CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

L'obiettivo generale di CARIP-Seq è quello di esaminare gli RNA associati alla cromatina a livello di genoma. L'obiettivo di ChIP-Seq è quello di valutare le interazioni proteina-DNA su scala globale nelle cellule staminali embrionali. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica e delle cellule staminali, identificare la posizione del genoma, i fattori di trascrizione o il legame del regolatore epigenetico o l'occupazione della modifica degli istoni o gli RNA associati alla cromatina nelle cellule staminali embrionali.

Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono l'interrogazione imparziale a livello di genoma degli RNA associati ai costituenti della cromatina e l'identificazione globale delle interazioni proteina DNA. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sulla biologia delle cellule staminali embrionali, possono anche essere applicati ad altri tipi di cellule di mammifero per studiare la biologia del cancro o altre malattie umane. Per raccogliere le cellule staminali embrionali, lavare prima le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.

Quindi, staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina, preriscaldate a 37 gradi Celsius. Dopo la tripsinizzazione, risospendere le cellule in terreno MEF preriscaldato, integrato con siero fetale bovino al 10%. Quindi, aggiungere il 37% di formaldeide alle cellule in un tubo conico fino a una concentrazione finale dell'1% e incubare a 37 gradi Celsius per otto minuti per reticolare le cellule.

Per fermare la reazione di fissazione, aggiungere 1,25 molari di glicina pre-raffreddata a quattro gradi Celsius a una concentrazione finale di 0,125 molari. Quindi, posizionare il tubo su un rotatore e capovolgerlo a otto giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, centrifugare il campione a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Al termine della centrifugazione, scartare il surnatante. Quindi, lavare il pellet con soluzione salina tamponata con fosfato pre-raffreddato e centrifugare nuovamente il campione. Quindi, rimuovere la soluzione salina tamponata con fosfato e congelare le cellule in azoto liquido per un minuto.

Una volta che le cellule staminali embrionali sono state scongelate con ghiaccio, risospendere il pellet in 2,5 millilitri di tampone di sonicazione. Per studiare i fattori di trascrizione o i fattori epigenetici, risospendere il pellet cellulare in un tampone di sonicazione senza dodecil solfato di sodio. Per le modifiche istoniche, risospendere il pellet cellulare in un tampone contenente sodio dodecil solfato.

Successivamente, per l'immunoprecipitazione della cromatina, sonicare la cromatina per 14-18 cicli al 40% di ampiezza con 30 secondi di accensione e 30 secondi di riposo. Per solubilizzare la cromatina per il fattore proteico ChIP, integrare il tampone di sonicazione con 28 microlitri di dodecil solfato di sodio al 10%. Per i fattori proteici nelle modificazioni istoniche, aggiungere 28 microlitri di sodio desossicolato e 0,28 millilitri di Triton X-100 al 10% e mescolare bene.

Quindi, centrifugare il campione a 10.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per eliminare preventivamente la cromatina. In un tubo a basso legame da 1,5 millilitri, aggiungere 40 microlitri di perline magnetiche A o G. Quindi, lavare le perle con 600 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato e trasferire la provetta con le perle su una griglia contenente un magnete e incubare per un minuto a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere la soluzione salina tamponata con fosfato e risospendere nuovamente le perle in 100 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Al tubo, aggiungere da due a quattro microgrammi di anticorpo e incubarlo posizionandolo su un rotatore per 40 minuti a otto giri al minuto per favorire il legame degli anticorpi alle perle. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per lavare le perle.

Dopo il lavaggio, incubare l'estratto di cromatina sonicata su un rotatore a quattro gradi Celsius durante la notte per immunoprecipitare le proteine legate alla cromatina. Il giorno successivo, lavare le perle e incubare con tampone RIPA, tampone RIPA con sale, tampone cloruro di litio, tampone Tris-EDTA con Triton X-100 e tampone Tris-EDTA, ciascuno per 10 minuti su un rotatore. Per reticolare nuovamente il ChIP, risospendere le perle in 100 microlitri di tampone Tris-EDTA.

Quindi aggiungere tre microlitri di dodecil solfato di sodio al 10% e cinque microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e incubare le perle a 65 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, il giorno successivo, capovolgere più volte le provette, lasciarle sulla rastrelliera magnetica e trasferire il surnatante in una provetta nuova. Quindi, lavare le microsfere magnetiche aggiungendo 100 microlitri di tampone Tris-EDTA, contenente 0,5 molari di cloruro di sodio e combinare i due surnatanti.

Per dereticolare per CARIP, risospendere le perle in 100 microlitri di tampone Tris-EDTA. Quindi, aggiungere tre microlitri di dodecil solfato di sodio al 10% e cinque microlitri da 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e incubare le perle a 65 gradi Celsius per quattro-12 ore. Anche in questo caso, capovolgere più volte la provetta e posizionarla sulla griglia magnetica per trasferire il surnatante in una provetta nuova.

Quindi, lavare le microsfere magnetiche aggiungendo 100 microlitri di tampone Tris-EDTA, contenente 0,5 molari di cloruro di sodio e quindi combinare i due surnatanti. Infine, isolare il campione di RNA utilizzando alcol isoamilico fenolo cloroformio in un rapporto da 25 a 24 in un rapporto volume/volume. Successivamente, utilizzare la DNasi per rimuovere il DNA dal campione di RNA immunoprecipitato associato alla cromatina.

Quindi, aggiungere il tampone DNasi 10X al campione CARIP e regolare il volume finale a una concentrazione 1X. Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, sintetizzare il primo filamento di DNA complementare impostando una reazione PCR aggiungendo 10,5 microlitri di RNA e un microlitro di tre microgrammi per millilitro di primer esamero casuali.

Per denaturare la struttura secondaria, prima incubare la provetta a 65 gradi Celsius per cinque minuti, quindi su ghiaccio per due minuti. Quindi, aggiungere la miscela master alla provetta PCR e incubare a 25 gradi Celsius per due minuti. Quindi, aggiungere un microlitro da 200 unità per microlitro di apice due ed eseguire il programma del termociclatore.

Per sintetizzare il secondo filamento di DNA complementare, impostare la reazione sul ghiaccio aggiungendo i reagenti, il tampone e gli enzimi. Quindi, agitare delicatamente i reagenti e incubare a 16 gradi Celsius per due ore. Dopo che il DNA è stato sintetizzato, purificare il DNA complementare utilizzando un kit di purificazione PCR.

Quindi, deframmentare il DNA a doppio filamento, utilizzare un sonificatore a bagnomaria e un tubo da 1,5 millilitri per condividere il DNA in una dimensione da 250 a 500 paia di basi per tre volte 10 minuti o quattro volte 10 minuti. Quindi, preparare la libreria ed eseguire il sequenziamento di nuova generazione. Qui, sono state catturate immagini a contrasto di fase di cellule staminali embrionali per visualizzare le colonie di cellule staminali.

In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in presenza o assenza di fibroblasti embrionali di topo inattivati mitoticamente con LIF e/o GSK3i nei terreni di coltura per prevenire la differenziazione delle cellule. Quindi, per visualizzare l'efficienza della sonicazione della cromatina delle cellule staminali embrionali reticolate, il DNA sonicato a doppio filamento è stato caricato su un gel di agarosio al 2%. L'immagine del gel mostra la cromatina tranciata nell'intervallo da 200 a 500 coppie di basi.

Successivamente, le librerie ChIP-Seq sono state generate e sequenziate utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione per valutare l'occupazione dell'intero genoma di un enzima modificante gli istoni e le modifiche degli istoni nelle cellule staminali embrionali. Dalla vista personalizzata del browser UCSC, la trimetilazione H3K4, la dimetilazione H3K4 arricchita e KDM5B sono visibili nel gene regolatore della pluripotenza centrale, POU5F1 e nel cluster HOXC. L'analisi CARIP-Seq è stata eseguita anche per valutare gli RNA associati alla cromatina nelle cellule staminali embrionali.

La visualizzazione personalizzata del browser UCSC mostra l'RNA associato alla trimetilazione H4K20 e l'occupazione della trimetilazione H4K20 nelle cellule staminali embrionali. Dai risultati di CARIP-Seq, si può interpretare che, sebbene l'RNA sia associato alla trimetilazione di H4K20, potrebbe non interagire con il particolare locus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare gli RNA associati alla cromatina utilizzando CARIP-Seq e identificare le interazioni proteina DNA su scala globale nelle cellule staminali embrionali.