Name: Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Impara a coltivare sferoidi tumorali tridimensionali in piastre 1536 pozzetti per lo screening ad alto rendimento di farmaci oncologici. Questo metodo migliora la rilevanza fisiologica rispetto alle colture 2D.

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Gli autori desidera ringraziare Marc Ferrer al centro nazionale per le scienze traslazionale avanzando, National Institutes of Health per il supporto e la guida sullo sviluppo iniziale di queste analisi. Inoltre, vorremmo ringraziare Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling e Vesselina Cooke per il contributo scientifico e la discussione come membri del team di progetto.

1. coltura di sferoidi tumore 1536 pozzetti 3D
<ol><li>Preparare un gambo fresco 3D tumore sferoide media (medium cellulare + sostituzione del siero knockout + insulina-transferrina-selenio) aggiungendo i seguenti reagenti a 500 mL di mezzo di aquile per volta di Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicillina/streptomicina, 10 ng/mL di umani fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL di umano fattore di crescita epidermico (EGF), 0,4% albumina di siero bovino (BSA) (frazione V), 1 x insulina-transferrina-selenio e sostituzione del siero 1% knockout (KO) (non gelività).</li>
	<li>Filtro-sterilizzare l'intero mezzo con i supplementi attraverso un sistema di filtro bottiglia-top 0,4 µm.</li>
	<li>Scollegare le linee cellulari di cancro, che sono in crescita in base alle condizioni di coltura sistematica consigliati, dai palloni coltura cellulare tradizionale lavandole 3x con fosfato 1x tampone salino (PBS) e aggiungendo una quantità appropriata di 0,25% tripsina (1 mL a 5 cm2) per 5 min creare uno strato sottile sulle celle. Neutralizzare la tripsina con 5 volte l'importo del mezzo che contiene il siero e procedere per contare le celle. Ad esempio, è possibile utilizzare 25 mL di terreno per 5 mL di tripsina.</li>
	<li>Regolare la concentrazione della soluzione cella a 62,5 x 104 cellule/mL per un totale di 500 cellule per pozzetto in 8 µ l di terreno di sferoide di semi nelle piastre 1536 pozzetti tessuto-cultura-trattati.</li>
	<li>In una cappa di sicurezza biologica, seme le celle utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola con un sistema basato su pompa peristaltica. Tra diverse linee cellulari, svuotare il tubo della cassetta con 1x PBS e 70% etanolo per 10 s.</li>
	<li>In alternativa, seme le celle utilizzando un gestore di liquido che si trova all'interno di una camera HEPA-filtrati utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola e una pompa peristaltica o una pompa siringa collegata, a seconda del numero di piastre per cella riga necessaria.</li>
	<li>Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione targhetta adesiva traspirante sia manualmente o utilizzando un foglio sigillante.</li>
	<li>Posizionare le piastre in un'incubatrice di filatura fissato a 10 giri/min e 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2) e 95% di umidità relativa. Consentire gli sferoidi al form per 3 d.</li>
</ol>2. coltura delle linee 2D 1536 pozzetti del cancro
Nota: Le linee di cancro 2D 1536 pozzetti devono essere coltivate 24 h prima dell'aggiunta del composto per le piastre 3D.
<ol><li>Preparare un supporto di cellule di cancro 2D aggiungendo i seguenti reagenti a 500 mL di un mezzo di crescita appropriata per le righe selezionate: 1x penicillina/streptomicina e 10% siero bovino fetale (FBS).</li>
	<li>Filtro-sterilizzare l'intero mezzo con i supplementi attraverso un sistema di filtro bottiglia-top 0,4 µm.</li>
	<li>Scollegare le linee cellulari di cancro, che sono in crescita in base alle condizioni di coltura sistematica consigliati, dai palloni coltura cellulare tradizionale lavandole 3x con 1x PBS e aggiungendo una quantità appropriata di 0,25% tripsina (1 mL / 5cm2) per 5 min per creare uno strato sottile sulle celle. Neutralizzare la tripsina con 5 volte l'importo del mezzo che contiene il siero e procedere per contare le celle. Ad esempio, è possibile utilizzare 25 mL di terreno per 5 mL di tripsina.</li>
	<li>Regolare la concentrazione della soluzione cella a 62,5 x 104 cellule/mL per un totale di 500 cellule per pozzetto in 8 µ l di terreno completo di semi in tessuto-cultura-trattati in 1536 pozzetti.</li>
	<li>In una cappa di sicurezza biologica, seme le celle utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola con un sistema basato su pompa peristaltica. Tra le diverse linee cellulari, svuotare il tubo della cassetta con 1x PBS sterile e 70% etanolo per 10 s.</li>
	<li>In alternativa, seme le celle utilizzando un gestore di liquido che si trova all'interno di una camera di robotica filtrata HEPA utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola e una pompa peristaltica o la pompa siringa collegata, a seconda del volume delle piastre per cella linea necessari.</li>
	<li>Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione targhetta adesiva traspirante sia manualmente o utilizzando un foglio sigillante.</li>
	<li>Posizionare le piastre in un'incubatrice di filatura fissato a 10 giri/min e 37 ° C per 24 h prima dell'aggiunta di composto, con 5% CO2% e 95% di umidità relativa.</li>
</ol>3. aggiunta di composti
<ol><li>Preparare diluizioni di 8 punti, 3 volte seriale degli inibitori MAPK in 100% dimetilsolfossido (DMSO) su un robot di movimentazione di liquidi con una concentrazione superiore a 10 mM. L'inibitore del proteasoma Bortezomib viene utilizzato come controllo positivo per una cella completa uccidendo per determinare la gamma dinamica del dosaggio.</li>
	<li>Rapido-spin tutti analisi di piastre e composto a 100 x g per raccogliere eventuali fenomeni di condensa. Rimuovere il sigillo adesivo da ogni piatto e mettere un piatto su un assetto acustico erogatore per aggiungere un totale di 8 nL di ogni composto/diluizione che rappresenta una concentrazione finale di 0,1% DMSO per pozzetto e una dose superiore composta di 10 µM.</li>
	<li>Una volta completata l'aggiunta del composto, mettere un coperchio di cultura cellulare su misura, in acciaio inox che impedisce l'evaporazione sulla piastra e posizionare la piastra in un incubatore di filatura a 37 ° C per 5 d, con 5% CO2% e 95% di umidità relativa.</li>
</ol>4. aggiunta dei reagenti rilevamento e l'acquisizione dei dati grezzi
<ol><li>Pre-riscaldare un volume adeguato di un reagente di lisi delle cellule contenenti luciferina per rilevare variazioni di trifosfato (ATP) di adenina e, quindi, variazioni nella proliferazione delle cellule a temperatura ambiente o a bagnomaria a 37 ° C. Aggiungere un totale di 3 µ l di reagente di rivelazione ad ogni pozzetto utilizzando una pompa peristaltica e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 15 min.</li>
	<li>Catturare la luminescenza su una piastra luminometro.</li>
</ol>5. elaborazione dei dati
<ol><li>Estrarre i dati non elaborati dallo strumento e normalizzare tutti i campi contenenti composti di prova per la media di tutti i pozzetti contenenti DMSO da solo come il controllo del neutro. Da questo valore, è necessario calcolare l'inibizione della crescita delle percentuali di ciascun composto. Questo è completato con la funzione formula in Microsoft Excel dove f (x) = {(campione valore unità di luce relativa (RLU) / (DMSO valore RLU medio) * 100)}.</li>
	<li>Generare le curve dose-risposta e IC50s inibitorio rappresentando graficamente i valori dei dati normalizzati dal passaggio 5.1 contro la concentrazione di composta utilizzando un programma di grafica. Nota: Abbiamo analizzato i dati utilizzando Helios, uno strumento di software NIBR interno. Per completare questa funzione, abbiamo scelto lo strumento di analisi non parametrica della curva.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti di Novartis, e alcuni dipendenti sono anche azionisti.

I metodi presentati qui dimostrano un protocollo dettagliato su come produrre sferoidi di tumore nel 1536 pozzetti per proiezioni su larga scala di composti. Questi metodi sono stati inizialmente adattati dal lavoro presso il National Cancer Institute dove sferoidi del tumore sono state coltivate in saggi di basso-velocità di trasmissione in 6 pozzetti e 96 pozzetti piastre per porre domande su dipendenze genetiche e sensibilità composto13, 14 , <sup c...

Nell'ultimo decennio, sempre più studi hanno implementato l'utilizzo di modelli di coltura cellulare 3D a capire concetti che non sono completamente ricapitolati coltivando cellule in 2D su plastica. Esempi di questi concetti includono le alternanze in normale delle cellule epiteliali polarità1 dove vengono perse l'orientamento spaziale degli strati apicali e basali delle cellule, come pure il ruolo della matrice extracellulare nella regolazione della sopravvivenza e il destino della cellula. Ricerca oncologica, in particolare, ha utilizzato modelli 3D per capire la biologia delle cellule tumorali e le differenze tra 2D e 3D cell culture sistemi3,4. Lo sviluppo delle più sofisticate tecniche di coltura cellulare e loro ulteriore adattamento a formati multi-pozzetto ha permesso la ricerca di nuovi farmaci in impostazioni 3D. Contrariamente alle cellule coltivate in condizioni 2D, modelli 3D di fascia di tumori nella complessità da sistemi cellulari stratificati5 per singolo-cellula-tipo sfere di diverse dimensioni, a complessi multi-cell-tipo sfere6,7, 8. la scoperta di nuovi composti o biologics che potente inducono la morte delle cellule in questi sistemi di modello 3D è, pertanto, di grande interesse in campagne di sviluppo della droga. Endpoint di queste analisi sono spesso identiche a quelle eseguite in 2D culture per valutare i cambiamenti nella proliferazione delle cellule, ma quando condotto in un ambiente più fisiologicamente rilevante, possono rivelare il vero livello di dipendenza del gene bersaglio o via essendo interrogato.
Come introdotto sopra, una varietà di sistemi di modello sono stati sviluppati per lo studio delle risposte farmacologiche in sistemi di coltura 3D, ma la maggior parte utilizza entrambi piastre di microtitolazione 96 o 384 pozzetti e non è facilmente adattabile ai formati high throughput screening (HTS) spesso usati in campagne di screening scoperta della droga. Tali sistemi prevedono l'utilizzo di tecnologie di goccia, culture sferoide, palpitazione cellule con particelle magnetiche per indurre la levitazione e culture che incorporano gel naturali o sintetici, quali collagene, Matrigel o polietilenglicole (PEG)2 per appendere . Qui, presentiamo i metodi dettagliati di una tecnica precedentemente sviluppata per produrre colture di sferoide 3D da linee cellulari di cancro stabilito in un formato di 1536 pozzetti. In questo protocollo, viene utilizzato un mezzo altamente definito che impedisce l'attacco di cellulari normalmente aderenti linee9. Questo sistema presenta limitazioni (vale a dire, essa non può ricapitolare completamente un sistema complesso modello di cancro), ma ciò nonostante, queste analisi permettono uno screening ad alta resa di grandi collezioni di piccole molecole e traverso comparazioni di risposta ai farmaci tra 2D e 3D culture contro una varietà di linee cellulari e composti.
Le linee cellulari selezionati per illustrare i metodi in questo articolo tutte le porto mutazioni in geni correlati per il via, una via che è altamente dysregulated in cancro, di segnalazione MAPK e per cui molte terapie sono disponibili. Molte delle linee hanno attivazione mutazioni oncogeniche in Kirsten Rat Sarcoma virus indicato anche come KRAS, il RAS di Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus Harvey Rat Sarcoma o HRA e le chinasi associate rapidamente accelerato Fibrosarcomas, conosciuto anche come RAFs. Letteratura recente suggerisce che gli inibitori di diversi nodi di questa via sono univocamente più efficaci in un sottoinsieme delle linee cellulari quando coltivate in condizioni 3D9,10. Uno studio ha trovato che quando le cellule tumorali con RAS attivo sono state coltivate in 3D, ha dimostrato una maggiore sensibilità agli inibitori MAPK e inoltre, che questo approccio potrebbe identificare vie e inibitori che potrebbero essere perso in 2D tradizionale e mirata l'impostazione. L'obiettivo di questo studio è di presentare i metodi utilizzati per la coltura di queste linee cellulari, e ulteriormente, per dimostrare il differenziale risposte a questi inibitori che possono essere osservati solo quando si utilizza 3D delle cellule sistemi di coltura.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Acquistato come soluzione preparata. Questa ricetta è risultata essere preferita rispetto ad altri fornitori.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Acquistato come soluzione preparata.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Acquistato come soluzione preparata.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Acquistato come soluzione preparata.</td></tr><tr><td>1x 0,25% Tripsina con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Clone</td><td>SH30042,01</td><td>Acquistato come soluzione preparata.</td></tr><tr><td>1x Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Acquistato come soluzione preparata.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Fattore di crescita Fibrobast basico umano (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Risospendere in acqua sterile.</td></tr><tr><td>20 ng/mL Fattore di crescita epidermico umano (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Risospensione in acqua sterile.</td></tr><tr><td>0,4% Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Resuspend in PBS sterile e filtro.</td></tr><tr><td>1x Insulina Transferrina Selenio (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Siero di Ricambio</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Aggiungere fresco subito prima dell'uso.</td></tr><tr><td>100% dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Acquistato come soluzione preparata.</td></tr><tr><td>Materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cassetta combinata piccola</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta multiflusso piccola Piastre</td> TC sterili <td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536 pozzetti (bianco)</td>Piastre TC sterili <td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536 pozzetti (nero)</td><td>Piastre</td><td></td> Corning 3893 <td></td></tr><tr><td>Scivax</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives sigilli ThermoFisher</td><td></td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore rotante</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coperchi in acciaio inossidabile</td><td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Acoustic Dispensor</td><td>EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica - Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di sferoidi tumore tridimensionale high-throughput per lo screening di stupefacenti

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Le cellule tumorali hanno state coltivate ordinariamente in due dimensioni (2D) su una superficie di plastica. Questa tecnica, tuttavia, manca il vero ambiente un tumore massa è esposto a in vivo. Tumori solidi non come un foglio allegato al plastica crescono, ma invece come un insieme di cellule clonali in un tridimensionale (3D) spazio interagendo con i loro vicini e con proprietà distinte spaziali quali la rottura della polarità cellulare normale. Queste interazioni inducono le cellule coltivate in 3D di acquisire caratteristiche morfologiche e cellulari che sono più rilevanti per i tumori in vivo . Inoltre, un tumore massa è a diretto contatto con altri tipi cellulari come cellule stromale ed immuni, come pure la matrice extracellulare da tutti gli altri tipi di cella. La matrice depositata è composto da macromolecole come collagene e fibronectina.
Nel tentativo di aumentare la traduzione dei risultati della ricerca in oncologia dal banco al capezzale, molti gruppi hanno iniziato a studiare l'uso di sistemi di modello 3D nelle loro strategie di sviluppo della droga. Questi sistemi sono pensati per essere più fisiologicamente rilevanti perché tentano di ricapitolare l'ambiente complesso ed eterogeneo di un tumore. Questi sistemi, tuttavia, possono essere molto complessi, e, anche se suscettibili di crescita a 96 pozzetti formati e alcuni ora anche nel 384, che offrono alcune scelte per la crescita su larga scala e lo screening. Questo osservato gap ha portato allo sviluppo dei metodi descritti qui in dettaglio per cultura tumore sferoidi in una capacità di alto-rendimento in 1536 pozzetti. Questi metodi rappresentano un compromesso ai sistemi basati su matrice altamente complessi, che sono difficili da schermo e le analisi 2D convenzionale. Una varietà di linee cellulari del cancro che harboring le mutazioni genetiche differenti vengono proiettati con successo, esaminando l'efficacia composto utilizzando una libreria a cura di composti targeting pathway della chinasi di proteina mitogen o MAPK. Le risposte di cultura sferoide sono quindi confrontate con la risposta delle cellule coltivate in 2D, e attività differenziale sono segnalati. Questi metodi forniscono un protocollo unico per il test composto attività in un ambiente 3D di alto-rendimento.

Una varietà di cellula del cancro stabilito linee conosciute a crescere bene in condizioni di coltura 2D sono stati testati utilizzando i metodi descritti qui. Linee cellulari immagini rappresentative da una varietà di cancro mutante MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS) sono visibili nella Figura 1. Queste immagini dimostrano che, anche se le linee cellulari hanno varie morfologie, ciascuno formato strutture 3D nelle piastre di dos...

Attraverso un'ampia varietà di indicazioni di malattia, modelli più fisiologicamente rilevanti sono in corso programmi di scoperta della droga sviluppata e implementata in. Il nuovo modello di sistema descritto qui di seguito viene illustrato come tridimensionale del tumore sferoidi possono essere coltivate e proiettati in un sistema basato su piastra 1536 pozzetti ad alta produttività per la ricerca di nuovi farmaci oncologici.

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci, come ad esempio qual è l'impostazione di coltura tissutale più rilevante per l'identificazione da colpo a piombo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la coltura di cellule in tre dimensioni, ad alta produttività, utilizzando 1536 piastre a pozzetti. A dimostrare questo protocollo sarà Kalyani Gampa, uno scienziato senior del mio laboratorio.Per impostare una coltura di sferoidi tumorali 3D, staccare le linee cellulari tumorali di interesse con tre lavaggi di BBS. Segue l'aggiunta di un millilitro di tripsina per cinque centimetri quadrati di pallone di coltura. Dopo cinque minuti, neutralizzare la tripsina con cinque volte il volume del terreno integrato di siero in ogni fiaschetta e contare le cellule.Utilizzare una piccola cassetta sterilizzata in acciaio inossidabile con un sistema basato su pompa peristaltica per seminare un totale di 500 cellule in otto microlitri di terreno sferoidale in ciascun pozzetto di una piastra trattata con coltura tissutale da 1.536 pozzetti. Quindi utilizzare una guarnizione adesiva traspirante per coprire la piastra. E posiziona la pias

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Vi presentiamo un protocollo per la generazione di numeri di grandi dimensioni (migliaia a centinaia di migliaia) di taglia e sferoidi tumorali uniformi di composizione controllata, utilizzando micropiastra disponibili in commercio.

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Viene presentato un protocollo per la stampa robotica di sferoidi di cellule tumorali in un formato di piastra a 96 pozzetti ad alta produttività utilizzando un sistema acquoso a due fasi.

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Gli xenotrapianti di glioblastoma multiforme derivati da pazienti possono essere miniaturizzati in microtumori viventi utilizzando il sistema di coltura di biogel umano 3D. Questo test tumorale 3D in vivo è adatto per i test di risposta ai farmaci e la profilazione molecolare, compresa l'analisi cinematica.

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l'analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza e l'imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l'identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Gli sferoidi tumorali stanno diventando sempre più utilizzati per valutare le interazioni cellula tumorale-microambiente e la risposta terapeutica. Il presente protocollo descrive un metodo robusto ma semplice per l'imaging semi-ad alto rendimento di sferoidi tumorali 3D utilizzando la rapida compensazione ottica.

Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

Qui, stabiliamo una piattaforma di profilazione metabolica che integra gliomi sferoidi tridimensionali (3D) e normalizzazione basata sull'imaging tramite analisi del flusso extracellulare. Questo approccio consente una valutazione più accurata delle risposte metaboliche dei tumori ai trattamenti farmacologici e fornisce informazioni sui potenziali meccanismi di resistenza.

Progressi nella profilazione metabolica degli sferoidi tridimensionali dei tumori cerebrali per lo screening dei farmaci

Impara a coltivare sferoidi tumorali tridimensionali in piastre 1536 pozzetti per lo screening ad alto rendimento di farmaci oncologici. Questo metodo migliora la rilevanza fisiologica rispetto alle colture 2D.

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

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