Name: Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Scopri un metodo non virale per modificare le cellule staminali emopoietiche CD133+ con microRNA e nanoparticelle magnetiche. Questa tecnica consente l'ingegneria cellulare combinata con il targeting magnetico per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale dell'educazione e ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), la Pomerania Mecklenburg-occidentale dello stato con fondi strutturali (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e il DFG (DA1296/2-1), la Fondazione tedesca del cuore (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) e la Fondazione umida. Inoltre, F.H. e P.M. sono supportati dal foro con. rar programma di Rostock University Medical Centre (889001).

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Negli ultimi anni, CD133+ SCs sono emersi come una popolazione di cellule promettente per terapie basate su SC come evidenziato da diversi di fase I, II e III studi clinici43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 <su...

CD133+ SCs rappresentano una popolazione eterogenea di cellule staminali e progenitrici con promettenti potenzialità per la medicina rigenerativa. Loro potenziale di2,di1,di differenziamento ematopoietico, endoteliale e miogenico3 consente il CD133+ cellule, per esempio, a contribuire ai processi di neovascolarizzazione attraverso la differenziazione nel formare nuovi vasi e l'attivazione di pro-angiogenica segnalazione di paracrine meccanismi4,5,6,7.
Nonostante il loro elevato potenziale dimostrato in più di 30 studi clinici approvati (ClinicalTrails.gov), il loro risultato terapeutico è ancora sotto discussione discutibile4. Infatti, un'applicazione clinica di SCs è ostacolata dalla bassa ritenzione nell'organo di interesse e voluminosa iniziale delle cellule morte5,8,9. Ingegneria del CD133 addizionale+ SCs precedente trapianto potrebbe aiutare a superare queste sfide.
Un prerequisito per una terapia cellulare efficiente sarebbe la riduzione della morte massiccia delle cellule iniziali di attecchimento delle cellule terapeutiche rilevanti10. Studi attuali hanno dimostrato una perdita immensa cella del 90-99% in organi altamente perfusi come il cervello e il cuore durante i primi 1-2 h, indipendentemente dal tipo delle cellule trapiantate o applicazione route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC di etichettatura usando nanoparticelle magnetiche (MNPs) consente una strategia innovativa non invasiva alle cellule bersaglio al sito di interesse22,23,24,25,26 e contemporaneamente consente il cellulare monitoraggio utilizzando MRI27 e particelle magnetiche (MPI) di imaging. Il più efficiente in vivo studi applicando magnetizzata cella cella utilizzata ritenzione di targeting dopo amministrazione locale anziché orientamento di cella dopo iniezione endovenosa23,24,28 . Di conseguenza, il nostro gruppo progettato un sistema di consegna costituito da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico29. Con questa tecnica, CD133+ SCs e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) potrebbero essere efficientemente orientate, come dimostrato da in vitro tentativi30,31.
Un altro ostacolo per terapie SC è l'ostile ambiente infiammatorio del tessuto colpito dopo trapianto, che contribuisce al iniziale delle cellule morte32. Oltre a diversi studi di pre-condizionamento, l'applicazione di terapeutici rilevanti Mir era testata33; è stato dimostrato con successo che anti-apoptotiche miRs inibire l'apoptosi in vitro e che permettono di migliorare il engraftment delle cellule in vivo33. Queste piccole molecole, composti da 20-25 nucleotidi, svolgono un ruolo cruciale come modulatori di posttranscriptional di RNA messaggeri (mRNA) e quindi influenzano il destino e il comportamento di cellule staminali34. Inoltre, l'introduzione esogena di miRs evitare l'integrazione stabile indesiderato nel genoma ospite34.
Tentativi in corso per introduzione efficiente degli acidi nucleici (NAs) nella primaria SCs sono principalmente basati su virus ricombinante8,35. Nonostante l'efficienza di trasfezione alta, manipolazione del virus ricombinante presenta un grosso ostacolo per una traduzione in panchina al capezzale, per esempio, espressione genica incontrollabile, patogenicità, immunogenicità e mutagenesi inserzionale35 ,36. Di conseguenza, sistemi di erogazione non virali come costrutti a base di polimeri sono fondamentali per sviluppare. Tra quelli, polyethylenimine (PEI) rappresenta un veicolo di consegna valido che offre vantaggi per miRs quali condensa NA di proteggere dalla degradazione, l'assorbimento cellulare, e rilascio intracellulare attraverso endosomal fuga37,38. Inoltre, complessi di miR-PEI ha dimostrato un'elevata biocompatibilità in studi clinici39. Di conseguenza, il nostro sistema di consegna è costituito da un biotinilati ramificati 25 kDa PEI associato a un rivestite con streptavidina MNP-core30,31,40.
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo che descrive (i) l'isolamento manuale di CD133+ SC da umane del midollo osseo (BM) donazione con una dettagliata caratterizzazione del prodotto SC e (ii) una strategia efficace e delicata la transfezione di un sistema di consegna a base di polimeri magneticamente non-virali per l'ingegneria genetica del CD133+ SCs utilizzando miRs. CD133+ SCs sono isolati e magneticamente arricchita da aspira BM umano sternale utilizzando una superficie anticorpo-basato magnetico-attivato delle cellule (MACS) sistema di smistamento. In seguito, l'attuabilità delle cellule come pure la purezza delle cellule è analizzata mediante citometria a flusso. Successivamente, miR/PEI/MNP complessi sono preparati e CD133+ SCs transfected. 18 ore dopo la trasfezione, l'efficienza di assorbimento e l'impatto della transfezione sulla vitalità delle cellule e l'espressione marcatore di SC sono analizzati. Inoltre, la valutazione della distribuzione intracellulare dei composti complessi transfezione viene eseguita utilizzando etichettatura quadricromia e microscopia strutturata di illuminazione (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico con tecnologie</td><td>di cellule staminali</td> blu di metilene <td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (clone: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>colorante di rodamina; Colorante Atto 565 coniugato alla biotina</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII citometro</td><td>a flusso BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 particelle di destrano superparamagnetico legate agli anticorpi; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>collagenasi B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>camera di conteggio</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3 colorante marcato precursore miR; Cy3 Dye-Marcato Pre-miR Controllo negativo #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Kit di etichettatura miR colorante Cyanine 5; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 microscopio confocale</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Reagente, umano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>kit di marcatura delle proteine verde brillante; Oregon Green 488 Kit di Etichettatura Proteica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>terreno di montaggio acquoso; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>provetta per centrifugazione a gradiente di densità; Leukosep Provetta per centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico MACS; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di pre-separazione MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &; m</td></tr><tr><td>Colonna di separazione MACS (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnete permanente MACS; Separatore MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Filtro PVDF Millex-HV</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>topo IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>colorante reattivo all'ammina; Kit per colorante di cellule morte fissabile Near-IR LIVE/DEAD</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>terreno di separazione dei linfociti umani; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>densità: 1,077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>senza Ca e Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>ramificato; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>di PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>miR precursore non marcato; Controllo negativo del precursore del precursore del pre-miR miRNA #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi dei globuli rossi</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione dell'RNAsi; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>terreno linfocitario umano; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>integratore di citochine umane ricombinanti; Terreno di espansione per cellule ematopoietiche StemSpan CC100 Stemcell</td><td>Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>privo di siero; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina MagneSphere Particelle paramagnetiche</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M; pH 8,0</td></tr><tr><td>ZEN2011 software</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH bagnomaria sonicante</td><td>Bandelin electronic</td><td></td><td>Potenza nominale ultrasonica: 80 W; Frequenza ultrasonica: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protocollo per il trasferimento di microrna in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il targeting magnetico

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

CD133, mentre+ cellule staminali ematopoietiche (SCs) hanno dimostrate di fornire alto potenziale nel campo della medicina rigenerativa, loro tariffe bassa ritenzione dopo iniezione nei tessuti danneggiati, così come i tassi di mortalità osservati massiccia delle cellule portano a molto limitato gli effetti terapeutici. Per superare queste limitazioni, abbiamo cercato di stabilire un protocollo di base non-virali per l'ingegneria cellulare adeguata prima della loro somministrazione. La modifica di CD133 umano+ esprimendo SCs utilizzando polyplexes magnetico microRNA (miR) caricato è stato risolto per quanto riguarda l'efficienza di assorbimento e sicurezza, nonché il potenziale targeting delle cellule. Basandosi sul nostro protocollo, possiamo raggiungere velocità di assorbimento di miR alta di 80 – 90% mentre il CD133+ proprietà delle cellule staminali rimangono inalterate. Inoltre, queste cellule modificate offrono l'opzione di targeting magnetico. Descriviamo qui una procedura sicura ed altamente efficace per la modifica di CD133+ SCs. Ci aspettiamo che questo approccio per fornire una tecnologia standard per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali e per il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica (MRI).

Il protocollo presentato descrive un isolamento manuale e arricchimento magnetico del CD133 BM-derivati umani+ SCs con una cellula indipendente virus successivi ingegneria strategia, come una tecnologia non invasiva per in vitro manipolazione cellulare e in vivo strumento di monitoraggio.
Questa tecnologia di isolamento di tre fasi consente una separazione delle MNCs da BM sternal pre-digeriti median...

Questo protocollo viene illustrata una procedura sicura ed efficace per modificare CD133+ cellule staminali ematopoietiche. L'approccio non-virale, magnetico presentato basato su polyplex può fornire una base per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali anche per quanto riguarda il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica.

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Il nostro protocollo può rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, ad esempio se le cellule possono essere migliorate per le proprietà benefiche e se possono essere mirate al sito di interesse. Uno dei principali vantaggi del nostro protocollo è il fatto che le cellule possono essere modificate geneticamente in modo transitorio utilizzando il nostro metodo di trasfezione non virale, mantenendo così le proprietà delle cellule. Il metodo di Sauter può fornire informazioni sulla modifica delle cellule staminali ematopoietiche che possono essere applicate ad altri tipi di cellule utilizzate per il trapianto, come le cellule staminali mesenchimali.Per iniziare il protocollo, preriscaldare il terreno linfocitario umano a temperatura ambiente e scongelare la collagenasi B e la DNasi. Raccogli il midollo osseo, o BM, in una provetta conica da 50 millilitri. Scartare eventuali coaguli esistenti.Prelevare un campione di midollo osseo di 200 microlitri per la successiva analisi citofluorimetrica. Conservare il campione a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Successivamente, trasferire dieci millilitri di BM in una nuova provetta conica da 50 millilitri e

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Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

La somministrazione mirata di cellule è utile in una varietà di applicazioni biomediche.  L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) per marcare le cellule e quindi consentire approcci di targeting cellulare magnetico per un alto grado di controllo sulla consegna e la localizzazione delle cellule.

Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Questo manoscritto descrive l'erogazione efficiente, non virale miR alle cellule endoteliali da un vettore PEI / MNP e la loro magnetizzazione. Così, oltre alla modificazione genetica, questo approccio consente di orientamento delle cellule magnetica e risonanza magnetica rilevabilità. La tecnica può essere utilizzata per migliorare le caratteristiche dei prodotti cellulari terapeutici.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

Descriviamo l'uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un'ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.

Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

Questo protocollo descrive la procedura per l'editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Scopri un metodo non virale per modificare le cellule staminali emopoietiche CD133+ con microRNA e nanoparticelle magnetiche. Questa tecnica consente l'ingegneria cellulare combinata con il targeting magnetico per applicazioni in medicina rigenerativa.

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico (Video) | JoVE Journal

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

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