Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

L'obiettivo generale di questa preparazione di una libreria di CDNA è quello di consentire il sequenziamento di successo di piccoli RNA che sono stati conservati in tessuti formali e fissati inclusi in paraffina. Questo metodo è molto utile per l'analisi di campioni formali e fissi inclusi in paraffina. Si estrae l'RNA da un massimo di 18 campioni, si analizza il contenuto di tutti questi e si ottiene un profilo di tutta la microRNasi per tutti i campioni.

Per iniziare il protocollo, aggiungere 8,5 microlitri di master mix di legatura precedentemente preparato a ciascuno dei 18 campioni FFPERNA aliquotati individualmente. Agitare delicatamente le provette e centrifugare per due secondi. Dopo la centrifugazione, conservare le provette con ghiaccio.

Utilizzare una pipetta da tre microlitri per trasferire un microlitro di ciascun adattatore ai corrispondenti campioni FFPERNA contenenti RNA e master mix di legatura. Non pipettare su e giù e non cambiare i puntali tra i campioni FFPERNA. Chiudere ogni tubo, frullare per mescolare e centrifugare per due secondi.

Metti i tubi sul ghiaccio. Denaturare le reazioni posizionando i tubi su un blocco termico a 90 gradi Celsius per un minuto, quindi posizionarli immediatamente sul ghiaccio. Quindi, utilizzare una pipetta da tre microlitri per trasferire un microlitro dell'enzima di ligazione diluito in ciascuno dei 18 campioni di RNA.

Mettere le legature sul ghiaccio e metterle in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius per un'incubazione notturna di 18 ore. Posizionare i tubi su un blocco termico per un minuto a 90 gradi Celsius per disattivare la reazione di legatura e poi rimetterli nel ghiaccio per almeno due minuti per raffreddarli. Trasferire 1,2 microlitri della miscela master di precipitazione in ciascuna provetta.

Aggiungere 63 microlitri di etanolo al 100%. Chiudere ogni provetta, agitare le provette per mescolare e centrifugarle per due secondi. Metti i tubi sul ghiaccio.

Unire il contenuto di tutte le 18 provette in un'unica provetta siliconata da 1,5 millilitri e capovolgere tre volte per mescolare. Centrifugare le provette per due secondi e metterle sul ghiaccio per 60 minuti per farle precipitare. Dopo la precipitazione, centrifugare la provetta da 1,5 millilitri con le legature raggruppate.

Quindi, rimuovere il surnatante con un puntale per pipetta da un millilitro, ma lasciare un po' di liquido sul fondo. Inclinare la provetta e utilizzare una pipetta da 20 microlitri per rimuovere il surnatante rimanente. Aspirare il surnatante con una pipetta Pasteur con punta da 10 microlitri, quindi risospendere il pellet di RNA in 20 microlitri di acqua priva di RNasi muovendo il tubo.

Aggiungere 20 microlitri di soluzione di caricamento del gel PAA per risospendere l'RNA. Agitare la provetta, centrifugarla per due secondi a temperatura ambiente e mettere la provetta sul ghiaccio. Sostituire lo 0,5 XTBE precedentemente preparato dell'apparato in gel con 0,5 XTBE fresco e caricare quest'ultimo, i marcatori dimensionali e la RNasi legata al centro del gel, lasciando due pozzetti vuoti su entrambi i lati.

Quindi eseguire il gel. Dopo aver eseguito il gel, disfondere la pagina del 15% rimuovendo una delle lastre di vetro. Spruzzare leggermente il gel sulla lastra di vetro con 10 microlitri di soluzione colorante fluorescente e 25 millilitri di 0,5 XTBE e lasciarlo riposare per cinque minuti al buio.

Appoggiare il bicchiere con il gel su un transilluminatore a luce blu e allineare i marcatori di dimensione di 19 nucleotidi e 24 nucleotidi con un righello per dirigere l'escissione dei piccoli RNA legati. Quindi, asportare il gel. Mettere il gel asportato in una provetta da 0,5 millilitri progettata per frammentare le fette di gel, posizionata in modo sicuro in una provetta da microcentrifuga siliconata da 1,5 millilitri.

Centrifugare il gel a 16 mila volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Risospendere il gel frammentato con 300 microlitri di soluzione di cloruro di sodio da 400 millimolari. Chiudere il tubo e sigillarlo con pellicola di paraffina.

Agitare il contenuto su un termomiscelatore a 11 cento giri/min in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius per un'incubazione notturna. Il giorno successivo, recuperare la provetta dal termomiscelatore e utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire la soluzione su una provetta filtrante da cinque micrometri, inserita in una provetta di raccolta siliconata senza RNasi da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta per tre minuti a 23 volte G a temperatura ambiente.

Eliminare il tubo del filtro, aggiungere 950 microlitri di etanolo al 100% al tubo di raccolta contenente la soluzione filtrata e capovolgere il tubo per mescolare. Centrifugare la provetta per due secondi e metterla sul ghiaccio per 60 minuti. Quindi, precipitare il pellet di RNA.

Successivamente, asciugare il pellet di RNA aprendo il tappo e rimuovendo con cura il surnatante con una pipetta da un millilitro, lasciando un po' di liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta da 20 microlitri per rimuovere tutto il surnatante rimanente senza toccare il pellet. Inclinare il tubo in modo che l'eventuale soluzione rimanente si sposti sul lato opposto del pellet.

Utilizzare una pipetta Pasteur per aspirare il surnatante e asciugare il pellet utilizzando un vuoto. Risospendere il pellet di RNA in 5,6 microlitri di acqua priva di RNasi. Scongelare i reagenti di trascrizione inversa con ghiaccio per 15 minuti.

Imposta una reazione di trascrizione inversa aggiungendo tre microlitri di tampone 5X, 4,2 microlitri di diossinucleotide trifosfato 10X, o DNTP, e 1,5 microlitri di ditiotreitolo, o DTT. Muovere delicatamente la provetta per mescolare la reazione e centrifugare per due secondi per raccogliere la soluzione. Dopo che la reazione è su un blocco termico a 90 gradi Celsius per esattamente 30 secondi, trasferiscilo direttamente in un termo mixer a 50 gradi Celsius per due minuti per equalizzare la temperatura.

Aggiungere 0,75 microlitri dell'enzima di trascrizione inversa direttamente nella soluzione. Muovi delicatamente per mescolare e rimetti il tubo sul termo mixer a 50 gradi Celsius per 30 minuti immediatamente. Dopo 30 minuti, trasferire la provetta in un blocco termico a 95 gradi Celsius per un minuto per interrompere la trascrizione inversa.

Aggiungere 95 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente alla trascrizione inversa. Muovi il tubo per mescolare e mettilo direttamente sul ghiaccio per due minuti. Assemblare la reazione pilota della PCR e impostare due cicli di PCR sul termociclatore.

Impostare la reazione pilota della PCR sul termociclatore e avviare il file uno. Alla fine del primo file, utilizzare una pipetta da 20 microlitri per trasferire 12 microlitri dalla reazione pilota della PCR in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente tre microlitri di colorante 5X per il caricamento del gel. Miscelare pipettando su e giù.

E etichettalo 10 cicli. Chiudere la provetta pilota per PCR e avviare il file due sul termociclatore. Alla fine del secondo file, utilizzare una pipetta da 20 microlitri per trasferire 12 microlitri di soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con tre microlitri di colorante di caricamento gel 5X ed etichettarla per 12 cicli.

Ripetere i passaggi precedenti per raccogliere 12 microlitri di prodotti PCR dalla reazione PCR pilota ai cicli PCR 14, 16, 18 e 20. Quindi aggiungere tre microlitri di colorante di caricamento gel 5X a ciascuna delle aliquote PCR da 12 microlitri e alla scala da 20 nucleotidi contenente tre microlitri di scala e nove microlitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver analizzato i campioni su un gel di agarosio con 0,5 XTBE, valutare il gel su una scatola UV per identificare il ciclo PCR ottimale.

Quindi impostare le reazioni PCR su larga scala per la purificazione della libreria di gel di agarosio. Dopo l'amplificazione PCR, trasferire nove microlitri da ciascuna provetta PCR in sei provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri, contenenti tre microlitri di colorante caricante gel 5X. Prepara una scala da 20 nucleotidi.

Caricare la scala, il controllo PCR negativo e sei prodotti PCR sul gel di agarosio e far funzionare il gel per 30 minuti a 120 volt. Verificare l'uniformità delle implementazioni PCR tra le corsie su una scatola UV e scattare un'immagine. Combina tre reazioni PCR in due provette per microcentrifuga siliconate da 1,5 millilitri, aggiungi 27 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 950 microlitri di etanolo al 100%.

Capovolgere le provette per miscelarle e impostarle a 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare i prodotti della PCR. Utilizzando il protocollo, è stata accertata la correlazione dell'espressione del micro RNA tra i due RNA tumorali freschi congelati e le loro controparti specifiche del campione FFPERNA. I grafici tra il micro RNA fresco congelato e FFPE abbinato indicano che la preparazione della libreria CDNA fornisce una buona riproducibilità, poiché esiste un'elevata correlazione tra i microRNA rilevati in campioni trattati in modo diverso.

Per determinare se il protocollo di preparazione della libreria CNDA ottimizzato fosse applicabile e riproducibile con campioni FFPE sempre più vecchi, sono stati ottenuti profili di espressione di micro RNA da tessuti FFPE archiviati per 18, 20, 22, 27, 30 e 35 anni. Il coefficiente di correlazione è rimasto superiore a 0,96 indipendentemente dall'età del campione o dalla settimana di preparazione della biblioteca. Pertanto, il protocollo di preparazione della libreria CDNA ottimizzato fornisce uno strumento robusto per l'analisi riproducibile dei campioni FFPE, indipendentemente dal loro tempo di archiviazione.

Quindi, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come preparare le vostre piccole librerie di RNA e ottenere un profilo completo di microinespressione di tutti i vostri preziosi campioni formali e fissati inclusi in paraffina.