Name: Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Scopri l'ablazione neuronale con laser a due fotoni e la valutazione mediante imaging del calcio e registrazione comportamentale nelle larve di Danio rerio. Questo metodo permette di studiare il ruolo dei neuroni pretectali nella cattura della preda.

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Questi studi sono stati finanziati da contributi ricevuti dal MEXT, JSPS KAKENHI Grant numeri JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse al rapporto.

Anche se il laser del due-fotone ha un'ottima risoluzione spaziale per specificamente l'ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell'esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di irrad...

Per capire come comportamento nasce dall'attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l'attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento1. La formazione immagine dell'attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l'invenzione di indicatori codificato geneticamente calcio (Ca) (GECIs) come GCaMP2. Zebrafish transgenici GCaMP hanno dimostrato di essere utile per l'associazione funzionale circuito neurale con comportamento conducendo imaging Ca a comportarsi animali3.
Mentre la formazione immagine Ca può dimostrare correlazioni tra attività neuronale e comportamento, per mostrare la causalità, soppressione dell'attività neuronale e prova la sua consequence(s) il comportamento sono passi importanti. Ci sono vari modi per raggiungere questo obiettivo: utilizzare di mutazione genetica che altera i circuiti neurali specifici4, espressione delle neurotossine in neuroni specifici5,6, uso di strumenti di optogenetica come halorhodopsin7, e ablazione di neuroni mirate8,9laser. L'ablazione laser è particolarmente adatta per l'eliminazione di attività in un numero relativamente piccolo di neuroni specifici. Eliminazione irreversibile dell'attività neuronale uccidendo i neuroni facilita la valutazione comportamentale conseguenze.
Un comportamento interessante che può essere osservato nella fase larvale in zebrafish è la cattura di prede (Figura 1A). Questo comportamento visivamente guidato, obiettivo-diretto fornisce un favorevole sistema sperimentale per lo studio della acuità visiva10, trasformazione visuomotoria11,12,13, percezione visiva e riconoscimento della oggetti14,15,16,17,18e il processo decisionale19. Come preda è riconosciuto dai predatori e come preda rilevamento conduce alla preda cattura comportamento è stato una questione centrale in neuroethology20. In questa carta, ci concentriamo sul ruolo del circuito pretecto-ipotalamica formato da proiezioni di un nucleo nel pretetto (nucleo pretectalis superficialis pars magnicellulare, d'ora in avanti, semplicemente notato come il pretetto) per il ILH. Ablazione laser del Pretetto è stato indicato per ridurre l'attività di cattura di prede e abolire l'attività neuronale in ILH che è associato con la percezione visiva preda21. Qui, protocolli per l'esecuzione di laser ablazione e prova il suo effetto utilizzando Ca2 + imaging e registrazione del comportamento in zebrafish larve sono descritti.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarosio</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>agarosio a bassa temperatura di fusione</td></tr><tr><td>6 cm piastra di Petri</td><td>FALCON</td><td>Prodotto#:351007</td><td></td></tr><tr><td>ago da dissezione</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. No. 2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 LSM7MP</td><td>Microscopio a scansione laser a due</td><td>fotoni Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Obiettivo Carl Zeiss</td><td></td><td>63X</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>un microscopio a epifluorescenza</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td> Software di acquisizione immagini <td></td><td>per microscopi confocali</td></tr><tr><td>Guarnizione per camera di ibridazione Secure-Seal, 8 camere, 9 mm di diametro x 0,8 mm di profondità</td><td>Sonde molecolari</td><td>Catalogo # S-24732</td><td>Utilizzato come camera di registrazione nelle</td></tr><tr><td>camere di imaging</td> per imaging Ca Camere di imaging <td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell PCI-A-2.5</td><td>Utilizzato come camera di registrazione comportamentale</td></tr><tr><td>Coltello chirurgico</td><td>MANI</td><td>Coltello oftalmico MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>modello: C11440-22CU</td><td>una fotocamera CMOS scientifica</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>image acuisition software</td></tr><tr><td>Modulo di registrazione su disco rigido</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Un modulo software che consente di salvare i file del film su un'unità disco rigido in breve tempo</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>stereoscopio</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>obiettivo per SZX7</td></tr><tr><td>Point Grigio Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>N. prodotto GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Fotocamera CMOS</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ Fotocamera</td><td>XIMEA</td><td>Codice prodotto. </td><td>Telecamera CMOS</td>MQ042RG-CM</tr><tr><td>a luce LED ad anello</td><td>CCS</td><td>Modello: LDR2-100SW2-LA</td><td>LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> bianco <tr><td>Rete di nylon 32&micro; m</td><td>Tokyo Schermo</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Maglia di nylon 13&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Metal seive 150 micron apertura</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metal seive 75 micron apertura</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Sanità, Co. Ltd.</td><td></td><td>lievito di birra secco</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>un ambiente di sviluppo integrato per la programmazione</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>laser a due fotoni&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di zebrafish

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L'ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l'ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l'attività neuronale nel lobo inferiore dell'ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.

Neuroni specifici geneticamente sono stati etichettati con EGFP o GCaMP6s, la cui espressione sono stati guidati in Gal4 linee. Un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 è stato utilizzato per etichettare un nucleo nella zona pretectal (magnocellulare nucleo pretectal superficiale) e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. Un'altra linea di Gal4, hspGFFDMC76A, è stata usata per etichettare il ILH. Abbiamo laser-ha rimosso i neuroni pretectal bilateralmente (Figura 2...

Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è testare l'effetto dell'ablazione laser di alcuni neuroni sull'attività e sul comportamento del circuito. Con questa tecnica sperimentale possiamo esaminare la necessità dei neuroni in un circuito alla base del comportamento. Questo metodo può aiutare a rispondere alle nostre domande chiave nel campo del comportamento e delle neuroscienze, come ad esempio come viene percepita la preda e come il comportamento catturato dalla preda viene generato dall'attività neurale.Il vantaggio principale di questa tecnica è che i neuroni possono essere ablati in modo specifico grazie alla marcatura genetica di questi neuroni e anche all'alta risoluzione spaziale del laser. Dopo aver allevato le larve e averle montate in agarosio a basso punto di fusione al 2% secondo il protocollo di testo, posizionare le larve incorporate nell'agarosio sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni e avviare il sistema di microscopia. Aprire il software di acquisizione delle immagini e nella scheda laser fare clic sul pulsante di accensione per accendere il laser.Attendere che lo stato del laser passi da occupato a modalità bloccato. Nella scheda dei canali, impos

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Fonte: Muto, A., et al. Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser a due fotoni e sua valutazione utilizzando l'imaging del calcio e la registrazione comportamentale nelle larve di zebrafish. J. Vis. Exp. (2018) In questo video,  Viene dimostrata una procedura di ablazione laser a due fotoni, che consente la distruzione selettiva dei neuroni fluorescenti in larve di zebrafish immobilizzate con agarosio. L'imaging ad alta risoluzione prima e dopo la procedura conferma...

Ablazione neuronale mirata mediante microscopia a due fotoni in una larava di pesce zebra

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

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Scopri l'ablazione neuronale con laser a due fotoni e la valutazione mediante imaging del calcio e registrazione comportamentale nelle larve di Danio rerio. Questo metodo permette di studiare il ruolo dei neuroni pretectali nella cattura della preda.

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Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

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