Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci per identificare l'effetto antitumorale e ottenere una migliore comprensione meccanicistica di nuove molecole utilizzando sistemi di coltura 3D in vitro e in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la varietà di effetti farmacologici dei composti in un modello in vivo più fisiologicamente rilevante. Per iniziare, piastrate 20.000 cellule A549 per centimetro quadrato in 15 millilitri di terreno di coltura cellulare RPMI 1640, integrati con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici, in un pallone da 75 centimetri quadrati.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Il giorno dell'esperimento, utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare. Raccogliere 50.000 cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri mediante centrifugazione a 400 g per sette minuti e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS sterile.

Utilizzando una multipipetta, erogare 1,1 millilitri di terreno semisolido a base di metilcellulosa, o MCBM, in provette, preparando una provetta per ciascuna condizione. Quindi, aggiungere 110 microlitri di FBS a ciascun tubo. Quindi, risparmia 1000 cellule per millilitro.

Quindi, pipettare 2,4 microlitri della soluzione di cella madre nelle provette di MCBM e FBS. Dopo aver aggiunto le celle, tenere le provette verticalmente e farle roteare alla massima velocità per un minuto per mescolare accuratamente l'MCBM e le cellule. Ora, aggiungere ai campioni il composto di prova OT48 da solo o in combinazione con A1210477.

Preparare una provetta separata come controllo per il solvente utilizzato, come il DMSO. Quindi, agitare i campioni per un minuto. Per ogni analisi, versare un millilitro della miscela nel pozzetto centrale di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.

Quindi, utilizzare un millilitro di acqua sterile o PBS per riempire i pozzetti vuoti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per 10 giorni. Quindi, aggiungere 200 microlitri di una soluzione madre MTT da cinque milligrammi per millilitro a ciascun pozzetto.

Dopo aver incubato le piastre per dieci minuti, verificare la presenza di colonie vitali che diventeranno viola. Utilizzando una lastra di sfondo bianca, acquisisci le immagini utilizzando le seguenti impostazioni:Per metodo, scegli digitalizza. Per Tipo di esposizione, scegliere precisione.

Per il tempo di esposizione, scegliere manuale e un secondo. Per la sensibilità e la risoluzione, scegliere l'alta risoluzione. Quindi, salvare le immagini acquisite in formato TIFF.

Con il software ImageJ, è possibile quantificare le colonie vitali selezionando il menu immagine, tipo, 8 bit. Selezionare il menu di regolazione e la soglia. Imposta la soglia da controllare e mantienila costante per tutte le condizioni.

Quindi, seleziona il menu analizza, analizza le particelle. Salva i dati e analizzali con un software statistico per la rappresentazione grafica. Dopo aver preparato i reagenti di riserva secondo il protocollo di testo, separare una femmina e un maschio di pesce zebra in una vasca divisoria riempita con acqua di rubinetto sterilizzata UV e filtrata a 28,5 gradi Celsius e metterli al buio.

Dopo 24 ore dalla separazione, rimuovere la partizione per avviare l'accoppiamento. Trasferire le uova fecondate dalla vasca di accoppiamento in una capsula di Petri contenente cinque millilitri di soluzione fresca di Danios. Utilizzare cinque millilitri di soluzione Danios per lavare le uova tre volte utilizzando una pipetta per aspirare accuratamente le uova e trasferirle in cinque millilitri di soluzione fresca.

Quindi, incubare le uova a 28,5 gradi Celsius per otto ore. Passare alla soluzione di Danios contenente lo 0,03% di PTU per inibire la pigmentazione e selezionare gli ovuli opachi non fecondati per prevenire la contaminazione. 24 ore dopo la fecondazione, utilizzare una pinza affilata per decoionare gli embrioni.

Quindi, incubare gli embrioni in soluzione Danios con PTU fino a 48 ore dopo la fecondazione. Dopo aver seminato le cellule A549 e averle incubate con composti secondo il protocollo di testo, 24 ore prima della fine del trattamento, aggiungere quattro micromolari del colorante tracciatore di cellule fluorescenti, CM-Dil, per colorare le cellule e incubarle per due ore. Dopo l'incubazione, utilizzare lo 0,05% di tripsina-EDTA per tripsinizzare le cellule.

Quindi, diluire da dieci a un sesto di cellule in 50 microlitri di soluzione di rosso fenolo PBS prima dell'iniezione. Per eseguire la microiniezione di cellule tumorali, estrarre un capillare di vetro da 1,0 millimetri utilizzando le seguenti impostazioni del programma:Utilizzare una siringa per tagliare il capillare per produrre un bordo affilato. Quindi, caricare il microcapillare con 20 microlitri della soluzione di rosso fenolo cellulare.

Dopo aver anestetizzato il pesce zebra secondo il protocollo di testo, iniettare da 100 a 200 cellule nel sacco vitellino iniettando da sei a dieci nanolitri tramite tre o cinque iniezioni. Le microiniezioni devono essere eseguite con molta attenzione e precisione per garantire che venga iniettato il volume corretto delle cellule e che il danno da iniezione sia minimo e che la pressione dell'anidride carbonica sia ottimale per evitare una fessura laterale. Dopo l'iniezione, lasciare che il pesce si riprenda per dieci-30 minuti in cinque millilitri di soluzione fresca di Danios contenente PTU.

Trasferire il pesce in piastre a 24 pozzetti con un millilitro di soluzione di Danios PTU e incubarlo a 28,5 gradi Celsius per 72 ore. Dopo l'incubazione, dopo aver anestetizzato i pesci secondo il protocollo di testo, immobilizzarli su un vetrino con una goccia di metilcellulosa al 3%. Scatta immagini fluorescenti 5x a una lunghezza d'onda compresa tra 620 e 750 nanometri.

Utilizza il software ImageJ per quantificare le dimensioni dei tumori a fluorescenza selezionando analizza e misura. Quindi, salva i valori di fluorescenza e analizzali con un software di statistica per la rappresentazione grafica. In questo esperimento, la linea cellulare di cancro del polmone A549 è stata seminata in MCBM per formare colonie dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico, A1210477, alla concentrazione osservata qui.

I risultati hanno mostrato che la combinazione ha ridotto significativamente il numero, le dimensioni e la superficie totale delle colonie dopo dieci giorni di incubazione. Qui, dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico, A1210477, le cellule sono state lasciate formare sferoidi utilizzando la tecnica della piastra con fondo a U. Dopo un'incubazione di tre giorni, gli sferoidi sono stati ripresi e quantificati e sono state generate immagini 3D.

Questa figura illustra il potenziale inibitorio di OT48 e/o A1210477 sulla formazione del tumore dalla quantificazione dei tumori fluorescenti generati quando le cellule trattate sono state iniettate nel sacco vitellino di pesce zebra. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il numero di pesci per ogni condizione intorno a dieci o più per evitare variazioni importanti che influenzano la valutazione statistica dei dati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi istologica, al fine di valutare l'espressione della proteina bersaglio nello xenotrapianto di zebrafish.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci per esplorare l'efficacia dei composti in un microambiente in vivo nello xenotrapianto di pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come convalidare l'efficacia dei farmaci in un ambiente di coltura 3D.