Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

Il nostro protocollo può rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, ad esempio se le cellule possono essere migliorate per le proprietà benefiche e se possono essere mirate al sito di interesse. Uno dei principali vantaggi del nostro protocollo è il fatto che le cellule possono essere modificate geneticamente in modo transitorio utilizzando il nostro metodo di trasfezione non virale, mantenendo così le proprietà delle cellule. Il metodo di Sauter può fornire informazioni sulla modifica delle cellule staminali ematopoietiche che possono essere applicate ad altri tipi di cellule utilizzate per il trapianto, come le cellule staminali mesenchimali.

Per iniziare il protocollo, preriscaldare il terreno linfocitario umano a temperatura ambiente e scongelare la collagenasi B e la DNasi. Raccogli il midollo osseo, o BM, in una provetta conica da 50 millilitri. Scartare eventuali coaguli esistenti.

Prelevare un campione di midollo osseo di 200 microlitri per la successiva analisi citofluorimetrica. Conservare il campione a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Successivamente, trasferire dieci millilitri di BM in una nuova provetta conica da 50 millilitri e aggiungere sei millilitri di PBS EDTA, 20 millilitri di terreno linfocitario umano, 175 microlitri di collagenasi B e 175 microlitri di DNasi.

Mescolare delicatamente la soluzione e incubarla per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker. Adescare una provetta per centrifugazione a gradiente di densità da 50 millilitri applicando 15 millilitri di terreno di separazione dei linfociti umani nella provetta da 50 millilitri e centrifugarla a 1.000 volte G per 30 secondi. Sovrapporre con cura 35 millilitri di BM diluito sopra il filtro della provetta per centrifugazione a gradiente di densità e centrifugare la provetta a 445 volte G per 35 minuti.

Rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga senza agitarla. Scartare con cautela un massimo di 20 millilitri dalla soluzione limpida superiore, senza toccare lo strato torbido direttamente sopra il filtro. Trasferire con cura lo strato torbido contenente le celle mononucleate, o MNC, in una nuova provetta conica da 50 millilitri e riempirla con PBS EDTA fino a un volume finale di 50 millilitri.

Contare le MNC trasferendo 10 microlitri della sospensione cellulare da 50 millilitri in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 10 microlitri di acido acetico al 3% con blu di metilene. Mescolare delicatamente il contenuto e applicare 10 microlitri in una camera di conteggio.

Calcolare il numero di MNC. Centrifugare la sospensione MNC a 300 volte G per 10 minuti. Scartare il surnatante.

Per preparare una selezione magnetica per un numero di celle totale da 10 a 10, risospendere accuratamente le MNC in 300 microlitri di tampone MACS. Aggiungere 100 microlitri di reagente bloccante FCR e 100 microlitri di particelle di destrano superparamagnetico legate agli anticorpi CD133. Quindi, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e incubarla per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Agitare delicatamente la sospensione cellulare durante l'incubazione due o tre volte. Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di tampone MACS per una volta per 10 cellule. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e centrifugare la miscela a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Installare il supporto magnetico MACS e fissare il magnete permanente MACS. Installare la colonna MACS e applicare il filtro di pre-separazione sulla parte superiore. Equilibrare la prima colonna MACS e il filtro di pre-separazione con il tampone MACS.

Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MACS. Applicare la sospensione cellulare al filtro di pre-separazione. Lavare tre volte la colonna MACS e il filtro di pre-separazione ed eliminare il filtro di pre-separazione.

Eluire la frazione cellulare direttamente sulla seconda colonna MACS. Trasferire immediatamente la prima colonna MACS sopra la seconda colonna MACS e spingere la sospensione della cella attraverso la colonna MACS utilizzando lo stantuffo in dotazione. Lavare la colonna MACS 3 volte con il tampone MACS.

Eluire la frazione cellulare dalla colonna aggiungendo il tampone MACS sulla seconda colonna MACS e rimuovendo la colonna MACS dal magnete permanente MACS. Trasferire immediatamente la seconda colonna MACS sopra una provetta e spingere la sospensione della soluzione cellulare attraverso la colonna MACS. Centrifugare la provetta.

Scartare con cura il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone MACS. Prelevare un campione da una volta 10 a quattro cellule per la successiva analisi citofluorimetrica. Risospendere le cellule rimanenti nel terreno di coltura e seminare cinque volte 10 alle quarte cellule in una piastra a 24 pozzetti per la trasfezione.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di CO2 e 20% di O2. Utilizzare due aliquote BM da 10 microlitri e un campione di SC CD133 positivi appena isolati per l'analisi. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 10 microlitri di reagente bloccante FcR e riempire la provetta con tampone MACS fino a un volume di 33 microlitri. Aggiungere gli anticorpi sul lato interno del tubo. Dopo che tutti gli anticorpi sono stati aggiunti, scuotere il lato anticorpale del tubo.

Mescolare delicatamente la soluzione, che ha un volume finale di 50 microlitri, e incubarla per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di un globulo rosso X o tampone di lisi dei globuli rossi. Mescolare delicatamente la sospensione e incubare la soluzione con ghiaccio per 10 minuti.

Quindi centrifugare la sospensione. Scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 microlitri di PBS. Valutare la purezza e la vitalità delle cellule mediante misure citofluorimetriche.

Utilizzare 20 picomoli di MIR per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Diluire il MIR nella soluzione di glucosio al 5% fino a una concentrazione finale di 0,25% di picomoli MIR per microlitro. Diluire il PEI in una quantità uguale di soluzione di glucosio al 5%.

Quindi, aggiungere il PEI prediluito nel MIR prediluito e agitare per 30 secondi. Durante l'incubazione dei complessi MIR PEI per 30 minuti a temperatura ambiente, sonicare le nanoparticelle magnetiche, o MNP, per 20 minuti a 35 kilohertz in un bagno d'acqua sonicante a temperatura ambiente. Assicurarsi che le particelle siano in sospensione e non si aggreghino.

Aggiungere gli MNP sonicati nei complessi MIR PEI e agitare la soluzione per 30 secondi. Incubare i complessi MIR PEI MNP per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il complesso MIRNA PEI MNP goccia a goccia direttamente nell'apposito pozzetto contenente le SC CD133 positive appena isolate in terreno di coltura.

Mescolare delicatamente facendo oscillare il piatto avanti e indietro. Incubare le cellule. 18 ore dopo la trasfezione, raccogliere il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta separata da 1,5 millilitri.

Lavare ogni pozzetto una volta con 500 microlitri di PBS e trasferire questa sospensione cellulare nella stessa provetta. Quindi, centrifugare le celle a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone MACS.

Aggiungere 0,5 microlitri di un colorante reattivo all'ammina per distinguere tra cellule vive e morte. Mescolare delicatamente la sospensione e incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di PBS e centrifugare nuovamente le celle a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante, risospendere il pellet ottenuto in 100 microlitri di PBS, aggiungere 33 microlitri di PFA al 4% e mescolare energicamente. Valutare l'efficienza di assorbimento del MIR e la citotossicità mediata dalla trasfezione mediante misure citometriche a flusso. Seguendo il metodo descritto nel protocollo, la citometria a flusso ha determinato che la frazione cellulare CD133 positiva arricchita magneticamente ha prodotto una vitalità e una purezza superiori all'80%Il metodo di trasfezione qui descritto consente un'introduzione altamente efficace di MIR in queste SC CD133 positive umane appena isolate.

Con un'efficienza di assorbimento di circa l'80% delle celle vitali. Inoltre, non ci sono effetti citotossici significativi evidenti 18 ore dopo la trasfezione rispetto alle cellule di controllo. Inoltre, una sufficiente consegna e una distribuzione abituale dei composti complessi di trasfezione possono essere osservate all'interno del citoplasma delle cellule utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata, o SIM.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'applicazione in vivo di cellule staminali modificate. Ciò consentirà di studiare la sopravvivenza e gli effetti effettivi in condizioni dinamiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare la trasfezione basata su polimeri e nanoparticelle magnetiche per introdurre in modo efficiente il microRNA nelle cellule staminali appena ematopoietiche.