Name: CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri i metodi CARIP-Seq e ChIP-Seq per mappare gli RNA associati alla cromatina e le interazioni proteina-DNA nelle cellule staminali embrionali. Queste tecniche avanzano la ricerca in epigenetica.

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Questo lavoro è stato supportato da Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, una borsa di studio dal National Heart, Lung e Istituto del sangue (1K22HL126842-01A1) assegnato a B.L.K. Questo lavoro utilizzata la Wayne State University alta Performance Computing Grid per risorse computazionali (< https://www.grid.wayne.edu/>). Ringraziamo Jiji Kurup per assistenza con l'analisi dei dati CARIP-Seq.
CONTRIBUTI DEGLI AUTORI:
B.L.K. concepì il metodo CARIP-Seq, progettato e realizzazione degli esperimenti di ChIP-Seq e CARIP-Seq, analizzati i dati di sequenziamento e redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale di questo manoscritto.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

ChIP-Seq è un metodo utile per valutare la posizione delle interazioni proteina-DNA globale (ad es., fattori di trascrizione/istone modifica modifiche istoniche/enzimi e DNA) in cellule ES, mentre il protocollo di CARIP-Seq recente sviluppato è utile in interrogando associazione genome-wide di RNA con costituenti della cromatina. ChIP-Seq è uno strumento fondamentale che viene utilizzato per valutare epigenetici paesaggi delle celle di ES e altri tipi di cellule. La qualità del ChIP-Seq e librerie CARIP-Seq dipe...

Le decisioni di destino delle cellule staminali embrionali (ES) sono regolate dalla comunicazione tra segnali extracellulari e una serie di regolatori trascrizionali, inclusi i modificatori dell'istone e modifica post-traduzionali degli istoni. Queste interazioni facilitano l'accessibilità della cromatina e impacchettamento della cromatina in uno dei due stati: l'eucromatina, che è aperta e trascrizionalmente attiva, e l'eterocromatina, che è compatto e generalmente trascrizionalmente inattiva. Fattori di trascrizione con affinità di legame al DNA sequenza-specifico e modificatori epigenetici associato con regioni eucromatiche di partecipare nel controllo dell'espressione genica. Metodi di sequenziamento di nuova generazione, tra cui ChIP-Seq1, sono state strumentali nella mappatura reti trascrizionali genoma che sono fondamentali per ES cella auto-rinnovamento e pluripotenza2,3,4 ,5,6. Inoltre, mentre RNA immunopreciation generazione sequenziamento (RIP-Seq)7 valutazioni delle interazioni RNA-proteina suggeriscono che proteine che legano il DNA interagiscono con RNA per regolare gli eventi trascrizionali7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pochi studi hanno studiato la localizzazione di genoma di RNA associati con cromatina12o interazioni globali tra modifiche di RNA e dell'istone. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è una classe di RNA che sono stati trovati per regolare l'attività di proteine della cromatina associate13,14,15. Ad esempio, Xist è un lncRNA che regola, in cellule di mammifero femminile, l'inattivazione di un cromosoma di X, attraverso il reclutamento di repressori epigenetici16,17. Tuttavia, l'intero spettro degli RNA associati con cromatina è in gran parte sconosciuto. Qui, descriviamo un protocollo di romanzo, cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguita da sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq), per identificare il RNAs cromatina-collegato su una base di genoma in cellule ES, compresa la biblioteca preparazione per sequenziamento di nuova generazione e ChIP-Seq per mappare occupazione globale di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici. A differenza di altri metodi di RIP-Seq7, CARIP-Seq comprende fasi di reticolazione e sonicazione, che consentono l'identificazione diretta degli RNA associati della cromatina. Insieme, ChIP-Seq è un potente strumento per identificare le interazioni proteina-DNA del genoma, mentre CARIP-Seq è un potente metodo di indagine RNAs associato a componenti della cromatina.

<table><tbody><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia di topo (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 o 107 unità</td></tr><tr><td>CHIR99021 inibitore di GSK3&beta; (GSK3i)</td><td>Solvente stemgente</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>PD0325901 inibitore MEK (MEKi)</td><td>Solvente stemgente</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glucosio alto</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovino Serum, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Soluzione di gelatina</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1,25 M incorporazione in acqua Soluzione di</td></tr><tr><td>formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X</td><td>Qualità Biologica</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) soluzione</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteasi Inibitore Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di sodio dodecil solfato (20%)</td><td>Qualità Biologico</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonificatore</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteina G per l'immunoprecipitazione</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteina A per l'immunoprecipitazione</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteina A/Proteina G e Magnete Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di litio</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kit di purificazione dell'mRNA (per la purificazione dell'mRNA da preparazioni di RNA totale)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Sintesi di cDNA a doppio filamento Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di riparazione finale del DNA End-It</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Frammento di Klenow (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX gel gel di agarosio, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion master mix 2X ad alta fedeltà con tampone HF</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Trimetil-istone H3 (Lys4) - Anticorpo convalidato ChIP</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-istone H3 (di metilK4) [Y47] - Grado ChIP (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a fondo piatto Corning Costar (6 pozzetti)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Piastre per colture tissutali standard (10 cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometro 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Kit di pulizia della reazione</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Kit di estrazione su gel</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-istone H4 (tri metil K20) - ChIP Grade (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq e chip-seq: metodi per identificare la cromatina associata rnas e interazioni proteina-dna in cellule staminali embrionali

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Cellule staminali embrionali (ES) auto-rinnovamento e differenziazione è regolata dai segnali estrinseci e intrinseci reti di fattori di trascrizione, regolatori epigenetici e modificazioni post-traduzionali degli istoni che combinatoriamente influenzano il gene stato di espressione di geni vicini. RNA ha anche dimostrato di interagire con diverse proteine per regolare la dinamica della cromatina ed espressione genica. Cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguite dal sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq) è un nuovo metodo di indagine RNAs associato a proteine della cromatina, mentre immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione ( ChIP-Seq) è una tecnica potente genomica per mappare la posizione di modificazione post-traduzionale di istoni, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici su una scala globale in cellule ES. Qui, descriviamo i metodi per eseguire CARIP-Seq e ChIP-Seq, tra cui la costruzione della libreria per la sequenziazione di prossima generazione, per generare mappe epigenomic e globale della cromatina-associated RNA in cellule ES.

Abbiamo interrogato con successo l'associazione genome-wide di H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B in cellule ES utilizza questo ChIP-Seq protocollo6. Le cellule ES sono state coltivate in condizioni prive di alimentatore (Figura 1) e reticolato come descritto sopra. Sonicazione è stata successivamente eseguita come descritto al punto 3.2 del protocollo ChIP-Seq e valutata esaminando il DNA su un gel di agarosio al 2% (Figura...

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

L'obiettivo generale di CARIP-Seq è quello di esaminare gli RNA associati alla cromatina a livello di genoma. L'obiettivo di ChIP-Seq è quello di valutare le interazioni proteina-DNA su scala globale nelle cellule staminali embrionali. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica e delle cellule staminali, identificare la posizione del genoma, i fattori di trascrizione o il legame del regolatore epigenetico o l'occupazione della modifica degli istoni o gli RNA associati alla cromatina nelle cellule staminali embrionali.Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono l'interrogazione imparziale a livello di genoma degli RNA associati ai costituenti della cromatina e l'identificazione globale delle interazioni proteina DNA. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sulla biologia delle cellule staminali embrionali, possono anche essere applicati ad altri tipi di cellule di mammifero per studiare la biologia del cancro o altre malattie umane. Per raccogliere le cellule staminali embrionali, lavare prima le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato.Quindi, staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina, preriscaldate a 37 gradi Celsius. Dopo la tripsinizzazione, risospendere le cellule in terreno MEF preriscaldato, integrato con siero fetale bovino al 10%. Quindi, aggiungere il 37% di formaldeide alle cellule in un tubo conico fino a una concentrazione finale dell'1% e incubare a 37 gradi Celsius per otto minuti per reticolare le cellule.Per fermare la reazione di fissazione, aggiungere 1,25 molari di glicina pre-raffreddata a quattro gradi Celsius a una concentrazione finale di 0,125 molari. Quindi, posizionare il tubo su un rotatore e capovolgerlo a otto giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, centrifugare il campione a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente.Al termine della centrifugazione, scartare il surnatante. Quindi, lavare il pellet con soluzione salina tamponata con fosfato pre-raffreddato e centrifugare nuovamente il campione. Quindi, rimuovere la soluzione salina tamponata con fosfato e congelare le cellule in azoto liquido per un minuto.Una volta che le cellule staminali embrionali sono state scongelate con ghiaccio, risospendere il pellet in 2,5 millilitri di tampone di sonicazione. Per studiare i fattori di trascrizione o i fattori epigenetici, risospendere il pellet cellulare in un tampone di sonicazione senza dodecil solfato di sodio. Per le modifiche istoniche, risospendere il pellet cellulare in un tampone contenente sodio dodecil solfato.Successivamente, per l'immunoprecipitazione della cromatina, sonicare la cromatina per 14-18 cicli al 40% di ampiezza con 30 secondi di accensione e 30 secondi di riposo. Per solubilizzare la cromatina per il fattore proteico ChIP, integrare il tampone di sonicazione con 28 microlitri di dodecil solfato di sodio al 10%. Per i fattori proteici nelle modificazioni istoniche, aggiungere 28 microlitri di sodio desossicolato e 0,28 millilitri di Triton X-100 al 10% e mescolare bene.Quindi, centrifugare il campione a 10.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per eliminare preventivamente la cromatina. In un tubo a basso legame da 1,5 millilitri, aggiungere 40 microlitri di perline magnetiche A o G. Quindi, lavare le perle con 600 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato e trasferire la provetta con le perle su una griglia contenente un magnete e incubare per un minuto a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere la soluzione salina tamponata con fosfato e risospendere nuovamente le perle in 100 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Al tubo, aggiungere da due a quattro microgrammi di anticorpo e incubarlo posizionandolo su un rotatore per 40 minuti a otto giri al minuto per favorire il legame degli anticorpi alle perle. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per lavare le perle.Dopo il lavaggio, incubare l'estratto di cromatina sonicata su un rotatore a quattro gradi Celsius durante la notte per immunoprecipitare le proteine legate alla cromatina. Il giorno successivo, lavare le perle e incubare con tampone RIPA, tampone RIPA con sale, tampone cloruro di litio, tampone Tris-EDTA con Triton X-100 e tampone Tris-EDTA, ciascuno per 10 minuti su un rotatore. Per reticolare nuovamente il ChIP, risospendere le perle in 100 microlitri di tampone Tris-EDTA.Quindi aggiungere tre microlitri di dodecil solfato di sodio al 10% e cinque microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e incubare le perle a 65 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, il giorno successivo, capovolgere più volte le provette, lasciarle sulla rastrelliera magnetica e trasferire il surnatante in una provetta nuova. Quindi, lavare le microsfere magnetiche aggiungendo 100 microlitri di tampone Tris-EDTA, contenente 0,5 molari di cloruro di sodio e combinare i due surnatanti.Per dereticolare per CARIP, risospendere le perle in 100 microlitri di tampone Tris-EDTA. Quindi, aggiungere tre microlitri di dodecil solfato di sodio al 10% e cinque microlitri da 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e incubare le perle a 65 gradi Celsius per quattro-12 ore. Anche in questo caso, capovolgere più volte la provetta e posizionarla sulla griglia magnetica per trasferire il surnatante in una provetta nuova.Quindi, lavare le microsfere magnetiche aggiungendo 100 microlitri di tampone Tris-EDTA, contenente 0,5 molari di cloruro di sodio e quindi combinare i due surnatanti. Infine, isolare il campione di RNA utilizzando alcol isoamilico fenolo cloroformio in un rapporto da 25 a 24 in un rapporto volume/volume. Successivamente, utilizzare la DNasi per rimuovere il DNA dal campione di RNA immunoprecipitato associato alla cromatina.Quindi, aggiungere il tampone DNasi 10X al campione CARIP e regolare il volume finale a una concentrazione 1X. Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, sintetizzare il primo filamento di DNA complementare impostando una reazione PCR aggiungendo 10,5 microlitri di RNA e un microlitro di tre microgrammi per millilitro di primer esamero casuali.Per denaturare la struttura secondaria, prima incubare la provetta a 65 gradi Celsius per cinque minuti, quindi su ghiaccio per due minuti. Quindi, aggiungere la miscela master alla provetta PCR e incubare a 25 gradi Celsius per due minuti. Quindi, aggiungere un microlitro da 200 unità per microlitro di apice due ed eseguire il programma del termociclatore.Per sintetizzare il secondo filamento di DNA complementare, impostare la reazione sul ghiaccio aggiungendo i reagenti, il tampone e gli enzimi. Quindi, agitare delicatamente i reagenti e incubare a 16 gradi Celsius per due ore. Dopo che il DNA è stato sintetizzato, purificare il DNA complementare utilizzando un kit di purificazione PCR.Quindi, deframmentare il DNA a doppio filamento, utilizzare un sonificatore a bagnomaria e un tubo da 1,5 millilitri per condividere il DNA in una dimensione da 250 a 500 paia di basi per tre volte 10 minuti o quattro volte 10 minuti. Quindi, preparare la libreria ed eseguire il sequenziamento di nuova generazione. Qui, sono state catturate immagini a contrasto di fase di cellule staminali embrionali per visualizzare le colonie di cellule staminali.In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in presenza o assenza di fibroblasti embrionali di topo inattivati mitoticamente con LIF e/o GSK3i nei terreni di coltura per prevenire la differenziazione delle cellule. Quindi, per visualizzare l'efficienza della sonicazione della cromatina delle cellule staminali embrionali reticolate, il DNA sonicato a doppio filamento è stato caricato su un gel di agarosio al 2%. L'immagine del gel mostra la cromatina tranciata nell'intervallo da 200 a 500 coppie di basi.Successivamente, le librerie ChIP-Seq sono state generate e sequenziate utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione per valutare l'occupazione dell'intero genoma di un enzima modificante gli istoni e le modifiche degli istoni nelle cellule staminali embrionali. Dalla vista personalizzata del browser UCSC, la trimetilazione H3K4, la dimetilazione H3K4 arricchita e KDM5B sono visibili nel gene regolatore della pluripotenza centrale, POU5F1 e nel cluster HOXC. L'analisi CARIP-Seq è stata eseguita anche per valutare gli RNA associati alla cromatina nelle cellule staminali embrionali.La visualizzazione personalizzata del browser UCSC mostra l'RNA associato alla trimetilazione H4K20 e l'occupazione della trimetilazione H4K20 nelle cellule staminali embrionali. Dai risultati di CARIP-Seq, si può interpretare che, sebbene l'RNA sia associato alla trimetilazione di H4K20, potrebbe non interagire con il particolare locus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare gli RNA associati alla cromatina utilizzando CARIP-Seq e identificare le interazioni proteina DNA su scala globale nelle cellule staminali embrionali.

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La differenziazione del Comitato coincide con cellule di tipo specifici cambiamenti nella struttura e nella composizione della cromatina. La rilevazione di questi cambiamenti fornisce preziose informazioni sui meccanismi che definiscono stemcellness e differenziazione cellulare. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) rappresenta un metodo valido per analizzare i meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule staminali.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Questo video mostra i passaggi di base per eseguire l'analisi dell'intero trascrittoma su campioni di midollo spinale embrionale di pollo sezionati dopo la trasfezione con elettroporazione in ovo.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

Un regolamento messa a punto della trascrizione genica alla base embrionali decisione destino della cellula. Qui, descriviamo immunoprecipitazione della cromatina utilizzati per indagare regolazione epigenetica di entrambi differenziazione cardiaca delle cellule staminali e sviluppo cardiaco di embrioni di topo.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Qui presentiamo un protocollo per catturare le interazioni DNA-DNA cromatina associate all'RNA per mappare l'organizzazione genomica tridimensionale correlata all'RNA.

Metodo di Interazione DNA-DNA con Cromatina Associata a RNA

Scopri i metodi CARIP-Seq e ChIP-Seq per mappare gli RNA associati alla cromatina e le interazioni proteina-DNA nelle cellule staminali embrionali. Queste tecniche avanzano la ricerca in epigenetica.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali (Video) | JoVE Journal

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

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