Name: Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati dal: una combinazione di strategia basati su cellule accelerato aspersione con consegna diretta Paracrine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Scopri il co-trapianto di tessuto ovarico umano crioconservato con cellule endoteliali ingegnerizzate per accelerare la reperfusione e migliorare la viabilità follicolare. Questo metodo offre un modello robusto per studiare la regolazione molecolare della follicologenesi umana.

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Omar Alexander Man per le illustrazioni. L.M. era sostenuto da un pilota Award dalla clinica di Cornell e traduzione Science Center e un ASRM Assegnista di ricerca. Gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio di James per lettura critica del manoscritto.

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) al Weill Cornell Medical College. Tutti gli esperimenti di xenotrapianto utilizzando tessuto ovarico sono stati effettuati conformemente alle norme e linee guida pertinenti. Tessuto ovarico umano è stato raccolto da pazienti previsti per la chemioterapia o la radioterapia per il trattamento del cancro o trapianto di midollo osseo preventiva. Consiglio di revisione dell'istituzione (IRB) Comitato di Weill Cornell Medical College approvato l'insieme del tessuto per uso autologo potenziale e previo consenso informato del paziente che è stata effettuata una donazione fino al 10% del loro tessuto ovarico per uso di ricerca.
1. raccolta di tessuto ovarico umano
Nota: Quando un tessuto ovarico è trasportato da un transito di struttura remota, ora non deve superare 5 h18,19.
<ol><li>Raccogliere il tessuto ovarico e sciacquare con una soluzione salina sterile.</li>
	<li>Posto dell'ovaio in un contenitore sterile.</li>
	<li>Versare mezzo L-15 di Leibovitz fino a quando l'ovaio è completamente immerso nel mezzo.</li>
	<li>Chiudere e sigillare il contenitore.</li>
	<li>Trasporto del contenitore sul ghiaccio.</li>
</ol>2. elaborazione del tessuto ovarico procurato, adattato da Schmidt et al. 18
<ol><li>
Preparati per il trattamento ovarico e congelamento
	<ol>
<li>Preparare 100 mL di terreno per l'elaborazione: soluzione di antibiotico antimicotico di Leibovitz L-15 media 99 mL + 1 mL. Corpo filtrante con filtro di 0,2 µm. Mantenere il mezzo refrigerato.</li>
		<li>Preparare 100 mL di soluzione di congelamento facendo uso di DMSO come un protectant di cryo. Aggiungere L-15 medi, 17,66 mL siero bovino fetale di mL 69,64 Leibovitz (FBS), 3,42 g di saccarosio (per creare una concentrazione finale di 0,1 mol/L), 10,65 mL di DMSO (per creare una concentrazione finale di 1,5 mol/L) e 1 mL di soluzione antibiotico antimicotico. Filtrare il mezzo utilizzando un'unità filtrante di 150 mL, 0,2 µm. conservare il mezzo a 4 ° C.</li>
		<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave programmata per un ciclo di sterilizzazione solidi avvolto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
All'arrivo del tessuto
	<ol>
<li>Impostare gli strumenti chirurgici sterili nella biosicurezza armadietto: bisturi con lama di serie 21, affilato bene curvata forbici e pinze alle varie dimensioni: lunga (circa 150 mm di lunghezza) e 2 medie (circa 110 mm di lunghezza).</li>
		<li>Indossare guanti sterili, aprire il contenitore all'interno della cappa di biosicurezza. Prendete l'ovaio e posizionarlo in un 150mm di Petri e versare fluido freddo preparata al punto 2.1.1 in cima l'ovaio per prevenire la disidratazione del tessuto ovarico.</li>
		<li>Isolare l'ovaia da qualsiasi tessuto residuo e sciacquarlo con fluido freddo, fino a quando esso è privo di tessuto e di sangue.</li>
		<li>Posizionare l'ovaio in un pulito 150 mm piastra di Petri, aggiungere freddo medio, preparato nel passaggio 2.1.1 fino a quando l'ovaio è metà sommerso in esso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissezione del tessuto ovarico
	<ol>
<li>Bisecare ovaia e rimuovere il midollo prima di dissezione tagliente, utilizzando forbici curve bene. Poi raschiare il midollo di distanza, usando un bisturi sterile con un numero di lama 21. Precedere fino a quando il tessuto corticale è 1-1,5 mm di spessore.</li>
		<li>Tagliato il tessuto corticale a scaglie di 2-3 mm di larghezza, la lunghezza della striscia sarà l'intera lunghezza del pezzo ovarico che è stato elaborato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ovarico tessuto di congelamento lento, adattato da Newton et al. e Oktay et al. 6 , 20
<ol><li>
Preparazione per il congelamento
	<ol>
<li>Etichetta cryovials (1,8 mL).</li>
		<li>Aggiungere 1,5 mL della soluzione di congelamento preparata al punto 2.1.2 per ogni flaconcino.</li>
		<li>Trasferire una striscia corticale per criogenico flaconcino contenente la soluzione di congelamento.</li>
		<li>Equilibrare la striscia corticale per 20 minuti su un piatto rotante, applicare delicata agitazione a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Congelamento lento del tessuto ovarico
	<ol>
<li>Caricare il cryovials in un congelatore programmabile pialla a partire da 0 ° C.</li>
		<li>Cool a 2 ° C/min-7 ° c.</li>
		<li>Mantenere i tessuti a questa temperatura costante per 10 min.</li>
		<li>Eseguire il seeding manuale per induzione di nucleazione di ghiaccio cristallo, toccando ogni cryovial con una punta di cotone immersa in azoto liquido (LN2).</li>
		<li>Continuare a raffreddare a 0,3 ° C/min fino a quando la temperatura del campione raggiunge-40 ° C.</li>
		<li>Cool ad un tasso più veloce di 10 ° C/min fino a-140 ° C.</li>
		<li>Trasferire cryovials dewar per deposito in LN2 (-196 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparazioni per gli interventi chirurgici (Oophorectomy bilaterale e Co-trapianto)
<ol><li>
Preparazione delle piastre
	<ol>
<li>Un giorno prima lo scongelamento di tessuto ovarico per trapianto<ol>
<li>Posizionare un pezzo di un film di paraffina in plastica nella parte inferiore di un 50mm di Petri, spruzzarlo con 70% etanolo fino a quando non sarà completamente coperto.</li>
			<li>Lasciare le capsule di Petri durante la notte alla biosicurezza armadietto. Preparare 2 capsule di Petri per topo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Al giorno di interventi chirurgici<ol>
<li>Aspirare l'etanolo dalla capsula di Petri contenente la pellicola di plastica paraffina all'interno della cappa di biosicurezza.</li>
			<li>Lasciare il cavo di Petri aperto a metà fino a etanolo evapora completamente.</li>
			<li>Chiudere il coperchio del piatto Petri quando la pellicola di plastica di paraffina è completamente asciutta. Mantenere mobile entro la biosicurezza.</li>
			<li>Pozzi di etichetta di un 6 piastra ben conseguenza, 0,1 mol/L di saccarosio + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L saccarosio + 0,5 mol/L di DMSO, 0,1 mol/L saccarosio, base scongelamento soluzione (BTS), Medium.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle soluzioni
	<ol>
<li>Preparare 100 mL di BTS: L-15 di Leibovitz media 79 mL + FB 20 mL + antibiotico antimicotico soluzione 1 mL. Filtrare con un sistema di filtro da 0,22 µm.</li>
		<li>Preparare 10 mL di BTS con 0,1 mol/L di saccarosio. Scala 0,342 g di saccarosio e aggiungere 10 mL di BTS preparata al punto 4.2.1, agitare delicatamente fino a quando il saccarosio è completamente sciolto. Filtrare la soluzione utilizzando una siringa filtro da 0,22 µm.</li>
		<li>Preparare le soluzioni secondo la tabella 1. Coprire le provette contenenti DMSO con carta stagnola. Conservare in frigorifero fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. scongelamento rapido tessuto ovarico
<ol><li>Tolga la LN2 dewar una fiala contenente congelati tessuto ovarico e tenerlo a temperatura ambiente per 30 s.</li>
	<li>Pulire il flaconcino utilizzando una carta velina.</li>
	<li>Immergere il flacone in un bagno d'acqua di 30 ° C per 1-2 min fino al suo ' contenuto è scongelato.</li>
	<li>Aprire il flacone e posizionare la striscia corticale nel primo pozzetto contenente 3ml di soluzione prima (saccarosio + 1 mol/L di DMSO, preparata al punto 4.2.3 0,1 mol/L). Nota: Tutti i passaggi che coinvolgono aprendo il coperchio della piastra saranno fatto sotto flusso laminare.</li>
	<li>Incubare la piastra ben 6 su un piatto rotante a 4 ° C per 5 min, tenere il piatto coperto con carta stagnola per questo passaggio.</li>
	<li>Trasferire la striscia corticale nella seconda contenente 3 mL della seconda soluzione (saccarosio + 0,5 mol/L di DMSO, preparata al punto 4.2.3 0,1 mol/L).</li>
	<li>Incubare la piastra ben 6 su un piatto rotante per movimentazione delicata a 4 ° C per 5 min, tenere il piatto coperto con carta stagnola per questo passaggio.</li>
	<li>Trasferire la striscia corticale nel terzo pozzo, contenente 4 mL di soluzione (BTS con 0,1 mol/L saccarosio, preparata al punto 4.2.2).</li>
	<li>Incubare su un piatto rotante per movimentazione delicata a 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Trasferire la striscia corticale nel quarto contenente 4 mL di soluzione (BTS, preparata al punto 4.2.1).</li>
	<li>Incubare su un piatto rotante per movimentazione delicata a 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Trasferire la striscia corticale nell'ultima contenente 4 mL di fluido freddo (preparata al punto 2.1.1). Mantenere il tessuto ovarico scongelato il ghiaccio fino a eseguire il trapianto.</li>
</ol>6. incapsulamento del tessuto ovarico
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni
	<ol>
<li>Preparare 25 mL di tampone HEPES di 20 mmol/L in soluzione fisiologica allo 0,9%. Filtrare e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>1 mL di CaCl2 alla concentrazione di 1 mol/L. filtro di preparare e conservare a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare una soluzione stock di 50 mg/mL di fibrinogeno
	<ol>
<li>Aggiungere 1 g di fibrinogeno in 20 mL di tampone HEPES di 20 mmol/L in soluzione fisiologica 0,9% mescolando lentamente fibrinogeno all'HEPES soluzione salina tamponata sopra parecchie ore a 37 ° C.</li>
		<li>Etichetta 1,7 mL provette da micro-centrifuga.</li>
		<li>Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,45 µm e poi attraverso un filtro per siringa 0,2 µm.</li>
		<li>Aliquota della soluzione in 200 µ l nella provetta con micro-centrifuga e conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare una soluzione stock di trombina 100 U/mL Nota: Soluzioni di trombina adsorbono al vetro, aliquota la soluzione in tubi/fiale di plastica.<ol>
<li>Aggiungere 2,5 mL di soluzione sterile salina 0,9% a 250 U di trombina.</li>
		<li>Gentle agitare fino a quando la soluzione per sciogliere completamente.</li>
		<li>Etichetta 1,7 mL provette da micro-centrifuga.</li>
		<li>Filtrare attraverso un filtro per siringa 0,2 µm, aliquotare 50 µ l in micro-provette e conservare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rendere un coagulo di fibrina di 70 µ l, ottenendo una concentrazione finale di 10 mg/mL fibrinogeno e trombina U/mL 5 Nota: Assicurarsi di lavorare velocemente, i coaguli di soluzione in pochi secondi. Inoltre, evitare l'aggiunta di bolle per la miscela.<ol>
<li>Preparare una soluzione di fibrinogeno in una provetta da micro-centrifuga 1,7 mL.<ol>
<li>Aggiungere 360 µ l di 20 mmol/L tampone HEPES in soluzione fisiologica 0,9% all'aliquotati 200 µ l di brodo di fibrinogeno, preparata al punto 6.2.4.</li>
			<li>Mescolare pipettando delicato.</li>
			<li>Tenerlo su ghiaccio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare una soluzione di trombina in un secondo tubo di micro-centrifuga.<ol>
<li>µ L 148,7 di DMEM per l'aliquotati 50 µ l del brodo della trombina, preparata al punto 6.3.4.</li>
			<li>Mescolare pipettando delicato.</li>
			<li>Aggiungere 1,3 µ l di 1 mol/L CaCl2.</li>
			<li>Mescolare pipettando delicato.</li>
			<li>Tenerlo su ghiaccio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare una sospensione di singola cellula, In un terzo tubo micro-centrifuga.<ol>
<li>Staccare le cellule endoteliali derivati dalla piastra usando un mezzo di separazione cellulare enzima.</li>
			<li>Rotazione verso il basso la e contare le celle utilizzando un emocitometro con una copertura in vetro.</li>
			<li>Utilizzare 20.000 celle per ogni 1 mm2 di tessuto ovarico. Calcolare 20.000 x area di tessuto ovarico in mm2.</li>
			<li>Rotazione verso il basso le cellule endoteliali ingegnerizzate e risospendere in terreno base (DMEM) per raggiungere un volume totale di 16,8 µ l.</li>
			<li>Tenerlo su ghiaccio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Posizionare un pezzo di tessuto ovarico su una spugna garza sterile per asciugarlo per pochi secondi.</li>
		<li>Posizionare il pezzo di tessuto ovarico in cima la pellicola di plastica paraffina entro il 50mm di Petri.</li>
		<li>Aggiungere 39,2 µ l della soluzione di fibrinogeno, preparata al punto 6.4.1.2, nella sospensione cellulare preparata al punto 6.4.3.4, mix pipettando delicato. Tenerlo su ghiaccio.</li>
		<li>14 µ l di soluzione di trombina preparata nel passaggio 6.4.2.4. Mescolare delicatamente pipettando una volta. Lavorare velocemente.</li>
		<li>Mettere il composto sopra il tessuto ovarico, dispensare sotto forma di una goccia allungata.</li>
		<li>Posizionare la piastra di Petri con il coagulo nell'incubatore a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. bilaterale Oophorectomy e Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati ai topi NSG
Nota: Dieci a quattordici-settimana-vecchio donna NSG topi21 sono stati utilizzati (Jackson Labs).
<ol><li>Preparare tutto chirurgici strumenti, come elaborati al punto 2.1.3, assicurarsi di che avere tutte le suture, pastiglie e nastri chirurgici a portata di mano.</li>
	<li>
Anestetizzare il mouse usando un sistema di anestesia con isoflurano.
	<ol>
<li>Posizionare il mouse nella camera di induzione, chiudere il coperchio e aprire il rubinetto di arresto appropriato.</li>
		<li>Misuratore di portata aperta a 1.000 mL/min accendere il vaporizzatore e impostarlo per consegnare 2-3,5%.</li>
		<li>Osservare gli effetti dell'anestesia; perdita di coscienza, lento e respiri regolari.</li>
		<li>Trasferire il cono di naso per mantenere l'anestesia. Girare il vaporizzatore per fornire 1-3%, a seconda dei segni vitali.</li>
		<li>Verificare l'assenza di riflesso pedale o coda. Se il riflesso è presente, è necessario aumentare isoflurano fino a quando è assente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare i capelli indietro del mouse, dalla coda fino alla linea di clavicole, utilizzando un tagliacapelli elettrico.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una posizione prona sulla piattaforma chirurgica.</li>
	<li>Difficoltà il cono di naso alla piattaforma chirurgica usando un nastro chirurgico.</li>
	<li>Membra del mouse delicatamente alla piattaforma chirurgica utilizzando un nastro di carta chirurgica di 1,25 cm-larghezza del nastro.</li>
	<li>Utilizzare un gel lubrificante sterile e inserire un termometro Pr. Fix il termometro con nastro adesivo alla piattaforma chirurgica usando un nastro chirurgico plastica perforato larghezza di 1,25 cm.</li>
	<li>Nastro la coda alla piattaforma chirurgica utilizzando un nastro di carta chirurgica larga 2,5 cm.</li>
	<li>Di calore, utilizzando una porta a infrarossi o un cuscinetto di riscaldamento, di acqua calda e controllare la temperatura corporea del mouse durante tutta la procedura. Mantenere la temperatura corporea all'interno della gamma di 35-37 ° C.</li>
	<li>Pulire l'area di taglio con un bastoncino di Povidone-iodio soluzione sterile e asciugare utilizzando prep alcool sterile.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 6.9 altre due volte.</li>
	<li>Mettere una goccia di Unguento veterinario lubrificante oculare sterile su ciascuno degli occhi del mouse per proteggere dalla disidratazione e danni alla cornea.</li>
	<li>Coprire il mouse usando un telo chirurgico sterile.</li>
	<li>Iniettare buprenorfina (1 mg/Kg) sub-cutaneo (S/C).</li>
	<li>Eseguire un'incisione dorsale mediale longitudinale usando un bisturi (lama #21).</li>
	<li>
Eseguire un oophorectomy bilaterale, utilizzare un metodo dorsale.
	<ol>
<li>Liberare il tessuto connettivo sottocutaneo dissezione smussa usando le forbici.</li>
		<li>Pizzicare la fascia lateralmente e la rendono un'incisione di midline e raggiungere la cavità peritoneale, utilizzando delle forbici affilate.</li>
		<li>Afferrare il cuscinetto di grasso ovarico e l'ovaia delicatamente con una pinzetta e tirare fuori della cavità addominale.</li>
		<li>Afferrare l'ovaio e il cuscinetto di grasso con un clamp vascolari.</li>
		<li>Legare l'ovaio e il cuscinetto di grasso tramite una sutura assorbibile monofilamento di 4/0 alla base dell'ovaia, distale per le tube di Falloppio.</li>
		<li>Clip dell'ovaio distale alla cravatta. Assicurarsi che non vi è Nessun sanguinamento dalla base del ceppo.</li>
		<li>Rimettere il tessuto nella cavità addominale e suturare la fascia usando una sutura assorbibile intrecciata 6/0.</li>
		<li>Ripetere le fasi 7.15.1-7.15.7 sul lato controlaterale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Co-trapianto di tessuto ovarico.
	<ol>
<li>Eseguire un'incisione orizzontale nella fascia di sopra del grande gluteo, alla lunghezza che misura le dimensioni di coaguli. Creare una tasca all'interno di questo spazio virtuale aprendo le forbici sotto la fascia.</li>
		<li>Prendere un pezzo di tessuto corticale incapsulato, preparata nel passaggio 6.4.8 e inserirlo in questa tasca.</li>
		<li>Suturare la fascia usando un 6/0 intrecciato suturare assorbibile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere le fasi 7.16.1-7.16.3 al lato controlaterale.</li>
	<li>Chiudere la parete dorsale usando semplici punti interrotti con una sutura assorbibile monofilamento di 4/0.</li>
	<li>Iniettare lidocaina 0.5% (1,2 mL/Kg) S/C al sito di incisione.</li>
	<li>Utilizzare una preparazione sterile alcol per pulire la pelle.</li>
	<li>Disattivare l'isoflurano durante il monitoraggio della temperatura del mouse.</li>
	<li>Fornire 1-2 min di O2, senza isoflurano. A mantenere il riscaldamento il mouse fino a quando comincia a muoversi e tornare alla coscienza.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulito e più tardi casa il mouse in una gabbia separata fino a completa guarigione della ferita chirurgica.</li>
	<li>Iniettare buprenorfina (1 mg/Kg) S/C come necessario ogni 8-12 h, per 24 h postoperatorio.</li>
	<li>Tenere i topi in gabbie separate quando tutti cibo, acqua, biancheria da letto e gabbie sono sterilizzati in autoclave, fino al punto finale dell'esperimento. Mantenere le gabbie in una stanza ventilata pressurizzata. Utilizzare dispositivi di protezione individuale ogni volta che gestisce i topi.</li>
</ol>

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Michael Ginsberg è un dipendente di Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Stati Uniti, che isolato, transfected con E4-ORF-1 e identificato le cellule endoteliali che abbiamo usato.

Qui dimostriamo che co-trapianti di dirigenti fornisce un beneficio significativo alla vitalità del tessuto ovarico e funzione a seguito dello xenotrapianto nei topi. Norme per l'applicazione clinica di auto-trapianto di tessuto ovarico per la preservazione della fertilità non sono stati insieme e i parametri ottimali (dimensioni, sito di trapianto, durata di innesto, ecc.) 32 , 33 , 34 per maggiore recupero del pool fo...

Il cancro rimane tra le principali cause di morte nel mondo sviluppato, ma decenni di ricerca hanno prodotto progressi significativi per la maggior parte dei tipi di cancro e in alcuni casi quasi raddoppiata sopravvivenza tariffe1. Purtroppo, gli agenti chemioterapeutici sono spesso gonadotossica, che riducono la riserva di follicoli primordiali nelle ovaie e la riduzione di fertilità2. Questa popolazione in crescita possa beneficiare di vari metodi di conservazione della fertilità compreso la crioconservazione degli ovociti e/o embrione, tuttavia, i pazienti che richiedono l'inizio rapido della terapia del cancro e pre-puberali pazienti sono idonei per queste opzioni. In alternativa, alcuni pazienti hanno scelto di crioconservare il tessuto ovarico prima di intraprendere il loro regime terapeutico e al momento di recupero e la remissione, auto-trapianto di tessuto per ripristinare la fertilità3. Eppure, ad oggi, sopravvivenza dell'innesto e follicolare uscita auto-trapianto seguente rimangono relativamente basso4, principalmente a causa del tessuto ischemia e l'ipossia5,6,7. Nonostante i numerosi sforzi per migliorare la vitalità degli innesti di corticale ovarici con anti-ossidanti8,9, pro-angiogenica citochine10,11,12,1 3, o manipolazioni meccaniche14, ischemia dell'innesto in un post-trapianto di 5 a 7 giorno finestra compromette la vitalità e la sopravvivenza del trapianto7. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una strategia basata su cellulare per facilitare l'anastomosi dei vasi host e dell'innesto e accelerare così la riperfusione del tessuto ovarico.
Oltre l'insulto ischemico di tessuto ovarico innestato nella finestra del post-trapianto, la rottura della segnalazione Inter-follicolare può contribuire allo svuotamento della piscina15,16. Poiché le cellule endoteliali esogene (dirigenti) contribuiscono ai vasi stabile e funzionante nella periferia dell'innesto, presentano un'opportunità unica per trasmettere un input molecolare definito al tessuto trapiantato. Come prova di principio, dirigenti sono stati progettati per esprimere Super-fisiologici livelli di ormone antimulleriano (AMH), un membro della superfamiglia beta (TGFβ) fattore di crescita trasformante che è stato indicato per limitare la crescita follicolare17. Confronto di distribuzione follicolare negli innesti co-trapiantati con cellule esprimenti AMH e controllo verifica l'attività biologica e la potenza dei dirigenti ingegnerizzati.
In sintesi, migliorando l'innesto attuabilità e sopprimendo la mobilizzazione precoce del pool follicolare, questo approccio può aumentare la produttività di auto-trapianto di tessuto ovarico in pazienti che subiscono la preservazione della fertilità. Inoltre, la piattaforma basata su ExEC consente sperimentale interrogatorio dei regolatori molecolari che sono stati implicati nello sviluppo follicolare.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 medio</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Anti-Anti X100</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S 1888</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno</td><td>Sigma</td><td>F 8630</td><td>da plasma bovino</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T 1063</td><td>da plasma umano</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D 2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Cell Detachment Medium</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>Film di paraffina in plastica</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm M</td></tr><tr><td>Nastro di carta chirurgica 2,5 cm</td><td>3M</td><td>1530-1</td> Nastro di carta chirurgica <td>micropore</td></tr><tr><td>1,25 cm</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico in plastica perforata micropore 1,25 cm</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Sutura assorbibile monofilamento</td> transpore <td>Covidien</td><td>UM-203</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>assorbibile intrecciata</td> Biosyn <td>Covidien</td><td>GL-889</td><td>Polysorb</td></tr><tr><td>Soluzione di iodio povidone USP 10%</td><td>Purdue Products</td><td>67618-153-01</td><td>Soluzione Betadine Swab Stick</td></tr><tr><td>Cryoviales</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td>CryoTube</td></tr><tr><td>oculare sterile lubrificante</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Puralube</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C-2172</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Sistema</td> da tavolo <td>VetEquip</td><td>V-1 con scavenging</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali</td><td>Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td>Isolato, trasfettato con E4-ORF-1 e cellule endoteliali marcate</td></tr><tr><td>Colorazione tricromica</td><td>Sigma</td><td>HT15-1kt</td><td>Kit Macchia Tricromica (Masson)</td></tr><tr><td>Isolectin</td><td>Invitrogen</td><td>I32450</td><td>Isolectin GS-IB4 Da Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&trade; 647 Coniugato</td></tr></tbody></table>

co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati dal: una combinazione di strategia basati su cellule accelerato aspersione con consegna diretta paracrine

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

L'infertilità è un frequente effetto collaterale della chemioterapia e/o radioterapia e per alcuni pazienti, la crioconservazione degli ovociti o embrioni non è un'opzione. In alternativa, un numero crescente di questi pazienti scelgono di crioconservare il tessuto ovarico per autoinnesto dopo il recupero e la remissione. Malgrado i miglioramenti nei risultati fra i pazienti che subiscono il auto-trapianto di tessuto ovarico crioconservati, efficiente rivascolarizzazione del tessuto innestato rimane un ostacolo importante. Per mitigare l'ischemia e quindi migliorare i risultati in pazienti sottoposti a trapianto di auto, abbiamo sviluppato una strategia basata su cellule vascolare per accelerare l'aspersione del tessuto ovarico. Descriviamo un metodo per Co-trapianto di cellule endoteliali esogene (dirigenti) con tessuto ovarico crioconservati in un modello di xenotrapianto di topo. Estendiamo questo approccio per impiegare i dirigenti che sono stati progettati per esprimono costitutivamente ormone antimulleriano (AMH), consentendo in tal modo paracrino sostenuta segnalazione ingresso agli innesti ovarici. Co-trapianto con ExECs aumentato volume follicolare e lo sviluppo di follicoli antrali migliorata e AMH-esprimendo ExECs promosso ritenzione di quiescenza follicoli primordiali. Questa strategia combinata può essere uno strumento utile per ridurre l'ischemia e modulando l'attivazione follicolare nel contesto di preservazione della fertilità e/o sterilità nel suo complesso.

Per determinare se Co-trapianto di ExECs fornisce un beneficio al tessuto dei pazienti, scongelati strisce corticale ovariche sono stati divisi in pezzi di dimensioni uguali ed engrafted bilateralmente in immuno-compromessi, gamma NOD scid (NSG), topi. Con un lato incorporato in un coagulo di fibrina da solo (nessun ECs) e l'altro contenente ExECs (Figura 1a), ogni mouse servito come il suo controllo. Dirigenti sono stati ottenuti tramite isolamento dell'endo...

Per alcuni pazienti, l'unica opzione per la preservazione della fertilità è crioconservazione del tessuto ovarico. Purtroppo, in ritardo il revascularization Mina vitalità follicolare. Qui, presentiamo un protocollo per Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali per aspersione di utilizzazione come una strategia basata sulle celle che combini accelerato con una consegna di paracrine diretto di molecole bioattive.

Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati dal: una combinazione di strategia basati su cellule accelerato aspersione con consegna diretta Paracrine

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è lo xenotrapianto di tessuto ovarico umano crioconservato in combinazione con cellule endoteliali ingegnerizzate che accelerano la riperfusione e forniscono uno stimolo paracrino che modula l'attivazione follicolare all'interno del trapianto. Questo metodo fornisce un mezzo basato su cellule per migliorare la vitalità post-trapianto del tessuto ovarico crioconservato e, più in generale, stabilisce un robusto sistema modello per interrogare la regolazione molecolare della follicologenesi umana. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un unico veicolo, quello delle cellule endoteliali, sia per mitigare l'ischemia che per fornire una fonte sostenuta di fattori secreti per attecchire il tessuto.Quindi questo metodo fornisce un beneficio globale per la vitalità dei tessuti. Può anche fornire informazioni sui regolatori molecolari che sono stati implicati nello sviluppo follicolare. Per creare un coagulo di fibrina, lavorare rapidamente e aggiungere 360 microlitri di tampone HEPES a 200 microlitri della soluzione madre di fibrinogeno.Pipettare delicatamente per mescolare e mantenere la provetta sul ghiaccio. Nella seconda provetta per microfuge, preparare la soluzione di lavoro della trombina aggiungendo 148,7 microlitri di DMEM a 50 microlitri di soluzione madre di trombina. Pipettare delicatamente per mescolare.Quindi aggiungere 1,3 microlitri di una mole per litro di cloruro di calcio. Pipettare delicatamente per mescolare e mantenere il campione sul ghiaccio. Utilizzando il terreno di distacco cellulare enzimatico Accutase, staccare le cellule endoteliali ingegnerizzate precedentemente preparate dalla piastra e trasferirle in una terza provetta microfuge.Quindi, fai girare le cellule. Successivamente, utilizzando un emocitometro e un bicchiere coperto, contare le cellule. Per calcolare il numero di cellule necessarie per l'attecchimento, convertire un'area di 20.000 volte il tessuto ovarico in millimetro quadrato utilizzando un righello per misurare le dimensioni.Moltiplicare l'area per 20.000 per determinare il numero di cellule necessarie per l'attecchimento. Spegni le celle richieste. E usa il DMEM per risospendere il pellet per un volume totale di 16,8 microlitri.Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio. Quindi, posiziona un pezzo di tessuto ovarico su una spugna di garza sterile per alcuni secondi per asciugarlo. Quindi trasferire il fazzoletto su una pellicola di paraffina di plastica precedentemente preparata in una capsula di Petri da 50 millimetri.Aggiungere 39,2 microlitri della soluzione di fibrinogeno nella sospensione cellulare preparata. Miscelare con un pipettaggio delicato e mantenere la sospensione sul ghiaccio. Quindi, lavorando rapidamente, aggiungere 14 microlitri della soluzione di trombina al tubo e pipettare delicatamente una volta per mescolare.Pipettare la miscela sopra il tessuto ovarico a forma di gocciolina allungata. Incubare la capsula di Petri con il coagulo a 37 gradi Celsius. Lavorare rapidamente dopo aver aggiunto la soluzione di trombina alla sospensione cellulare di fibrinogeno.Sincronizzare la futura preparazione in chirurgia è una sfida e può essere prudente eseguire una prova prima di espellere prezioso tessuto umano. Dopo aver anestetizzato la femmina di topo NSG di 10-14 settimane e averla preparata per l'intervento chirurgico secondo il protocollo di testo, riscaldare l'animale e monitorare la temperatura corporea durante tutta la procedura. Con un bastoncino di tampone di iodio povidone, pulire l'area tagliata e quindi utilizzare alcol sterile per rimuoverla.Quindi, metti una goccia di unguento veterinario lubrificante oculare sterile su ciascuno degli occhi del topo per proteggerli dalla disidratazione e dai danni alla cornea. Dopo aver eseguito un'ovariectomia bilaterale secondo il protocollo di testo, iniettare buprenorfina per via sottocutanea. Quindi praticare un'incisione orizzontale nella fascia sopra il grande gluteo ad una lunghezza che si adatti alle dimensioni del coagulo.Crea una tasca all'interno di questo spazio virtuale aprendo le forbici sotto la fascia. Raccogli un pezzo di tessuto corticale incapsulato precedentemente preparato e mettilo in tasca. Quindi utilizzare una sutura riassorbibile intrecciata a sei O per suturare la fascia prima di ripetere il co-trapianto sul lato controlaterale.Chiudere la parete dorsale con sutura assorbibile in monofilamento a quattro O in semplici punti interrotti. Iniettare la lidocaina per via sottocutanea nel sito di incisione. Quindi utilizzare un preparato sterile a base di alcol per pulire la pelle ed eseguire la cura post-operatoria secondo il protocollo di testo.Come si vede qui, due settimane dopo l'attecchimento bilaterale di cellule endoteliali della vena ombelicale umana trattate con E4-ORF1 in topi femmina NSG, vasi funzionalmente perfusi formati da EC o ExEC marcate con GFP all'interfaccia del tessuto ospite e del trapianto. Gli ExEC formati vasi funzionali quando co-trapiantati con tessuto ovarico in pezzi corticali co-trapiantati con ExEC di topo o umani, aumentano il numero di follicoli sopravvissuti rispetto agli innesti di controllo. Questo aumento dello sviluppo dei follicoli è stato associato a una diminuzione dell'area fibrotica negli innesti assistiti da ExEC.I valori finali dell'area fibrotica sono stati calcolati per ciascun innesto come media delle tre sezioni analizzate. È importante sottolineare che gli innesti che sono stati co-trapiantati con fibroblasti del prepuzio umano hanno mostrato una scarsa vitalità tissutale e relativamente pochi follicoli. 14 settimane dopo l'attecchimento, i topi sono stati stimolati con menotropine.E la progressione della crescita dei follicoli è stata monitorata tramite risonanza magnetica. Lo sviluppo dei follicoli è stato osservato sia negli innesti di controllo che in quelli assistiti da ExEC. Tuttavia, negli innesti assistiti ExEC sono stati notati follicoli di dimensioni maggiori e più grandi.Rispetto ai follicoli antrali derivati dal tessuto dello stesso paziente, lo strato cellulare della granulosa nel follicolo più avanzato ha mostrato una maggiore espressione dei marcatori ovulatori CD44 e HABP1, nonché un aumento della morte cellulare e una ridotta proliferazione. Dopo aver visto questo video, capirai come eseguire il co-trapianto di tessuto ovarico crioconservato con cellule endoteliali in un coagulo di fibrina. E una volta padroneggiato, dovresti essere in grado di completare questo protocollo in meno di un'ora.Sulla base di questo approccio, le cellule endoteliali possono essere ingegnerizzate per esprimere qualsiasi combinazione di fattori secreti, consentendo così l'interrogazione di vie di segnalazione che possono essere rilevanti per la conservazione della fertilità, la follicologenesi e/o il trapianto di tessuti.

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