La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la specificità della proteasi in più estratti grezzi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per determinare la specificità della proteasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può identificare la specificità della proteasi di più campioni in parlay.

Campioni di tessuto polmonare freddo ottenuti da topi maschi ICR in ghiaccio. Omogeneizzare i campioni a 20.000 RMP per 30 secondi in un frullatore. Ripetere questo passaggio fino a quando i campioni non sono completamente omogenei.

Non omogeneizzare per più di un minuto ininterrottamente per evitare un aumento della temperatura. Trasferire 1.000 microlitri di omogeneizzato in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius. Trasferire 500 microlitri di surnatante in un nuovo tubo di plastica da 1,5 millilitri.

Utilizzare 10 microlitri di campione per determinare la concentrazione proteica. Utilizzando metodi, come il test dell'acido bicinchoninic o il test di Bradford. Per evitare il congelamento, aggiungere l'80% di glicerolo ai campioni per una concentrazione finale del 50% di glicerolo.

Per chiarire la differenza nella specificità della proteasi a seconda del pH, utilizzare tamponi per la digestione regolati a pH tre, cinque, sette e nove. In 890 microlitri di un tampone per la digestione, aggiungere 10 microlitri di 0,1 microgrammi per microlitro di tripsina TPCK, 0,1 microgrammi per microlitro di proteasi V8 di stafilococco aureo o 10 microgrammi per microlitro di estratti tissutali. Preparare i controlli negativi inattivando la proteasi negli estratti tissutali mediante incubazione e facendo bollire l'acqua per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere 10 microlitri di substrati di etichette di biotina MNO ai campioni e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius per digerire. Dopo l'incubazione, interrompere la digestione dei substrati con acqua bollente per 10 minuti. Centrifugare i substrati digeriti per cinque minuti a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 millilitri di perle di streptavidina sefarosio al 50% in un tampone tris molare, contenente lo 0,1% di poliossietilene ottilfenil etere. Utilizzare carta per il test del pH per assicurarsi che la soluzione sia intorno al pH nove.

È importante regolare il pH corretto a nove o più. L'amminobiotina non può mordere una perlina a meno che non abbia un pH nove o superiore. Se il pH della soluzione è basso, regolarlo a circa pH nove aggiungendo altro tampone.

Inoltre, è possibile aggiungere un tampone tris molare per aumentare il pH, se necessario. Incubare la sospensione per una notte a quattro gradi Celsius con una miscelazione delicata continua su una ruota rotante per legare i substrati marcati con biotina MNO alla streptavidina. Le perle devono rimanere sospese per tutta l'incubazione.

Il giorno seguente, centrifugare i campioni per un minuto a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, lavare le perle aggiungendo 1.000 microlitri di un tampone di lavaggio. Quindi, incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius mescolando delicatamente e continuamente su un rotatore.

Centrifugare le perle per un minuto a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e ripetere questo lavaggio quattro volte. Quindi, aggiungere 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,2% alle perline.

Utilizzare carta per il test del pH per assicurarsi che la soluzione sia inferiore a pH due. Se il pH della soluzione è alto, regolare il pH al di sotto di due aggiungendo acido trifluoroacetico all'1%. Incubare la sospensione per 30 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente in modo continuo su una ruota rotante.

Dopo aver centrifugato le perle come prima, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Pipet 20 microlitri di acetonitrile su una resina C18 per attivarlo. Rimuovere l'acetonitrile usato e ripetere questo passaggio di attivazione tre volte.

Quindi, equilibrare la resina C18 con 20 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%. Rimuovere l'eluente e ripetere questo passaggio di equilibratura tre volte. Per caricare i campioni, legarli alla resina utilizzando una pipetta.

Lavare la resina con 20 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%. Ripeti questo passaggio cinque volte. Eluire i campioni con tre microlitri di acetonitrile al 60% in acido trifluoroacetico allo 0,1%.

Pipet l'eluente su una piastra bersaglio per la spettrometria di massa MALDI-TOF. Aggiungere immediatamente la soluzione di CHCA, satura in acetonitrile al 50% in acido trifluoroacetico allo 0,1%. Cristallizzare la miscela mediante essiccazione all'aria.

Acquisire spettri di massa dei campioni, secondo il protocollo del produttore dello strumento, prestando particolare attenzione agli spettri di massa da 700 a 900 dalton per la forma scissa dei substrati delle etichette di biotina. Gli spettri di massa dei substrati sintetici sono mostrati qui. Picchi corrispondenti al peso molecolare del precursore sono stati rilevati tra 850 e 1.050.

I frammenti tagliati vengono rilevati nell'intervallo da 700 a 850. Qui sono mostrati gli spettri per i substrati marcati con biotina MNO trattati con tripsina TPCK. I picchi di 839,81 dalton e 796,76 dalton corrispondono ai frammenti tagliati dal terminale C rispettivamente di lisina e arginina.

Qui sono mostrati gli spettri di massa di substrati sintetici digeriti con proteasi V8. I picchi di 769,78 dalton e 755,62 dalton corrispondono ai frammenti tagliati dall'estremità C rispettivamente dell'acido glutammico e dell'acido aspartico. Qui sono mostrati gli spettri per i substrati delle marcature di biotina MNO trattati con un estratto di tessuto polmonare a varie condizioni di pH.

Allo stato acido, a pH cinque, il peso molecolare di un frammento scisso era di 770,13 dalton e 826,66 dalton, indicando la scissione all'estremità C dell'acido glutammico e del triptofano. Nella condizione neutra e basica, a pH sette e nove, il peso molecolare di un frammento scisso è stato aumentato al picco di 767 dalton e 840 dalton, indicando la scissione all'estremità C di arginina e lisina. Al contrario, i picchi dell'acido glutammico e del triptofano sono diminuiti.

Inoltre, questo metodo non è in grado di rilevare frammenti scissi con estratti inattivati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente, ad eccezione della sintesi del substrato. Inoltre, una volta sintetizzato, il substrato può essere misurato in diversi campioni. Perché?

Tentando questa procedura, è importante ricordarsi di operare al pH del tampone, circa nove. Generalmente, la reazione del complesso avidina ammino-biotina. Seguendo questa procedura, è possibile quantificare l'attività enzimatica eseguendo un CMS.

Questo metodo consentirà ai ricercatori nel campo dei proteoni di aprire la strada all'esplorazione dell'espressione della proteasi in diverse condizioni.