Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

L'obiettivo generale di questo esperimento è testare l'effetto dell'ablazione laser di alcuni neuroni sull'attività e sul comportamento del circuito. Con questa tecnica sperimentale possiamo esaminare la necessità dei neuroni in un circuito alla base del comportamento. Questo metodo può aiutare a rispondere alle nostre domande chiave nel campo del comportamento e delle neuroscienze, come ad esempio come viene percepita la preda e come il comportamento catturato dalla preda viene generato dall'attività neurale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che i neuroni possono essere ablati in modo specifico grazie alla marcatura genetica di questi neuroni e anche all'alta risoluzione spaziale del laser. Dopo aver allevato le larve e averle montate in agarosio a basso punto di fusione al 2% secondo il protocollo di testo, posizionare le larve incorporate nell'agarosio sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni e avviare il sistema di microscopia. Aprire il software di acquisizione delle immagini e nella scheda laser fare clic sul pulsante di accensione per accendere il laser.

Attendere che lo stato del laser passi da occupato a modalità bloccato. Nella scheda dei canali, impostare la lunghezza d'onda del laser su 880 nanometri per l'ablazione EGFP o 800 nanometri per l'ablazione GCaMP. Selezionare l'obiettivo soggettivo 20X spostando manualmente il revolver dell'obiettivo.

Quindi, fare clic sulla scheda di localizzazione, fare clic su GFP per modificare i percorsi ottici e visualizzare direttamente la fluorescenza a occhio. Centrare il cervello larvale del pesce zebra nel campo visivo, quindi fare clic sulla scheda di acquisizione per tornare alla microscopia a due fotoni e impostare la potenza e il guadagno del laser. Come registrazione della condizione prima dell'ablazione, fare clic su Z stack per selezionare l'opzione Z stack.

Quindi, dopo esserti concentrato sull'estremità ventrale del cervello larvale, fai clic sul pulsante Imposta prima per impostare il limite inferiore e dopo esserti concentrato sulla superficie più dorsale del cervello, fai clic sul pulsante Imposta ultima per impostare il limite superiore. Infine, fai clic sul pulsante di avvio dell'esperimento per eseguire l'acquisizione dell'immagine dello stack Z. Quindi, seleziona l'obiettivo soggettivo 63X spostando manualmente il revolver dell'obiettivo.

Quindi, fare clic sulla scheda Individua per passare alla microscopia a epifluorescenza. Centrare le cellule da ablare a occhio, quindi fare clic sulla scheda di acquisizione per tornare alla microscopia a scansione laser. Nella scheda della modalità di acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 256 x 256.

Clicca in diretta e osserva i neuroni di interesse. Quindi, partendo dal lato più dorsale si trova un piano focale in cui le cellule da ablare sono a fuoco. Utilizzando la funzione delle regioni, contrassegnare una piccola area circolare di circa 1/3 della dimensione della cellula in diametro su ciascun neurone come ROI.

Impostare la velocità di scansione su 13,9 secondi per 256 x 256 pixel, che corrisponde a un tempo di permanenza del laser di circa 200 microsecondi per pixel o 200 microsecondi per mezzo micron. Inoltre, imposta il ciclo di iterazione su quattro ripetizioni. Fare clic su avvia esperimento per eseguire le funzioni di serie temporale e sbiancamento.

Confrontare l'immagine prima dell'ablazione con l'immagine dopo l'ablazione nel ciclo delle serie temporali per garantire che la fluorescenza nelle cellule bersaglio sia scomparsa. Quindi, sposta il piano focale leggermente più in profondità e scegli il piano focale successivo in cui compaiono le cellule non ablate. Eseguire la funzione di sbiancamento come appena dimostrato e ripetere il processo fino a quando tutte le cellule della struttura neurale di interesse sono state ablate.

Dopo l'ablazione, controllare che le cellule non siano fluorescenti abbattute e, se necessario, ripetere l'irradiazione laser. Dopo l'irradiazione, le larve devono essere recuperate. Fai con cura piccoli tagli perpendicolari nell'agarosio attorno alle larve.

Quindi, attendi che il pesce nuoti fuori dall'agarosio da solo quando l'anestetico svanisce. Dopo aver coltivato i parameci e anestetizzato una larva di pesce zebra secondo il protocollo di testo, posizionare le larve in agarosio con punto di fusione basso al 2% e rimuovere immediatamente l'agarosio in eccesso in modo che la superficie dell'agarosio appaia leggermente convessa. Usando un ago da dissezione orientare rapidamente le larve in posizione verticale.

Quindi, usando un bisturi chirurgico, fai alcuni piccoli tagli nell'agarosio per rimuovere l'agarosio attorno alla testa del pesce zebra che fa spazio al paramecio per nuotare. Rimuovere con cautela l'agarosio residuo versando delicatamente l'acqua del sistema sulla camera. Quindi, metti un paramecio nella camera di registrazione per fungere da stimolo visivo.

Quindi posizionare la camera di registrazione sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CMOS scientifica e selezionare un obiettivo 2,5X. Avviare l'applicazione di acquisizione delle immagini per la fotocamera in dotazione. Fare clic sul riquadro della sequenza e selezionare il record del disco rigido nel riquadro.

Nella sezione delle impostazioni di scansione, impostare il numero di fotogrammi su 900 o qualsiasi altro numero di fotogrammi totale desiderato. Nel riquadro di acquisizione, impostare il tempo di esposizione a 30 millisecondi e il binning a due a due. Fare clic su Live nel riquadro di acquisizione per individuare le larve nella vista della telecamera e mettere a fuoco, quindi fare clic su Interrompi Live e fare clic sul pulsante di avvio.

Salva il filmato in formato cxd e analizza i dati secondo il protocollo di testo. Dopo aver impostato il sistema di registrazione comportamentale e aver posizionato una larva in una camera di registrazione secondo il protocollo di testo, utilizzare una micropipetta per raccogliere 50 parameci e posizionarli nella camera di registrazione. Per posizionare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore della camera di registrazione, mettere una piccola goccia d'acqua sul vetrino coprioggetto prima di posizionarlo sulla superficie dell'acqua della camera di registrazione per evitare di introdurre aria nella camera.

Posizionare la camera di registrazione nel sistema di illuminazione. Quindi, avvia la registrazione time lapse a 10 fotogrammi al secondo per 11 minuti. Infine, effettuare l'analisi secondo il protocollo del testo.

In questo esperimento con la linea Gal4 che marca i nuclei nell'area pretectale e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. I neuroni pretectali sono stati ablati con laser bilateralmente. I neuroni olfattivi sono stati ablati come controllo.

I risultati mostrano che il laser a due fotoni può ablare le cellule bersaglio lasciando inalterati i neuriti adiacenti. In questo esperimento è stata studiata la connettività funzionale dei neuroni pretectali che proiettano i loro assoni verso l'ILH per via omolaterale. Sia il pretectum che l'ILH hanno mostrato attività neuronale in presenza prossimale di preda, suggerendo che entrambe le attività neuronali sono guidate visivamente.

L'imaging del calcio è stato utilizzato anche per osservare l'attività neuronale nel pretectum e l'ILH nelle larve ablate con neuroni pretectali. Il pretectum sinistro che è stato ablato con laser ha mostrato un'attività neuronale residua o nulla. Inoltre, l'ILH omolaterale ha mostrato un'attività neuronale drammaticamente spostata, suggerendo che l'input principale per l'ILH proviene dal pretectum omolaterale.

Al contrario, l'ILH sull'altro lato del pretectum ablato con laser ha mostrato un'attività neuronale paragonabile all'attività neuronale nel pretectum omolaterale, il che suggerisce che l'ILH destro sta ricevendo input dal pretectum destro. Una volta padroneggiata, l'ablazione laser può essere eseguita in circa un'ora per ogni larva di pesce zebra. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di ablare solo i neuroni bersaglio con un'adeguata irradiazione laser, evitando danni da calore da parte del laser.

Seguendo questa procedura, l'ablazione dei neuroni in altre aree cerebrali come il proencefalo o il rombencefalo può essere eseguita per rispondere a domande aggiuntive come il modo in cui questi neuroni sono coinvolti nelle funzioni cognitive o motorie. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze comportamentali per esplorare i circuiti neurali funzionali nei modelli di pesce zebra. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ablare specificamente i neuroni nel cervello delle larve di pesce zebra e valutarne le conseguenze funzionali e comportamentali.

Non dimenticare che lavorare con un laser può essere estremamente pericoloso e rispetta sempre le istruzioni del produttore durante l'esecuzione di questa procedura.