Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis
15 marzo 2018
In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere registrazioni elettrofisiologiche di intere cellule dai neuroni del tettario ottico del girino al fine di conoscere il loro modello di connettività durante lo sviluppo e, in ultima analisi, di capire come si formano e funzionano i circuiti neurali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo neurale, come ad esempio come cambiano i neuroni nel corso dello sviluppo e come funzionano i circuiti per dare origine al comportamento. Il vantaggio principale di questi preparati è che consentono la registrazione elettrofisiologica dei neuroni del tectum ottico per fornire informazioni sulla funzione dei circuiti neurali in via di sviluppo.
A dimostrare la procedura sarà Zhenyu Lui, uno studente laureato nel mio laboratorio. Utilizzando una pipetta di trasferimento per lo smaltimento, spostare il girino anestetizzato in una capsula di registrazione della dissezione contenente una soluzione di registrazione esterna. Fissare il girino anestetizzato a un blocco di silicone sommerso sul pavimento del piatto di registrazione da dissezione.
Per una visione chiara del cervello, rimuovere la pelle sovrastante il cervello praticando un'incisione superficiale lungo la linea mediana utilizzando un ago sterile calibro 25. Filettare il cervello lungo lo stesso asse della linea mediana inserendo l'ago nel tubo neurale e tirando delicatamente verso l'alto in modo tale che la parte dorsale del tubo venga tagliata in modo netto lasciando intatta la placca del pavimento. Per isolare il cervello, utilizzare prima un ago calibro 25 per recidere il rombencefalo.
Quindi far scorrere delicatamente l'ago sotto il cervello in direzione da caudale a rostrale per recidere tutto il tessuto connettivo laterale e ventrale e le fibre nervose. Successivamente, fissare il cervello a un blocco di elastomero siliconico posizionando uno spillo attraverso uno dei bulbi olfattivi e un altro perno attraverso il rombencefalo. Questa è la configurazione ottimale per la registrazione dai neuroni tectali.
Quindi spostare la capsula contenente la preparazione dell'intero cervello appuntata dal cannocchiale di dissezione al rig di elettrofisiologia. Rimuovere la membrana ventricolare utilizzando una pipetta di vetro rotta. Per attivare direttamente gli assoni RGC, abbassare delicatamente un elettrodo stimolante bipolare sul chiasma ottico in modo tale che si formi una piccola ammaccatura nel tessuto.
L'elettrodo stimolante bipolare deve essere rostrale e quasi adiacente al grande ventricolo medio dove si trova il chiasma ottico. L'elettrodo bipolare è azionato da uno stimolatore a impulsi che consente di controllare con precisione la forza della stimolazione. Per preparare la fetta orizzontale del cervello, inizia con la preparazione dell'intero cervello.
Quindi utilizzare una lama di rasoio per asportare il quarto più laterale di un lato di un tectum ottico. Questo taglio viene eseguito parallelamente al piano caudale rostrale. Successivamente, fissare nuovamente il cervello al lato dell'elastomero siliconico con il lato tagliato rivolto verso l'alto in modo che il somata e il neuropilo possano essere accessibili direttamente per la registrazione e la superficie ventricolare del cervello rivolta lontano dal blocco dell'elastomero siliconico in modo che un elettrodo bipolare possa essere posizionato sul chiasma ottico.
Quindi eseguire il patch clamp dell'intera cella o la registrazione del potenziale di campo locale. Ecco lo schema che mostra la configurazione di una preparazione orizzontale della fetta di cervello. Si noti che, sebbene l'elettrodo stimolante rimanga sul chiasma ottico, la pipetta di registrazione è ora posizionata per accedere alle cellule in tutti gli strati tectali esposti dalla preparazione della fetta cerebrale orizzontale.
Questa è una risposta evocata da RGC da un neurone che risiede nello strato superficiale del tectum. In questa figura, i potenziali di campo registrati attraverso il neuropilo e le densità di sorgente di corrente convertite sono mostrati da un grafico a immagini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro 10 minuti e in genere dura fino a tre o quattro ore.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la preparazione dell'intero cervello e della fetta orizzontale del cervello per le registrazioni di intere cellule al fine di quantificare le proprietà elettriche dei neuroni tectali e la loro connettività.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio esplora le tecniche di registrazione con microelettrodo a patch su cellule intere per analizzare il circuito retinotettale nei girini di Xenopus laevis. Attraverso l'utilizzo di diverse preparazioni cerebrali, la ricerca mira a comprendere i modelli di connettività dei neuroni nel tetto ottico del girino durante lo sviluppo e la funzione generale dei circuiti neurali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Circuiti neurali
Sfondo
- Studiare come si formano e funzionano i circuiti neurali negli organismi in via di sviluppo.
- Il circuito retinoteuttale è fondamentale per l'elaborazione visiva negli anfibi.
- I girini di Xenopus laevis costituiscono un modello prezioso per lo studio della connettività neurale.
- Le registrazioni in voltometria su cellula intera forniscono informazioni dettagliate sull'attività neuronale.
Scopo dello studio
- Comprendere i modelli di connettività tra i neuroni nel tetto ottico.
- Analizzare come i neuroni cambiano durante lo sviluppo.
- Esplorare come i circuiti neurali contribuiscono al comportamento.
Metodi Utilizzati
- Sono stati utilizzati metodi di patch clamp su cellule intere per le registrazioni elettrofisiologiche.
- Il modello biologico prevedeva cervelli di girino dissezionati per lo studio dei neuroni del tetto ottico.
- Non sono stati menzionati flussi di lavoro multi-omici.
- I passaggi specifici includevano l'immobilizzazione del girino, l'isolamento del cervello e l'esecuzione di registrazioni mirate.
- I metodi permettono di effettuare registrazioni entro un intervallo di tempo cruciale di 10 minuti, che di solito durano diverse ore.
Risultati principali
- Le preparazioni hanno consentito con successo la registrazione dell'attività neuronale nel tetto.
- Sono stati osservati cambiamenti elettrofisiologici indicativi di connettività neurale.
- I risultati hanno stimolato discussioni sulle implicazioni funzionali del circuito retinotetto.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della circuitazione neurale nello sviluppo.
Conclusioni
- Questa ricerca dimostra metodi efficaci per lo studio della connettività neurale nei cervelli di girini in via di sviluppo.
- Lo studio migliora la comprensione della funzione dei circuiti neurali durante lo sviluppo.
- I risultati hanno implicazioni più ampie per l'esame dei processi neurologici e dei comportamenti negli anfibi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La registrazione con tecnica del patch clamp su cellule intere in girini di Xenopus laevis permette un'analisi ad alta risoluzione della formazione e della funzione dei circuiti neurali, fornendo informazioni meccanicistiche sulla connettività sinaptica e sull'eccitabilità neuronale durante lo sviluppo. Questo approccio supporta la validazione di bersagli in neuroscienze consentendo la misurazione diretta delle risposte neuronali a stimoli definiti, come l'attività evocata dalle cellule gangliari retiniche nel tetto ottico. L'adattabilità di questo metodo a preparazioni in vivo, di cervello intero e di sezioni orizzontali ne migliora la riproducibilità e la scalabilità per la riduzione del rischio preclinico dei bersagli nello sviluppo neurologico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le risposte neuronali agli stimoli sensoriali, chiarificando la connettività funzionale nei circuiti in via di sviluppo.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso letture elettrofisiologiche dirette dell'attività neuronale, riducendo l'ambiguità nell'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a modifiche misurabili nell'eccitabilità neuronale tegmentale e nell'integrazione sinaptica.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo preparazioni neuronali stabili e registrabili con proprietà definite di risposta allo stimolo.
- Output quantitativi: Genera misurazioni elettrofisiologiche come correnti postsinaptiche e potenziali di campo, consentendo l'analisi dose-risposta e la quantificazione degli effetti dei composti.
- Riutilizzo della piattaforma: La preparazione di fette cerebrali orizzontali permette la registrazione attraverso tutti gli strati tettoiali, aumentando la produttività e la coerenza per sessioni sperimentali ripetute.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella processi neurosviluppali rilevanti per disturbi associati a un errato assemblaggio dei circuiti, favorendo l'esplorazione di biomarcatori traslazionali.
- Continuità preclinica: Collega scoperta e validazione consentendo la registrazione costante della funzione neuronale in diversi punti temporali dello sviluppo.
- Decisioni basate sul rischio: Supporta criteri di avanzamento o interruzione basati su fenotipi elettrofisiologici, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dei programmi neurosviluppali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una validazione funzionale dei bersagli neuronali prima dell'ottimizzazione del composto leader, con risultati che informano sia la selezione del bersaglio sia la comprensione meccanicistica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi registrando le risposte evocate nei neuroni tettoali a seguito della stimolazione degli assoni delle cellule gangliari retiniche.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso preparazioni riproducibili di cervello intero e di sezioni, fornendo letture elettrofisiologiche quantificabili per lo screening di composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti come ampiezze della corrente e latenza, facilitando il confronto tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validità preclinica mantenendo proprietà circuitali rilevanti per la malattia attraverso diverse preparazioni, sostenendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma elettrofisiologica riutilizzabile adattabile a diversi contesti sperimentali, riducendo lo sviluppo ridondante di metodi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante la registrazione diretta dei neuroni.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori grazie a protocolli di preparazione definiti per metodi in vivo, su cervello intero e su sezioni.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo il rilevamento precoce di composti inefficaci, riducendo gli investimenti in obiettivi non praticabili.
- Impatto sul portafoglio: Informa le decisioni di avanzamento corrette per il rischio collegando gli esiti elettrofisiologici alla funzione a livello di circuito.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia e tecniche di dissezione microchirurgica per una preparazione cerebrale riproducibile.
- È dipendente da soluzioni di registrazione extracellulare stabili e da apparecchiature di stimolazione funzionali per ottenere risposte evocate affidabili.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di stimolo e delle impostazioni di registrazione per garantire la confrontabilità dei dati.
- L'adattamento tra diversi sistemi modello può richiedere modifiche alle metodiche di dissezione e di semina in base alle dimensioni cerebrali e alla loro accessibilità.
- I limiti pratici includono tassi di successo dipendenti dall'operatore e la stabilità della preparazione durante sessioni di registrazione prolungate.
