Name: Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri la preparazione di librerie cDNA per il sequenziamento di microRNA da campioni FFPE archiviati fino a 35 anni. Questo protocollo consente l'estrazione e l'analisi di piccoli RNA per la scoperta di biomarcatori.

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Si ringrazia il Dr. Thomas Tuschl, capo del laboratorio di biologia molecolare del RNA, come pure i membri del suo laboratorio per il loro sostegno e per condividere la tecnologia sviluppata nel suo laboratorio e fornire l'accesso alla pipeline di RNAworld. Ringraziamo anche il Dr. Markus Hafner per suo protocollo di condivisione e di fornire descrizioni dettagliate su tutti i passaggi biochimici ed enzimatici utilizzati nella sua procedura iniziale.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Gli autori desiderano rivelare che una pubblicazione contenente alcuni dei dati presentati in questo manoscritto è stata pubblicata nel giornale internazionale delle scienze molecolari di Loudig et al. 21.

Un protocollo di preparazione altamente riproducibile e robusto cDNA biblioteca per NGS di piccoli RNA archiviata negli esemplari di FFPE RNA è presentato in questo protocollo, che è una versione modificata e ottimizzata della procedura descritta da Hafner et al. 22
Tutti i passaggi del presente protocollo sono stati ottimizzati per l'uso con vecchio archiviato e compromesso RNA totale recuperato da campioni FFPE. Il passaggio chiave del presente protocollo, pe...

Mirna sono straordinariamente ben conservati in formalina-fisso paraffina (FFPE) esemplari1,2,3. Lavoro precedente ha dimostrato che l'espressione di queste breve non codificanti singolo incagliato RNA molecole regolatorie possono essere correttamente valutate utilizzando RNA totale da campioni FFPE e fornire dati di espressione genica rilevanti rispetto ai freschi originale tessuti4,5,6,7,8. Rispetto al RNA messaggeri di grandi dimensioni, che hanno dimostrato di essere interessati in modo critico da FFPE processazione dei tessuti (formaldeide, calore, essiccazione, ecc.), RNasi endogene e l'età dei campioni, le piccole dimensioni dei miRNA (~ 18 – 24 nucleotidi) appare per renderli resistenti alla degradazione e resiliente per immagazzinaggio a lungo termine, hanno dimostrato attraverso studi di espressione di miRNA che superano le prestazioni studi di mRNA di alto-rendimento archiviati esemplari9. studi di espressione di miRNA utilizzando campioni clinici archiviati, che sono stati effettuati principalmente nelle analisi su piccola scala, hanno dimostrato quel singolo o multiplex analisi quantitative di PCR, diversi tipi di tecnologie di microarray e, più recentemente, NGS può essere usato per valutare l'espressione dei miRNA conservati dopo l'ottimizzazione di questi saggi10,11,12,13,14.
Dato che la disregolazione dell'espressione dei miRNA è stata associata con lo sviluppo di una varietà di malignità umane e che c'è potenzialmente un enorme apporto di clinicamente annotato archiviati esemplari, è diventato evidente che questi piccoli RNA molecole rappresentano una promettente fonte di potenziale cancro biomarkers15,16,17,18. L'uso di una tecnologia di espressione genica di alto-rendimento come NGS ha il vantaggio di fornire una valutazione globale di tutte le trascrizioni di miRNA rispetto a tecnologie mirate come PCR e/o microarrays19. Per questo motivo, un protocollo ottimizzato, accessibile e facilmente applicabile per la preparazione di libreria di cDNA di piccoli RNA da esemplari più vecchi archiviati per NGS è stato ottimizzato per consentire studi retrospettivi su larga scala20.
Precedentemente abbiamo stabilito un protocollo di estrazione di RNA/DNA simultaneo per recupero separato del RNA e DNA da esemplari più vecchi archiviati, che abbiamo trovato a sovraperformare contemporanea kit commerciali21. Usando questo protocollo di estrazione, per ottenere il RNA totale da tessuti FFPE archiviati per un periodo prolungato di volte, abbiamo ottimizzato la preparazione di librerie di cDNA per NGS di Mirna conservati nei campioni clinici per fino a 35 anni. Inoltre, in uno studio recentemente pubblicato, dove, abbiamo preparato le librerie di cDNA da classificate clinicamente il carcinoma duttale in situ esemplari (DCIS), abbiamo identificato Mirna differenzialmente espressi sono stati convalidati mediante PCR quantitativa, che indicava che cambiamenti di espressione di miRNA specifici possono essere rilevabili nelle lesioni DCIS da pazienti che sviluppano il cancro al seno rispetto alle lesioni DCIS da pazienti che non sviluppano il cancro al seno.
Considerando il costo del kit commerciali per la preparazione di piccole librerie di cDNA di RNA, il potenziale per la loro sospensione, così come l'uso di reagenti protetta da copyright/brevetto che non può essere ottimizzata, abbiamo deciso di adattare un precedentemente pubblicati laboratorio-basato e kit-gratuita 3' protocollo di preparazione libreria cDNA da codice a barre per NGS di piccoli RNA archiviata negli esemplari di FFPE, che permette l'analisi simultanea di 18 campioni22. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata ideale e robusta con i checkpoint di valutazione visiva e tecnica, che erano critici per l'adattamento ai campioni FFPE RNA, e ha un forte potenziale per applicazione ad altre fonti di difficile o compromessa utilizzare materiale di RNA. Applicabilità del protocollo originale è stato migliorato sostituendo marcatore radioattivo etichettato con fluorescenti (ad es., SYBR Gold) indicatori di dimensione RNA rilevabili utilizzati durante la selezione delle librerie legate sul grande gel di poliacrilammide. Questo protocollo ottimizzato si basa sulla legatura della 3' adattatori con codice a barre a 18 singoli campioni FFPE RNA, che sono poi riuniti insieme per subire la legatura 5' adattatore, d'inversione-trascrizione e un'analisi PCR pilota per amplificazione del cDNA finale su misura Biblioteca prima dell'amplificazione PCR su larga scala, purificazione e NGS su un sequencer a resa elevata.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt ladder</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Siero Bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titanio Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di Ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Sistema di Elettroforesi Verticale su Gel con piastre di vetro e pettini</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuga 5424R</td><td>USA scientifico</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>USA scientifico</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Provette per microcentrifuga siliconate a bassa ritenzione 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Tubo rompigel 0,5 ml</td><td>IST Engineering Inc,</td> <td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel 7 cm x10 cm - Mini-sub Cell GT con vassoi e pettini in gel</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge centrifuga personale a doppio rotore</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Modello V16 apparecchio per elettroforesi su gel di poliacrilammide, occhiali, pettini e distanziatori</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotidi</td><td></td><td>IDT Defined durante l'ordine</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini sistema di elettroforesi - con vassoi e pettini</td><td>in gel Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza RNasi</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 transilluminatore a luce blu</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarosio</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi 2 Troncato K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler con coperchio riscaldato</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel system concentrato, diluente e tampone</td><td>Nazionale Diagnostica</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenziamento di microrna retrospettiva: protocollo di preparazione libreria dna complementare utilizzando campioni di rna di paraffina-incastonato formalina-fisso

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

– Archiviata, clinicamente classificati formalina tessuti paraffina-incastonati (FFPE) è in grado di fornire acidi nucleici per studi retrospettivi molecolari dello sviluppo del cancro. Utilizzando lesioni non invasive o pre-maligne da pazienti che successivamente sviluppano la malattia invasiva, analisi di espressione genica possono contribuire ad identificare le alterazioni molecolari iniziali che predispongono al rischio di cancro. È stata descritta bene che gli acidi nucleici recuperati dai tessuti FFPE hanno subito gravi danni fisici e modificazioni chimiche, che rendono difficile la loro analisi e generalmente richiede dosaggi adattati. I microRNA (Mirna), tuttavia, che rappresentano una piccola classe di molecole di RNA che coprono solo fino a ~ 18 – 24 nucleotidi, hanno dimostrato di resistere a deposito a lungo termine e sono state analizzate con successo in campioni FFPE. Qui presentiamo un 3' con codice a barre del DNA (cDNA) Biblioteca preparazione protocollo complementare specificamente ottimizzato per l'analisi di piccole molecole di RNA estratto dai tessuti archiviati, che recentemente è stata dimostrata per essere robusto e altamente riproducibile quando utilizzando archiviati campioni clinici memorizzati fino a 35 anni. Questa preparazione di libreria è ben adattata per l'analisi multiplex del materiale compromessa/degradato dove campioni di RNA (fino a 18) sono legati con singoli 3' adattatori con codice a barre e poi sommati insieme per le successive preparazioni enzimatiche e biochimiche prima dell'analisi. Tutte le purificazioni vengono eseguite mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina), che consente dimensioni specifiche selezioni e arricchimenti di piccole specie di RNA con codice a barre. Questa preparazione di libreria di cDNA è ben adattata al minuto ingressi di RNA, come un pilota catena della polimerasi (PCR) consente la determinazione di un ciclo di amplificazione specifica di produrre quantità ottimale di materiale per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questo approccio è stato ottimizzato per l'uso di RNA FFPE degradato dagli esemplari conservati per fino a 35 anni e fornisce dati NGS altamente riproducibili.

Come descritto nel metodo qui, un totale di 18 campioni di RNA FFPE individuali (100 ng ogni) sono impostati in provette separate per sottoporsi a 3' adenylated con codice a barre del oligonucleotide T4 la legatura durante la notte. Il giorno successivo, le reazioni enzimatiche sono calore-disattivato, combinate e precipitate in un singolo tubo. La pallina del RNA è risospeso e le molecole di RNA legate sono separate su un 15% di denaturare i gel di poliacrilamide (pagina), dove gli indic...

Esemplari di paraffina-incastonati formalina-fisse rappresentano una preziosa fonte di biomarcatori molecolari delle malattie umane. Qui presentiamo un protocollo di preparazione libreria cDNA laboratorio-basato, inizialmente progettato con RNA congelato fresco e ottimizzato per l'analisi dei microRNA archiviati dai tessuti stored fino ai 35 anni.

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

L'obiettivo generale di questa preparazione di una libreria di CDNA è quello di consentire il sequenziamento di successo di piccoli RNA che sono stati conservati in tessuti formali e fissati inclusi in paraffina. Questo metodo è molto utile per l'analisi di campioni formali e fissi inclusi in paraffina. Si estrae l'RNA da un massimo di 18 campioni, si analizza il contenuto di tutti questi e si ottiene un profilo di tutta la microRNasi per tutti i campioni.Per iniziare il protocollo, aggiungere 8,5 microlitri di master mix di legatura precedentemente preparato a ciascuno dei 18 campioni FFPERNA aliquotati individualmente. Agitare delicatamente le provette e centrifugare per due secondi. Dopo la centrifugazione, conservare le provette con ghiaccio.Utilizzare una pipetta da tre microlitri per trasferire un microlitro di ciascun adattatore ai corrispondenti campioni FFPERNA contenenti RNA e master mix di legatura. Non pipettare su e giù e non cambiare i puntali tra i campioni FFPERNA. Chiudere ogni tubo, frullare per mescolare e centrifugare per due secondi.Metti i tubi sul ghiaccio. Denaturare le reazioni posizionando i tubi su un blocco termico a 90 gradi Celsius per un minuto, quindi posizionarli immediatamente sul ghiaccio. Quindi, utilizzare una pipetta da tre microlitri per trasferire un microlitro dell'enzima di ligazione diluito in ciascuno dei 18 campioni di RNA.Mettere le legature sul ghiaccio e metterle in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius per un'incubazione notturna di 18 ore. Posizionare i tubi su un blocco termico per un minuto a 90 gradi Celsius per disattivare la reazione di legatura e poi rimetterli nel ghiaccio per almeno due minuti per raffreddarli. Trasferire 1,2 microlitri della miscela master di precipitazione in ciascuna provetta.Aggiungere 63 microlitri di etanolo al 100%. Chiudere ogni provetta, agitare le provette per mescolare e centrifugarle per due secondi. Metti i tubi sul ghiaccio.Unire il contenuto di tutte le 18 provette in un'unica provetta siliconata da 1,5 millilitri e capovolgere tre volte per mescolare. Centrifugare le provette per due secondi e metterle sul ghiaccio per 60 minuti per farle precipitare. Dopo la precipitazione, centrifugare la provetta da 1,5 millilitri con le legature raggruppate.Quindi, rimuovere il surnatante con un puntale per pipetta da un millilitro, ma lasciare un po' di liquido sul fondo. Inclinare la provetta e utilizzare una pipetta da 20 microlitri per rimuovere il surnatante rimanente. Aspirare il surnatante con una pipetta Pasteur con punta da 10 microlitri, quindi risospendere il pellet di RNA in 20 microlitri di acqua priva di RNasi muovendo il tubo.Aggiungere 20 microlitri di soluzione di caricamento del gel PAA per risospendere l'RNA. Agitare la provetta, centrifugarla per due secondi a temperatura ambiente e mettere la provetta sul ghiaccio. Sostituire lo 0,5 XTBE precedentemente preparato dell'apparato in gel con 0,5 XTBE fresco e caricare quest'ultimo, i marcatori dimensionali e la RNasi legata al centro del gel, lasciando due pozzetti vuoti su entrambi i lati.Quindi eseguire il gel. Dopo aver eseguito il gel, disfondere la pagina del 15% rimuovendo una delle lastre di vetro. Spruzzare leggermente il gel sulla lastra di vetro con 10 microlitri di soluzione colorante fluorescente e 25 millilitri di 0,5 XTBE e lasciarlo riposare per cinque minuti al buio.Appoggiare il bicchiere con il gel su un transilluminatore a luce blu e allineare i marcatori di dimensione di 19 nucleotidi e 24 nucleotidi con un righello per dirigere l'escissione dei piccoli RNA legati. Quindi, asportare il gel. Mettere il gel asportato in una provetta da 0,5 millilitri progettata per frammentare le fette di gel, posizionata in modo sicuro in una provetta da microcentrifuga siliconata da 1,5 millilitri.Centrifugare il gel a 16 mila volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Risospendere il gel frammentato con 300 microlitri di soluzione di cloruro di sodio da 400 millimolari. Chiudere il tubo e sigillarlo con pellicola di paraffina.Agitare il contenuto su un termomiscelatore a 11 cento giri/min in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius per un'incubazione notturna. Il giorno successivo, recuperare la provetta dal termomiscelatore e utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire la soluzione su una provetta filtrante da cinque micrometri, inserita in una provetta di raccolta siliconata senza RNasi da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta per tre minuti a 23 volte G a temperatura ambiente.Eliminare il tubo del filtro, aggiungere 950 microlitri di etanolo al 100% al tubo di raccolta contenente la soluzione filtrata e capovolgere il tubo per mescolare. Centrifugare la provetta per due secondi e metterla sul ghiaccio per 60 minuti. Quindi, precipitare il pellet di RNA.Successivamente, asciugare il pellet di RNA aprendo il tappo e rimuovendo con cura il surnatante con una pipetta da un millilitro, lasciando un po' di liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta da 20 microlitri per rimuovere tutto il surnatante rimanente senza toccare il pellet. Inclinare il tubo in modo che l'eventuale soluzione rimanente si sposti sul lato opposto del pellet.Utilizzare una pipetta Pasteur per aspirare il surnatante e asciugare il pellet utilizzando un vuoto. Risospendere il pellet di RNA in 5,6 microlitri di acqua priva di RNasi. Scongelare i reagenti di trascrizione inversa con ghiaccio per 15 minuti.Imposta una reazione di trascrizione inversa aggiungendo tre microlitri di tampone 5X, 4,2 microlitri di diossinucleotide trifosfato 10X, o DNTP, e 1,5 microlitri di ditiotreitolo, o DTT. Muovere delicatamente la provetta per mescolare la reazione e centrifugare per due secondi per raccogliere la soluzione. Dopo che la reazione è su un blocco termico a 90 gradi Celsius per esattamente 30 secondi, trasferiscilo direttamente in un termo mixer a 50 gradi Celsius per due minuti per equalizzare la temperatura.Aggiungere 0,75 microlitri dell'enzima di trascrizione inversa direttamente nella soluzione. Muovi delicatamente per mescolare e rimetti il tubo sul termo mixer a 50 gradi Celsius per 30 minuti immediatamente. Dopo 30 minuti, trasferire la provetta in un blocco termico a 95 gradi Celsius per un minuto per interrompere la trascrizione inversa.Aggiungere 95 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente alla trascrizione inversa. Muovi il tubo per mescolare e mettilo direttamente sul ghiaccio per due minuti. Assemblare la reazione pilota della PCR e impostare due cicli di PCR sul termociclatore.Impostare la reazione pilota della PCR sul termociclatore e avviare il file uno. Alla fine del primo file, utilizzare una pipetta da 20 microlitri per trasferire 12 microlitri dalla reazione pilota della PCR in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente tre microlitri di colorante 5X per il caricamento del gel. Miscelare pipettando su e giù.E etichettalo 10 cicli. Chiudere la provetta pilota per PCR e avviare il file due sul termociclatore. Alla fine del secondo file, utilizzare una pipetta da 20 microlitri per trasferire 12 microlitri di soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con tre microlitri di colorante di caricamento gel 5X ed etichettarla per 12 cicli.Ripetere i passaggi precedenti per raccogliere 12 microlitri di prodotti PCR dalla reazione PCR pilota ai cicli PCR 14, 16, 18 e 20. Quindi aggiungere tre microlitri di colorante di caricamento gel 5X a ciascuna delle aliquote PCR da 12 microlitri e alla scala da 20 nucleotidi contenente tre microlitri di scala e nove microlitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver analizzato i campioni su un gel di agarosio con 0,5 XTBE, valutare il gel su una scatola UV per identificare il ciclo PCR ottimale.Quindi impostare le reazioni PCR su larga scala per la purificazione della libreria di gel di agarosio. Dopo l'amplificazione PCR, trasferire nove microlitri da ciascuna provetta PCR in sei provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri, contenenti tre microlitri di colorante caricante gel 5X. Prepara una scala da 20 nucleotidi.Caricare la scala, il controllo PCR negativo e sei prodotti PCR sul gel di agarosio e far funzionare il gel per 30 minuti a 120 volt. Verificare l'uniformità delle implementazioni PCR tra le corsie su una scatola UV e scattare un'immagine. Combina tre reazioni PCR in due provette per microcentrifuga siliconate da 1,5 millilitri, aggiungi 27 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 950 microlitri di etanolo al 100%.Capovolgere le provette per miscelarle e impostarle a 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare i prodotti della PCR. Utilizzando il protocollo, è stata accertata la correlazione dell'espressione del micro RNA tra i due RNA tumorali freschi congelati e le loro controparti specifiche del campione FFPERNA. I grafici tra il micro RNA fresco congelato e FFPE abbinato indicano che la preparazione della libreria CDNA fornisce una buona riproducibilità, poiché esiste un'elevata correlazione tra i microRNA rilevati in campioni trattati in modo diverso.Per determinare se il protocollo di preparazione della libreria CNDA ottimizzato fosse applicabile e riproducibile con campioni FFPE sempre più vecchi, sono stati ottenuti profili di espressione di micro RNA da tessuti FFPE archiviati per 18, 20, 22, 27, 30 e 35 anni. Il coefficiente di correlazione è rimasto superiore a 0,96 indipendentemente dall'età del campione o dalla settimana di preparazione della biblioteca. Pertanto, il protocollo di preparazione della libreria CDNA ottimizzato fornisce uno strumento robusto per l'analisi riproducibile dei campioni FFPE, indipendentemente dal loro tempo di archiviazione.Quindi, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come preparare le vostre piccole librerie di RNA e ottenere un profilo completo di microinespressione di tutti i vostri preziosi campioni formali e fissati inclusi in paraffina.

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