Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti
5 settembre 2018
Attraverso un'ampia varietà di indicazioni di malattia, modelli più fisiologicamente rilevanti sono in corso programmi di scoperta della droga sviluppata e implementata in. Il nuovo modello di sistema descritto qui di seguito viene illustrato come tridimensionale del tumore sferoidi possono essere coltivate e proiettati in un sistema basato su piastra 1536 pozzetti ad alta produttività per la ricerca di nuovi farmaci oncologici.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci, come ad esempio qual è l'impostazione di coltura tissutale più rilevante per l'identificazione da colpo a piombo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la coltura di cellule in tre dimensioni, ad alta produttività, utilizzando 1536 piastre a pozzetti. A dimostrare questo protocollo sarà Kalyani Gampa, uno scienziato senior del mio laboratorio.
Per impostare una coltura di sferoidi tumorali 3D, staccare le linee cellulari tumorali di interesse con tre lavaggi di BBS. Segue l'aggiunta di un millilitro di tripsina per cinque centimetri quadrati di pallone di coltura. Dopo cinque minuti, neutralizzare la tripsina con cinque volte il volume del terreno integrato di siero in ogni fiaschetta e contare le cellule.
Utilizzare una piccola cassetta sterilizzata in acciaio inossidabile con un sistema basato su pompa peristaltica per seminare un totale di 500 cellule in otto microlitri di terreno sferoidale in ciascun pozzetto di una piastra trattata con coltura tissutale da 1.536 pozzetti. Quindi utilizzare una guarnizione adesiva traspirante per coprire la piastra. E posiziona la piastra in un'incubatrice rotante impostata a 37 gradi Celsius e 10 giri/min con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità relativa per tre giorni.
Il passaggio più critico è garantire che le piastre siano ben sigillate prima di essere inserite nell'incubatrice. Gli sferoidi avranno bisogno di tre giorni per formarsi e questo passaggio impedisce l'evaporazione media. Al termine dell'incubazione, centrifugare rapidamente le piastre di coltura rivestite di cancro a 100 volte la gravità per raccogliere la condensa e rimuovere i sigilli adesivi.
Mettere ogni piastra da trattare su un dosatore acustico impostato per erogare un totale di otto nanolitri di ciascun composto. Diluizione a una concentrazione finale dello 0,1% di DMSO per pozzetto e una dose massima del composto di 10 micromolari. Quando il composto è stato aggiunto alle piastre appropriate, posizionare un coperchio per colture cellulari in acciaio inossidabile su misura su ciascuna piastra per evitare l'evaporazione e rimettere le piastre nell'incubatore rotante per altri cinque giorni.
Al termine dell'incubazione, aggiungere tre microlitri di reagente di lisi cellulare preriscaldato, integrato con luciferina, a ciascun pozzetto di ciascuna piastra di coltura cellulare. E incubare le piastre a temperatura ambiente per almeno 15 minuti. Quindi cattura la luminescenza ATP su un luminometro a lastra.
Quando tutte le piastre sono state analizzate, estrarre i dati grezzi dallo strumento e normalizzare tutti i campi contenenti i composti in esame alla media di tutti i pozzetti contenenti DMSO da solo come controllo neutro. La percentuale di inibizione della crescita di ciascun composto può quindi essere calcolata in base alla formula e possono essere generate curve dose-risposta e IC50 inibitori. Una varietà di cellule tumorali consolidate note per crescere bene in condizioni di coltura 2D hanno anche formato strutture 3D quando sono state coltivate, nonostante le loro differenze morfologiche.
Quando viene utilizzato per lo screening su larga scala, è possibile osservare la sensibilità differenziale dei composti tra le colture coltivate in 2D rispetto a quelle coltivate in 3D. Con ogni punto che rappresenta la concentrazione inibitoria di un singolo composto per il quale si osserva una risposta di uccisione cellulare del 50% in entrambi i contesti di coltura. In questo esperimento rappresentativo, entrambi i composti inibitori della chinasi RAF testati erano più potenti in condizioni 3D in una coltura di linea di carcinoma polmonare non a piccole cellule che ospitava una mutazione attivante nella proteina KRAS.
Tuttavia, i composti dimostrano una potenza simile sia nelle colture di sferoidi 3D che in quelle di linee di cancro del colon 2D che contengono una mutazione attivante G13D in KRAS. Il saggio 3D consente anche di osservare il fenomeno paradossale dell'attivazione della crescita, che si verifica quando vi è un'inibizione incompleta dei dimeri RAF nelle linee mutanti di RAF altamente attivate, come evidenziato dalla crescita cellulare a basse concentrazioni del farmaco, che viene represso ad alte concentrazioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci antitumorali per esplorare condizioni di coltura alternative per identificare nuova materia chimica efficace contro bersagli noti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per la scoperta di farmaci che utilizza sferoidi tumorali tridimensionali coltivati in un sistema a piastre ad alta produttività da 1536 pozzetti. Questo approccio mira a migliorare la rilevanza degli ambienti di coltura tissutale nell'identificazione di potenziali farmaci oncologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Scoperta di farmaci
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- Le colture cellulari tradizionali bidimensionali spesso non riescono a riprodurre il microambiente tumorale.
- Le colture tridimensionali forniscono un modello fisiologicamente più rilevante per lo studio del cancro.
- Lo screening ad alto rendimento è essenziale per una scoperta efficiente dei farmaci.
- Questo studio si concentra sull'ottimizzazione della coltivazione di sferoidi tumorali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo ad alto rendimento per la coltura di sferoidi tumorali.
- Valutare la rilevanza di questo modello nella scoperta di farmaci.
- Facilitare l'identificazione di nuovi farmaci in oncologia.
Metodi Utilizzati
- Distacco di linee cellulari tumorali mediante lavaggi con BBS.
- Uso della tripsina per il distacco cellulare e neutralizzazione con mezzo integrato con siero.
- Coltura delle cellule in formato piastra da 1536 pozzetti.
- Screening di potenziali candidati farmacologici in modo ad alto rendimento.
Risultati principali
- Il metodo consente una coltura efficiente di sferoidi tumorali in 3D.
- Le capacità ad alta produttività permettono un rapido screening di candidati farmaci.
- Rilevanza dimostrata del modello di coltura in 3D nella scoperta di farmaci.
- Potenziale di migliorare il processo di identificazione dei composti promettenti.
Conclusioni
- Questo metodo di coltura di sferoidi tumorali 3D migliora gli sforzi nella scoperta di farmaci.
- Fornisce una rappresentazione più accurata della biologia tumorale.
- L'approccio può portare all'identificazione di nuove terapie oncologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo affronta il divario traduttivo nella scoperta di farmaci oncologici consentendo lo screening ad alto rendimento in un modello di sferoidi tumorali tridimensionali fisiologicamente rilevante. Supporta una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, rivelando risposte differenziali ai farmaci tra condizioni di coltura bidimensionali e tridimensionali. L'approccio migliora l'identificazione di composti attivi da sviluppare in lead per inibitori della via MAPK in modelli di cancro geneticamente definiti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in un sistema rilevante per la malattia, che riproduce le interazioni cellulari tridimensionali e l'organizzazione spaziale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico confrontando l'efficacia del composto in colture bidimensionali e tridimensionali per identificare attività dipendenti dal contesto.
- Valore predittivo: Facilita l'identificazione di composti promettenti rilevando una sensibilità differenziale nei modelli di carcinoma polmonare non a piccole cellule con mutazione di KRAS in condizioni tridimensionali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un sistema di coltura 3D standardizzato e riproducibile, compatibile con formati a 1536 pozzetti, per lo screening su larga scala di composti.
- Valore operativo: Permette letture quantitative di luminescenza basate sull'ATP per misurare l'inibizione della crescita e generare curve dose-risposta e valori di IC50.
- Prontezza del saggio: Utilizza il dosaggio acustico per una somministrazione precisa di composti in nanolitri e un'incubazione sigillata per prevenire l'evaporazione, garantendo l'integrità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica modellando le interazioni tra tumore e stroma e le condizioni simili alla matrice extracellulare in un formato scalabile.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette l'osservazione dell'attivazione paradossale della crescita nei mutanti del dimero RAF, fornendo indicazioni per strategie di terapia combinata e riducendo i rischi associati ai candidati clinici.
- Allineamento dei Biomarcatori: Consente la valutazione di inibitori specifici per pathway (ad esempio, MAPK) in contesti geneticamente definiti, al fine di correlare il genotipo con la risposta al farmaco.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, consentendo una valutazione precoce dell'efficacia del composto in un contesto fisiologicamente più rilevante, prima dell'investimento preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rivelando come la coltura 3D modifichi la sensibilità ai farmaci in modelli guidati da oncogeni, come il carcinoma polmonare non a piccole cellule con mutazione di KRAS.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio mediante la formazione standardizzata di sferoidi in piastre da 1536 pozzetti, seguendo protocolli controllati di incubazione e sigillatura.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa delle variabili dipendenti attraverso la normalizzazione della luminescenza dell'ATP ai controlli con DMSO, facilitando il calcolo dell'IC50 e l'analisi comparativa della potenza.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando l'architettura spaziale del tumore e le interazioni clonali assenti nei sistemi bidimensionali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di diverse linee cellulari tumorali e librerie di composti mirati a vie conservate come quella del MAPK.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso il confronto diretto delle risposte ai farmaci in condizioni 2D e 3D.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante flussi di lavoro su piastre da 1536 pozzetti compatibili con robotica e incubazione sigillata.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando composti con attività specifica del contesto, riducendo il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei lead aggiustata per il rischio in base all'efficacia differenziale in modelli fisiologicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di coltura cellulare 3D, inclusa la neutralizzazione della tripsina, il conteggio cellulare e il piastramento sterile.
- Richiede strumentazione come sistemi a cassette basati su pompe peristaltiche, dispenser acustici, incubatori rotanti e luminometri per piastre.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di sigillatura, i parametri di incubazione (37°C, 10 giri/min, 5% CO2, 95% di umidità) e le procedure di normalizzazione dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse linee cellulari tumorali, poiché l'efficienza di formazione degli sferoidi può variare anche in presenza di formazione riuscita in linee consolidate.
- Include limitazioni pratiche, come la necessità di prevenire l'evaporazione durante incubazioni prolungate e l'ottimizzazione della somministrazione dei composti in volumi nanolitri.
