 mM 2-mercaptoetanolo + 50 mg/mL Gentamicina solfato + 10.000 U/mL di penicillina/streptomicina e incubare la tubo sul ghiaccio per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere i giunti a sfera prossimale e distale usando le forbici. Inserire un ago 25 G collegato ad una siringa da 10 mL riempita con il mezzo nella cavità delle ossa. Scovare il midollo osseo utilizzando DMEM-10 completo. Risospendere eventuali grumi pipettando il mezzo su e giù delicatamente.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g e contare il numero di celle utilizzando un emocitometro. A questo punto, o congelare le cellule usando 90% FBS + 10% di dimetilsolfossido (DMSO) o piastra le cellule in un 15cm di Petri per differenziare i macrofagi utilizzando L929 condizionata medio (punto 2.1).</li>
</ol>2. differenziazione dei macrofagi derivate da midollo osseo
<ol><li>Utilizzando il mezzo di differenziazione pre-riscaldato (21 mL di DMEM-10 completo e 9 mL di medium di cellulare condizionata L929 come descritto da Swanson et al. 18), mettere le cellule del midollo osseo in un 15cm non-tessuto cultura trattati di Petri (1.2-1.5 x 107 cellule). Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2 per 7 giorni. Aggiungere un ulteriore 30 mL di mezzo di differenziazione alla piastra al giorno 3 o 4. Nota: È importante non utilizzare piastre di coltura di tessuti trattato, come macrofagi sarà difficili da staccare e raccogliere.</li>
	<li>Per raccogliere i macrofagi, lavare la piastra con tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 20 mL di PBS freddo + 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare la piastra a 4 ° C per 10 min. raccolto le cellule pipettando il PBS + EDTA sopra le cellule e lavare la piastra con 10 mL di PBS. Combinare due lavaggi in due provette coniche da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e risospendere le cellule in 10 mL di rosso fenolo libero DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutammina + 0,05 mM 2-mercaptoetanolo + 5% FBS (DMEM-5) e contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore Coulter. Mantenere le cellule su ghiaccio durante il conteggio.</li>
	<li>I macrofagi in piastre di coltura del tessuto rivestito a 2 x 105 cellule/mL del seme. Per esperimenti di microscopia, seme 1 mL di cellule sulle lamelle in 24 piatti ben. Per i test di rilascio LDH, seme 100 µ l di cellule in un piatto ben 96. Per il dosaggio LDH, seme 9 pozzi (3 pozzi non trattati, 3 pozzi con controlli 100% Lisi e 3 pozzi per lo stimolo sperimentale).</li>
	<li>Centrifugare la piastra ben 96 per 5 min a 300 x g per assicurarti che le cellule sono equamente distribuite tra il pozzo.</li>
	<li>Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C + 5% CO2 prima di iniziare il processo di innesco.</li>
</ol>3. priming
<ol><li>Sostituire il supporto con mezzo fresco (DMEM-5) contenente 100 ng/mL LPS (500 μL del 24 ben piatto o 50 µ l per il 96 ben piatto). Nota: Ci sono una varietà di variazioni strutturali in LPS, che influenzano la capacità di stimolare TLR4-mediata adescamento19. LPS da Salmonella minnesota R595 (Re) è disponibile da più fornitori ed è consigliato.</li>
	<li>Incubare la piastra per 3 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
</ol>4. attivazione del Inflammasome NLRP3 con Nigericina ed etichettatura con FAM-YVAD-FMK
<ol><li>Rimuovere il mezzo e sostituirlo con 290 μL di DMEM-5 contenente 5 μM Nigericina e glicina di 5 mM. La glicina è aggiunto per ridurre la quantità di lisi cellulare che si verifica durante l'attivazione di caspasi-15. Incubare per 60 min a 37 ° C e 5% CO2. Utilizzare wild type e caspase-1 macrofagi carenti per garantire che l'etichettatura osservata è specifico per la caspasi-1.</li>
	<li>Durante gli ultimi 45 minuti, aggiungere 10 μL di 30 x FAM-YVAD-FMK, preparati secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Dopo 60 min, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Aggiungere 250 μL di paraformaldeide 2% ad ogni pozzetto e incubare in ghiaccio coperto con carta stagnola per 30 min.</li>
	<li>Durante gli ultimi 5 minuti, aggiungere 4 μL di macchia fluorescente dell'acido nucleico 0,2 mM per etichettare i nuclei. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o altri coloranti utilizzabile anche all'etichetta del DNA.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 1 mL di PBS freddo e montare i coprioggetti sui vetrini microscopio usando 7 μL montaggio antislittamento mezzo. Indurisca il mezzo di montaggio tutta la notte prima di sigillare il coprioggetto per il vetrino da microscopio usando smalto.</li>
	<li>Immagine i macrofagi mediante microscopia confocale. Ex / Em per FAM-YVAD-FMK è 492/520nm e 642/661 per macchia fluorescente dell'acido nucleico. Assicurarsi di impostare il microscopio, tale che le cellule non trattate non mostrano alcun background macchiatura nel canale 488. In caso contrario, una colorazione di fondo FAM-YVAD-FMK sarà rilevato e non effettivo attiva caspase-1. Nota: Il set-up microscopio è descritto nella sezione 6.</li>
</ol>5. anticorpi
Nota: Per identificare le celle con gli anticorpi per rilevare ASC, seme, prime ed esporre le cellule a Nigericina identico alla sezione precedente. L'elaborazione in seguito è come segue:
<ol><li>Lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di PBS freddo. Aggiungere 250 μL di soluzione di permeabilizzazione e fissaggio. Incubare le cellule sul ghiaccio e coperto per 30 min.</li>
	<li>Lavare i macrofagi tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di anticorpo primario contro ASC diluito 1: 500 nel tampone di lavaggio e incubare per 1h sul ghiaccio. Includere un vetrino coprioggetto che non riceve alcun anticorpo primario, ma riceverà solo secondario. Questo vetrino coprioggetti utilizzerà per impostare l'offset corretto durante l'installazione di microscopio.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di anticorpo secondario (colorante fluorescente coniugati-anti-topo di capra) diluito 1: 500 nel tampone di lavaggio e incubare per 1h sul ghiaccio. Aggiungere 4 μL di macchia fluorescente dell'acido nucleico 0,2 mM per gli ultimi 5 minuti di questa incubazione ai nuclei di etichetta.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 x con 1 mL di tampone di lavaggio freddo e montare i vetrini coprioggetto sul microscopio diapositive utilizzando il mezzo di montaggio a antislittamento 7 μL. Indurisca il mezzo di montaggio tutta la notte prima di sigillare il coprioggetto per il vetrino da microscopio usando smalto trasparente.</li>
	<li>Macrofagi di immagine mediante microscopia confocale. Ex / Em per l'anticorpo secondario è 555/580 nm e 642/661 per acido nucleico fluorescente da' macchia (come descritto di seguito). Nota: Etichettatura con FAM-YVAD-FMK e anticorpo etichettatura possa essere combinato per mostrare co-localizzazione di caspase-1 attivo e ASC. Per questo, seguire le condizioni per l'etichettatura di FAM-YVAD-FMK e quindi passare per il protocollo per l'ulteriore elaborazione di contrassegno dell'anticorpo.</li>
</ol>6. imaging dei macrofagi con etichettati mediante microscopia confocale
Nota: Le cellule marcate possono essere visualizzate dopo i coprioggetti sono stato permesso di curare tutta la notte e sono stati sigillati per il vetrino da microscopio con lo smalto. Qui, imaging utilizzando un microscopio confocale è descritto. Le cellule possono essere visualizzate anche da microscopia di fluorescenza standard.
<ol><li>Porre il vetrino con le cellule di controllo non trattato sul tavolino del microscopio e concentrare il microscopio sulle cellule.</li>
	<li>Utilizzando il microscopio Look Up Table (LUT) impostazioni, regolare l'offset tale che non c'è nessun FAM-YVAD-FMK la macchiatura positiva nelle cellule non trattate. Questo processo può essere eseguito anche utilizzando la caspasi-1 carenti macrofagi. Nota: L'offset deve essere regolato per ogni canale utilizzato nell'esperimento, ma impostare l'offset corretto è più critica per il canale di FAM-YVAD-FMK e canali dell'anticorpo fluorescente. L'offset per il canale di DNA è meno critica. Una volta che l'offset è stato impostato, non modificare questa impostazione per il resto dell'esperimento.</li>
	<li>Passare alla diapositiva al campione Nigericina trattato. Trovare un campo che contiene entrambe le celle che sono positivi e negativi per la macchiatura FAM-YVAD-FMK. Regolare il piano di formazione immagine del canale FAM-YVAD-FMK per l'aereo che ha la massima intensità di macchiatura positiva. Normalmente questo sarà il piano dove è ripreso il centro della messa a fuoco inflammasome.</li>
	<li>Regolare il guadagno in modo che i fuochi sono visibili nelle cellule che hanno nuclei condensati. Dopo l'impostazione offset e guadagno, lasciare queste impostazioni per il resto della sessione di imaging. Nota: Un modo semplice per determinare se una cella è pyroptotic è osservando la morfologia nucleare. Cellule con attiva la caspasi-1 hanno arrotondato e nuclei condensati, mentre i nucleoli sono visibili nelle cellule senza l'attivazione di caspasi-1 e la morfologia nucleare è simile a quelle delle cellule non trattate.</li>
	<li>Raccogliere immagini di 5 campi selezionati in modo casuale a 100x ingrandimento totale. Normalmente questo si tradurrà in circa 40 celle per ogni immagine. Ripetere questo processo per ogni campione.</li>
	<li>Contare il numero di cellule in ogni immagine utilizzando software di analisi di immagine. Poi contare il numero di cellule che hanno la macchiatura positiva di FAM-YVAD-FMK. Rappresentano il livello di attivazione di caspasi-1 come la percentuale di cellule positive FAM-YVAD-FMK.</li>
</ol>7. analisi del rilascio LDH
Nota: Per il test di rilascio LDH, seme e prime di che le cellule come descritto nella sezione precedente, ad eccezione utilizzare una piastra ben 96. Non rimuovere il supporto dopo l'innesco.
<ol><li>Aggiungere 50 μL di DMEM-5 contenente 10 μM Nigericina ai pozzi sperimentali e 50 μL DMEM-5 per i pozzetti di controllo Lisi spontanei e 100%. Non aggiungere glicina in questo esperimento, poiché l'obiettivo è quello di misurare la lisi cellulare. Incubare per 60 min a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 30 min, aggiungere 10 μL di tampone di lisi 10 x 100% Lisi controllo pozzetti e aggiungere 10 μL di DMEM-5 altri pozzetti. Durante questa incubazione, rimuovere 1 flaconcino di mix di substrato (1,5 mL di substrato liofilizzato) e 1 aliquota di tampone del saggio (~ 12 mL) dal freezer e lasciarli scongelare protetta dalla luce a temperatura ambiente. Nota: Il mix di substrato contiene un sale di tetrazolio (iodonitro-tetrazolium viola), che viene convertito in un prodotto di formazano rosso.</li>
	<li>Dopo l'incubazione totale 60 min, centrifugare la piastra per 5 min a 500 x g a 10 ° C. Trasferire 50 μL del surnatante in un piatto fondo piatto chiaro. Durante questo tempo, aggiungere 12 mL di tampone nella fiala di mix di substrato e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di substrato in ogni pozzetto e incubare per 30 min al buio. Sono medie pozzi soli per valori vuoti. Controllare la targhetta dopo 15 min per assicurarsi che il segnale non supererà il limite di rilevamento del lettore della piastra.</li>
	<li>Dopo 30 min, aggiungere 50 μL di soluzione di arresto (1 M di acido acetico) e misurare OD490 utilizzando un lettore di piastra.</li>
	<li>Calcolare la percentuale di lisi cellulare utilizzando la seguente formula: Citotossicita % = ((Experimental-Spontaneous) / (massimo-spontanea)) × 100 Sperimentale: le cellule Nigericina trattato; spontaneo: non trattata di cellule; massima: cellule esposte al buffer di lisi</li>
</ol>

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Gli autori non hanno conflitti di interesse di divulgare

In questo manoscritto, abbiamo presentato due tecniche per esaminare inflammasome attivazione e la conseguenza dell'attivazione di caspase-1 che segue NLRP3 stimolazione in macrofagi murini derivanti dal midollo osseo. La prima tecnica consente al ricercatore di determinare il livello di attivazione di caspasi-1 su una base cellulare utilizzando il reporter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Questo giornalista è altamente specifico per l'associazione della famiglia di caspase-1 degli enzimi, come si vede dall'assenza di colorazi...

Inflammasome-ha mediato l'infiammazione è una componente critica della difesa contro organismi patogeni1, ma anche sottende l'eziologia di molte malattie2. La risposta infiammatoria ad una vasta gamma di infezioni viene attivata dal rilevamento citosolico di agente patogeno connesso pattern molecolari (PAMPs) o danni associati pattern molecolari (Damp). Recettori di riconoscimento di pattern (PRR), compresi i membri della famiglia del recettore NOD-like (NLR), oligomerizzazione dopo il rilevamento di questi PAMP e DAMPs. Questo innesca la formazione di un complesso multiproteico chiamato il inflammasome, che contiene il PRR, la proteina dell'adattatore apoptosi-collegata speck-come proteina contenente un dominio di caspase-reclutamento del C-terminale (scheda) (ASC) e il pro-forma di caspasi-13,4. Questo complesso permette di prossimità-indotto auto-attivazione di caspasi-1. Attiva la caspasi-1 quindi conduce ad un insieme di eventi che caratterizzano la cellula infiammatoria morte via pyroptosis. Tali eventi includono: la scissione e il rilascio di citochine infiammatorie IL-1 β e IL-18, esocitosi lisosoma con rilascio di lysosomal contenuto nello spazio extracellulare, condensazione nucleare e gasdermin D clivaggio. Il dominio N-terminale rilasciato di gasdermin D inserisce nella membrana plasmatica, formando pori che causano la rottura della membrana del plasma ed il rilascio del contenuto infiammatorio, oltre a togliere una nicchia protettiva per agente patogeno replica5, 6 , 7.
Qui, ci concentriamo sul inflammasome NLRP3 ben studiato. L'attivazione del inflammasome NLRP3 avviene attraverso un processo di due passaggi8. Il primo passo di "adescamento" avviene attraverso il riconoscimento di recettori Toll-like (TLR) di un prodotto microbico. Questo è replicato nell'impostazione del laboratorio usando LPS per stimolare TLR4. Questa stimolazione sopraregola NLRP3 e pro-IL-1 β attraverso segnalazione di NF-kB. Adescamento inoltre licenze NLRP3 attraverso meccanismi non-trascrizionale inducendo la sua deubiquitinazione9,10 e fosforilazione o defosforilazione di specifici residui11,12.
Il secondo segnale per l'attivazione NLRP3 è pensato per coinvolgere fattori mitocondriali, specie reattive dell'ossigeno, efflusso di potassio e calcio segnalazione, anche se un meccanismo unificante per l'attivazione NLRP3 rimane inafferrabile8. NLRP3 attivato oligomerizes attraverso le interazioni tra i suoi domini NACHT e reclute ASC tramite associazione dei domini pirina (PYD)13. In ogni cella, questi complessi macromolecolari formano un singolo fuoco microscopicamente visibile. ASC è stata originariamente identificata come una proteina di KDa 22 che si forma un "granello" durante l'apoptosi di cellule umane di leucemia e denominata apoptosi-collegata speck-come proteina che contiene una carta14. In seguito fu stabilito che ASC reclute pro-caspase-1 attraverso l'interazione della scheda di ASC con la carta del pro-caspase-1, formando il inflammasome15.
Non tutte le NLRs richiedono la presenza di ASC per indurre l'attivazione di caspasi-1. A differenza di NLRP3, NLRC4 e NLRP1b hanno carta domini e può reclutare direttamente pro-caspase-1 tramite interazioni di CARD-CARD per indurre l'attivazione di caspasi-1. In assenza di ASC, attiva la caspasi-1 rimane diffusa in tutto il citosol e non forma un singolo fuoco. Questa diffusa attiva caspasi-1 è sufficiente per indurre la morte delle cellule di pyroptotic, ma è in grado di elaborare pro-IL-1 β13,16.
In questo manoscritto, discuteremo due modi per valutare l'attivazione inflammasome. Il primo utilizza l'attività fluorescente della sonda, FAM-YVAD-FMK, che lega la famiglia delle proteasi caspasi-1. Questa famiglia comprende caspasi-1, ma anche del mouse caspase-11 e umano caspase-4 e caspase-5. Utilizzando i macrofagi dai topi caspase-1/11 in tutti gli esperimenti, si affronterà la specificità di questa sonda. Questo metodo può essere combinato con l'anticorpo etichettatura dei componenti inflammasome, che descriveremo anche. Visualizzazione al microscopio permette l'identificazione delle singole celle contenenti active caspasi-1 e oligomerico ASC. Utilizzando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di determinare dove nella cascata di formazione inflammasome loro manipolazioni della cellula ospite o l'organismo patogeno sotto studio hanno un effetto. Ad esempio, si può distinguere se un determinato intervento previene l'assunzione di ASC per la NLRP3 complesse o le destinazioni il successivo reclutamento e attivazione di caspasi-117. Esaminando i risultati dell'attivazione di caspasi-1 come la secrezione di IL-1 β non sarebbe in grado di distinguere tra queste due possibilità. Inoltre, la secrezione di IL-1 β potrebbe essere alterata senza alterare la capacità delle cellule di attivare le caspasi-1 e subire pyroptotic delle cellule morte16.
Il secondo metodo misura il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) nella cella surnatante, che si verifica durante la lisi del macrofago pyroptotic seguendo l'attivazione di caspasi-1, come descritto in precedenza. Questo secondo metodo è un approccio basato sulla popolazione come bene è misurato il rilascio di LDH in tutto l'edificio. Questo semplice approccio permette l'analisi rapida (30 min di incubazione) di campioni per determinare se c'è morte caspase-1-mediata delle cellule e può essere eseguito in un formato di piastra a 96 pozzetti.
Questi metodi sono complementari, ciascuno con vantaggi diversi ed entrambi sono facilmente suscettibili di modifiche. Ad esempio, trattamento del macrofago con composti di peso molecolare mirata prima inflammasome stimolazione può essere utilizzato per studiare il ruolo di alcune proteine possono avere su come controllare le risposte infiammatorie.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Per la crescita di cellule L929</td></tr><tr><td>Clone NCRC 929 (L929)</td>Kit di fissazione/permeabilizzazione <td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr> BD <tr><td></td><td>Biosciences</td><td>554714</td><td>Include soluzione di fissazione e permeabilizzazione e tampone di lavaggio. Formulazioni proprietarie. Contiene il 4,2% di formaldeide</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 Saggio di citotossicità non radioattiva</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>Include una miscela di substrati e un tampone per il saggio; Formulazioni proprietarie. La soluzione di arresto è 1 M Acido acetico</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, senza glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, senza glutammina, senza fenolo rosso</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, origine statunitense</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Calore inattivato a 55 gradi C per 50 min</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Formulazione brevettata. Mezzo di montaggio polimerizzante. Indurisce fino a un indice refrattario di 1,46</td></tr><tr><td>ALEXA555 anti-topo</td><td>di capra Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Ioduro</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>rosso lontano fluorescente colorante per acido nucleico</td></tr><tr><td>C57BL/6J topo</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>caspasi-1/11-/- topo</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS ultrapuro da Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-ASC 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercapto-etanolo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre Spectramax M3</td><td>Molecular Devices</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di attivazione inflammasome e morte delle cellule pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes sono innate piattaforme di segnalazione immuni che sono necessari per il controllo di successo di molti organismi patogeni, ma anche promuovono infiammatori e malattie autoinfiammatorie. Inflammasomes sono attivati da recettori di riconoscimento modello citosolico, compresi i membri della famiglia del recettore (NLR) NOD-come. Questi recettori oligomerizzazione al rilevamento di stimoli microbici o danni associati. Successiva assunzione della proteina adattatore ASC forma un inflammasome microscopicamente visibili complessi, che attiva la caspasi-1 attraverso l'auto-attivazione indotta da vicinanza. Dopo l'attivazione, caspasi-1 fende il pro-IL-1 β e pro-IL-18, che porta alla attivazione e secrezione di queste citochine pro-infiammatorie. Caspasi-1 media anche la forma infiammatoria della morte delle cellule, chiamata pyroptosis, che presenta la perdita di lisi delle cellule e l'integrità della membrana. Caspasi-1 fende gasdermin D, rilasciando il frammento N-terminale che forma i pori della membrana plasmatica, che porta alla lisi osmotica.
In vitro, l'attivazione di caspasi-1 può essere determinato dall'etichettatura derivate da midollo osseo macrofagi con la sonda di attività caspase-1 FAM-YVAD-FMK e identificando le cellule con anticorpi contro la proteina dell'adattatore ASC. Questa tecnica permette l'identificazione di inflammasome formazione e attivazione di caspasi-1 nelle singole celle utilizzando la microscopia a fluorescenza. Pyroptotic la morte delle cellule può essere rilevata misurando il rilascio di lattato deidrogenasi citosolica nel mezzo. Questa procedura è semplice, conveniente ed eseguita in un formato di piastra a 96 pozzetti, consentendo l'adattamento per lo screening. In questo manoscritto, indichiamo che l'attivazione del inflammasome NLRP3 di Nigericina conduce alla co-localizzazione della proteina dell'adattatore ASC e attiva caspase-1, che conduce a pyroptosis.

Per rilevare l'attivazione di caspasi-1 dopo l'esposizione a Nigericina, le cellule sono state elaborate come descritto nella sezione protocollo. Abbiamo combinato sia FAM-YVAD-FMK e ASC anticorpo etichettatura al fine di dimostrare che ASC e attiva caspase-1 co-localizzano dopo l'attivazione inflammasome NLRP3-mediata. Figura 1A Mostra che i macrofagi di tipo selvaggio esposti a 5 μM Nigericina formazione di un focus ASC nella regione perinucleare. Questi fu...

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono esaminare l'attivazione dell'inflammasoma a livello di singola cellula tramite microscopia a fluorescenza e misurare la lisi durante la piroptosi mediante un saggio di rilascio di lattato deidrogenasi o LDH. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'inflammasoma, come ad esempio come viene regolata l'attivazione della caspasi-1. Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono all'utente di esaminare più passaggi dell'attivazione dell'inflammasoma e delle vie della piroptosi.A dimostrare la procedura sarà Andreas den Hartigh, un ricercatore del mio laboratorio. Iniziare sostituendo il terreno di macrofagi derivati dal midollo osseo innescati con LPS seminati su vetrini coprioggetti con 290 microlitri di terreno DMEM 5, integrato con cinque nigericina micromolare e cinque millimolari di glicina, per pozzetto. Rimettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore per colture cellulari per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, aggiungendo 10 microlitri di 30X FAM-YVAD-FMK dopo i primi 15 minuti.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS freddo per pozze

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un metodo per rilevare l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi utilizzando sonde reporter fluorescenti. Le cellule vengono trattate con ionofori di potassio e glicina per indurre l'assemblaggio dell'inflammasoma e l'attivazione della caspasi-1. Le sonde reporter fluorescenti visualizzano la caspasi-1 attivata e le cellule vengono colorate con un colorante fluorescente per la visualizzazione dei nuclei.

Rilevamento dell'attivazione dell'inflammasoma tramite microscopia a fluorescenza

Questo video dimostra una tecnica per studiare la formazione di inflammasomi NLRP3 (NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3) nei macrofagi primari tramite immunofluorescenza. I macrofagi vengono prima innescati con lipopolisaccaride batterico (LPS) per sovraregolare l'espressione della proteina NLRP3. L'esposizione dei macrofagi alla nigericina, uno ionoforo di potassio, porta all'attivazione di NLRP3 e alla formazione di inflammasomi, che vengono visualizzati tramite...

Una tecnica in vitro per studiare la formazione di complessi inflammasomici nei macrofagi

Questo video dimostra il test della lattato deidrogenasi per rilevare la morte dei macrofagi mediata dall'inflammasoma. I macrofagi sono esposti al lipopolisaccaride per il priming, seguito dall'esposizione alla nigericina per causare la morte cellulare indotta dall'inflammasoma, che è determinata dal saggio della lattato deidrogenasi.

Un test di rilascio di lattato deidrogenasi per rilevare la morte dei macrofagi a seguito di esposizione alla nigericina

Questo video dimostra la valutazione delle attivazioni multiple delle caspasi nei macrofagi derivati dal midollo osseo attraverso la stimolazione con il virus dell'influenza. Dopo la lisi dei macrofagi, l'inattivazione termica del lisato e la centrifugazione, le caspasi intracellulari vengono raccolte per la successiva analisi immunologica.

Valutazione dell'attivazione di caspasi multiple nei macrofagi

L'articolo descrive un semplice facilmente...

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β.

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi derivati da monociti (MDM) da campioni di sangue umano, un metodo semplice per introdurre in modo efficiente i reporter della complementazione di fluorescenza bimolecolare della caspasi infiammatoria (BiFC) nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare e un approccio basato sull'imaging per misurare l'attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

Impara a rilevare l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi murini derivati dal midollo osseo mediante microscopia a fluorescenza e saggi di rilascio di LDH. Questo metodo consente di studiare la pirosi a livello di singola cellula.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

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