Name: Valutazione preclinica della bioattività dellOT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri la valutazione preclinica di cumarine anticancro con colture 3D e xenotrapianti in Danio rerio. Questo metodo combina sferoidi e saggi di colonie per studiare l'efficacia dei farmaci in vivo.

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Ricerca presso SNU è sostenuta da Fondazione nazionale per la ricerca (NRF) MEST di Corea per concessione di tumore microambiente Global Core Research Center (GCRC), [numero di grant 2011-0030001]; da la Seoul National University Research Grant e dal cervello Corea (BK21) oltre a programma.

1. colony formazione Assays
<ol><li>Cellulari cellule A549 cultura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 a 15 mL di RPMI1640 cultura supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% antibiotici in un pallone da2 cm 75 in incubatore a CO2 a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro. Raccogliere 50.000 cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 7 min in una microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere le cellule in 100 µ l di 1 x sterile PBS (Phosphate Buffered Saline) in provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Dispensare 1,1 mL di mezzo di metilcellulosa-base semi-solido (MCBM) in provette da 15 mL con un multipipette. Preparare una provetta per ogni condizione.</li>
	<li>Aggiungere 110 µ l di FBS a 1,1 mL di MCBM utilizzando una micropipetta P200.</li>
	<li>Cellule di semi a 1.000 cellule/mL. Raccogliere 2,4 µ l di sospensione cellulare dalla soluzione stock (50.000 cellule in 100 µ l di PBS 1X) utilizzando una micropipetta P2 e aggiungere a 1,1 mL di MCBM supplementato con 10% FBS.</li>
	<li>Dopo aver aggiunto le cellule, vortex le provette per 1 min, tenendoli verticalmente alla massima velocità per mescolare bene MCBM e cellule.</li>
	<li>Aggiungere sostanze da testare (OT48 da solo o in combinazione con A1210477). Preparare un tubo separato come un controllo per il solvente usato (qui il solfossido dimetilico (DMSO)). A seconda della concentrazione dei composti e il volume aggiunto per ogni condizione, il controllo solvente includerà la più alta concentrazione di solvente utilizzato per le diluizioni del composto, test per valutare gli effetti negativi causati da parte del solvente.</li>
	<li>Tubi di vortice per 1 minuto.</li>
	<li>Per ogni dosaggio, aggiungere 1 mL della miscela con una micropipetta P1000 al centro anche di una piastra di coltura delle cellule 12-pozzetti.</li>
	<li>Riempire i pozzetti vuoti con 1 mL di acqua sterile o 1X PBS per stabilizzare l'umidità.</li>
	<li>Incubare le piastre di coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 10 giorni di incubazione, aggiungere 200 µ l di una soluzione di riserva (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromuro) MTT (5 mg/mL) ad ogni pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL.</li>
	<li>Incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Colonie vitali diventerà viola.</li>
	<li>Acquisire l'immagine utilizzando una fotocamera digitale mediante la piastra di fondo bianco (vassoio di bianco dia LAS). Utilizzare le seguenti impostazioni: metodo, digitalizzare; Tipo di esposizione, precisione; Tempo di esposizione, manuale, 1 secondo; Sensibilità/risoluzione, alta risoluzione. Salvare l'immagine in formato tiff.</li>
	<li>Quantificare le colonie vitali utilizzando software ImageJ. Selezionare il menu "immagine | Tipo | 8 bit". Selezionare il menu "regolare | Soglia". Imposta la soglia per controllare e mantenere costante per tutte le condizioni; Selezionare il menu "Analyze | Analizzare le particelle". Salvare i dati e analizzare con un software di statistiche per la rappresentazione grafica.</li>
</ol>2. analisi di formazione sferoide
<ol><li>Cellule A549 di coltura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 in boccette2 75cm con 15 mL di RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 1% antibiotici.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, preparare un 96 ben piastra di fondo U.</li>
	<li>Piastra di 10.000 cellule in un pozzo che contiene già il composto di interesse (qui 50 µM di OT48) e/o 20 µM di A1210477. Regolare il volume finale di 100 µ l di terreno di coltura cellulare. Il numero di cellule che formano sferoidi uniforme con un contorno esterno intatto è ritenuto sufficiente per sferoidi di forma.</li>
	<li>Incubare per 3 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 3 giorni di incubazione, acquisire immagini di sferoidi utilizzando un microscopio con ingrandimento 4x.</li>
</ol>3. Zebrafish Xenograft Assay
Nota: Questo approccio tecnico è visualizzato come uno schema (Figura 1).
<ol><li>
Preparazione dei reagenti stock
	<ol>
<li>Preparare 1 L di soluzione di Danieau: 30x: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12mm MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2e 150 mM HEPES. Regolare il pH del buffer a 7.6 utilizzando un pH-metro.</li>
		<li>Preparare la soluzione di tricaina 1% (50x): sciogliere 20 mg di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaina) in 2 mL di acqua distillata.</li>
		<li>Preparare la soluzione di 1% di rosso fenolo-PBS: aggiungere 2 µ l di soluzione di sale di sodio fenolo rosso a 198 µ l di soluzione di PBS sterilizzati in un tubo di 1,5 µ l.</li>
		<li>Preparare 3% metilcellulosa: aggiungere 3 g di metilcellulosa a 100 mL di soluzione di Danieau 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione e la produzione di uova di pesce zebra
	<ol>
<li>Separare uno femminile e uno maschile zebrafish in un serbatoio di partizione riempito con acqua di rubinetto filtrata e sterilizzata UV a 28,5 ° C al buio. Dopo 24 h di separazione, mescolare pesce di entrambi i sessi per iniziare l'accoppiamento. Trasferire uova fecondate dal serbatoio dell'accoppiamento di una piastra Petri contenente 5 mL di soluzione di Danieau fresco.</li>
		<li>Lavare le uova tre volte con 5 mL di soluzione di Danieau. Per il lavaggio, aspirare accuratamente le uova con una pipetta e trasferimento a 5 mL di soluzione fresca. Incubare per 8 h a 28,5 ° C.<ol>
<li>Dopo 8 h di incubazione in soluzione di Danieau, cambiare per la soluzione di Danieau contenente 0.03% 1-fenil-2-tiourea (PTU) per inibire la pigmentazione. Ordinare uova opache (non fecondate o contenenti embrioni non sviluppati) per prevenire la contaminazione.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embrione dechorionation
	<ol>
<li>24h post fertilizzazione (hpf), embrioni di zebrafish dechorionate usando pinze taglienti. Incubare gli embrioni di schiusa in soluzione di Danieau con 0,03% PTU a 28,5 ° C fino a 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule trattate composto
	<ol>
<li>Cellule A549 seme a 20.000 cellule/cm2 in matracci di cultura di 25 cm2 . Dopo 24 h di semina, aggiungere composti (qui OT48 a 50 µM ed e/o A1210477 a 20 µM) per 24 h in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Impostare il tempo di trattamento per ogni composto per mantenere la vitalità delle cellule ma di commetterle verso la morte delle cellule. Stavolta punto deve essere impostato individualmente sulla base attuabilità delle cellule, morfologia e marcatori molecolari.</li>
		<li>2 h prima della fine del trattamento, cellule di macchia con 4 µM di tracker cellulare fluorescente tingono CM-Dil a 37 ° C e 5% CO2. Dopo 2 h di incubazione, tripsinizzano cellule con tripsina-EDTA 0,05% e diluire 106 cellule in 50 µ l di soluzione di rosso fenolo-PBS prima dell'iniezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micro-iniezione delle cellule tumorali per la formazione dello xenotrapianto
	<ol>
<li>Anestetizzare zebrafish in una soluzione di tricaina 0,02% per 5 minuti fino a quando essi stabilirsi su una piastra di agar.</li>
		<li>Tirare un 1.0 mm (all'esterno di vetro di diametro (OD) capillare) di un estrattore micropipetta (le impostazioni del programma: p: 300, calore: 260, tirare: 60, VEL: 50 e tempo: 200). Tagliare il microcapillary con una siringa per produrre un bordo tagliente. Caricare microcapillari con 20 µ l di cella/fenolo rosso-soluzione PBS. Impostare la pressione di iniezione e ora per erogare 2 nL per iniezione.</li>
		<li>Iniettare 100 – 200 cellule il sacco vitellino di iniezione da 6 a 10 nL tramite iniezioni di 3 a 5. Dopo l'iniezione, consentire pesce recuperare per 10 a 30 min in 5 mL di soluzione di Danieau fresco contenente soluzione di PTU. Spedizione pesce in piastre da 24 pozzetti con 1 mL di soluzione di Danieau contenente soluzione di PTU sono e incubare per 72 h a 28,5 ° C.</li>
		<li>Dopo 72 h di incubazione, anestetizzare il pesce in una soluzione di tricaina 0.02% e immobilizzare su un vetrino con un calo del 3% metilcellulosa. 5 x fotografare da microscopia di fluorescenza alla lunghezza d'onda di 620 a 750 nm.</li>
		<li>Quantificare la dimensione dei tumori fluorescente da software ImageJ. Selezionare il menu "Analyze | Misura". Salvare i valori corrispondenti per il segnale fluorescente e analizzare con un software di statistiche per la rappresentazione grafica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I tassi di formazione della Colonia ottenuti con MCBM dipende dal tipo delle cellule. Di solito, per cellule non aderenti, il numero di colonie è molto superiore rispetto a cellule aderenti. Abbiamo osservato che le cellule A549 formano colonie di 30 a 40 dopo 10 giorni. Precedentemente abbiamo segnalato per le cellule di leucemia differenti che il numero di colonie è compreso tra 200-2509. I nostri risultati hanno mostrato che OT48 da solo non ha prodotto una diminuzione significativa del numero ...

Il cancro è causato da mutazioni cellulari e di conseguenza pathway biochimici sono interrotti innescando la divisione cellulare incontrollata e resistenza alla morte cellulare. I tumori interferiscano con funzioni fisiologiche dell'apparato digerente, nervoso, circolatorio e successivamente vicini tessuti1. Nonostante gli sforzi di ricerche approfondite, il cancro rimane la malattia pericolosa più diffusa nel mondo2. Medicina di precisione è stato riconosciuto come il fondamento della terapeutica del cancro futuro. Nuove entità molecolari sono testate regolarmente in combinazione con farmaci già esistenti per migliorare il risultato clinico.
Tuttavia, uno dei limiti significativi connessi con lo sviluppo di nuove terapie mirate efficiente è il fallimento di analisi comunemente usati per simulare il risultato biologico esatto della droga dell'esposizione3. Scoperta della droga di cancro ancora in gran parte si basa su test l'efficacia degli agenti terapeutici in linee cellulari tumorali coltivate in colture monostrato 2D, che sono difficili da convalidare in studi clinici4. Di conseguenza, c'è un crescente interesse a sviluppare modelli migliori di cancro che meglio simulano le funzionalità native di tumori in vivo5. Negli ultimi anni, un crescente interesse nei modelli 3D cultura ha provocato lo sviluppo di metodologie di miglioramento per produrre tumore 3D modelli5.
Qui, presentiamo un approccio con tre tecniche di coltura differenti delle cellule 3D che permette di migliorare la comprensione della potenza di hydroxycoumarin OT486 in combinazione con BH3 mimetics prima più in profondità in vivo saggi. Il nostro metodo consiste di combinazione di Colonia e SFAs con un in vivo del tumore formazione test basato su un modello di zebrafish ulteriormente convalidare l'efficacia della combinazione di OT48 e BH3 mimetici in cellule di cancro del polmone e monitorare la progressione del cancro in una vita organismo.
Saggi di formazione di Colonia sono abitualmente utilizzati per valutare l'efficacia di farmaci antitumorali per i tumori sia solidi, nonché ematopoietici. Il test determina la capacità di una cellula a proliferare indefinitamente e formano colonie7. L'effetto di un agente anticancro sulla capacità delle cellule di formazione di colonie è determinata dalla diminuzione del numero e/o dimensioni delle colonie.
Sferoidi rappresentano modelli di tumore in vitro e servono come una piattaforma di screening a basso costo per agenti anticancro. Sferoidi sono aggregati di cellule che crescono in sospensione o incorporati in una matrice 3D. Questo approccio è ampiamente usato per lo screening di stupefacenti e gli studi di tumore crescita, proliferazione e immunitario interazione8.
Per comprendere appieno le proprietà di un nuovo farmaco, è essenziale per condurre esperimenti in vivo su roditori. Tuttavia, questo metodo convenzionale è costoso e richiede tempo. Negli ultimi anni, zebrafish (Danio rerio) è diventato un organismo laboratorio ampiamente studiati che è più economico e più veloce per aumentare. Tumori si sono sviluppati nell'approccio di coltura cellulare di zebrafish rappresentano un 3D, ma all'interno della regolazione in vivo di un vertebrato9.
Complessivamente, usiamo qui tre approcci diversi cultura 3D tra cui CFAs, SFAs e formazione di zebrafish in vivo del tumore per dimostrare la capacità anticancro di hydroxycoumarin OT48 in un modello cellulare di cancro delle cellule A549 polmone in combinazione con BH3 mimetici.

<table><tbody><tr><td>Materiali necessari per i saggi di formazione delle colonie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 gradi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS soluzione</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 ml</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>Provetta da 15 ml</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Bromuro di Tetrazolio Blu Tiazolico (polvere MTT)</td> <td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Materiali necessari per il test di formazione degli sferoidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 gradi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS soluzione</td><td>Hyclone</td><td>SH30256,02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra basso attachemnt 96 pozzetti</td><td>piastra Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopia</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Materiali necessari per xenotrapianti di zebrafish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 gradi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 ml</td><td></td><td>Extragene Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>Soluzione PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Nitrato di calcio tetraidrato (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td>HEPES Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Etil 3-amminobenzoato metanosolfonato (Tricaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Soluzione di fenolo rosso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil colorante</td><td>Invitrogen</td> <td>C7001-20 C&deg;</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Strumento otturatore, USA</td><td>Iniettore P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro</td><td>World Precision Instruments</td><td>Siringa PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td></td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td></td></tr><tr><td>RT Micro caricatore</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

valutazione preclinica della bioattività dell'ot48 di cumarina anticancro di sferoidi, colony assays formazione e xenotrapianti di zebrafish

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Lo screening pre-clinico in vitro e in vivo di nuovi agenti terapeutici sono uno strumento essenziale nella scoperta della droga di cancro. Anche se linee cellulari tumorali umane rispondono ai composti terapeutici nelle colture delle cellule dello strato monomolecolare (dimensionali) 2D, 3D cultura sistemi sono stati sviluppati per comprendere l'efficacia delle droghe nei modelli più fisiologicamente rilevanti. Negli ultimi anni, un cambiamento di paradigma è stata osservata in ricerca pre-clinica per convalidare la potenza di nuove molecole in sistemi di coltura 3D, più precisamente che imita il microambiente tumorale. Questi sistemi caratterizzano lo stato di malattia in un modo più fisiologicamente rilevante e aiutano ad per acquisire meglio meccanicistico conoscenza e la comprensione della potenza farmacologica di una data molecola. Inoltre, con l'attuale tendenza al miglioramento in vivo modelli del cancro, zebrafish è emerso come un importante modello di vertebrati di valutare in vivo la formazione del tumore e di studiare l'effetto degli agenti terapeutici. Qui, abbiamo studiato l'efficacia terapeutica di hydroxycoumarin OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetics nella linea cellulare di cancro del polmone delle cellule A549 utilizzando tre sistemi differenti della coltura 3D tra cui saggi di formazione di Colonia (CFA), analisi di formazione della sferoide (SFA) e in vivo gli xenotrapianti zebrafish.

Nella Figura 2, il cancro del polmone delle cellule linea A549 è stato seminato in MCBM di formare le colonie dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico A1210477 alle concentrazioni indicate. I risultati hanno mostrato che la combinazione significativamente ridotto numero, dimensione e superficie totale delle colonie dopo 10 giorni di incubazione.
Nella <strong class="xf...

Qui, presentiamo lo screening preclinico di cumarine anticancro utilizzando zebrafish e cultura 3D.

Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci per identificare l'effetto antitumorale e ottenere una migliore comprensione meccanicistica di nuove molecole utilizzando sistemi di coltura 3D in vitro e in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la varietà di effetti farmacologici dei composti in un modello in vivo più fisiologicamente rilevante. Per iniziare, piastrate 20.000 cellule A549 per centimetro quadrato in 15 millilitri di terreno di coltura cellulare RPMI 1640, integrati con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici, in un pallone da 75 centimetri quadrati.Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Il giorno dell'esperimento, utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare. Raccogliere 50.000 cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri mediante centrifugazione a 400 g per sette minuti e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS sterile.Utilizzando una multipipetta, erogare 1,1 millilitri di terreno semisolido a base di metilcellulosa, o MCBM, in provette, preparando una provetta per ciascuna condizione. Quindi, aggiungere 110 microlitri di FBS a ciascun tubo. Quindi, risparmia 1000 cellule per millilitro.Quindi, pipettare 2,4 microlitri della soluzione di cella madre nelle provette di MCBM e FBS. Dopo aver aggiunto le celle, tenere le provette verticalmente e farle roteare alla massima velocità per un minuto per mescolare accuratamente l'MCBM e le cellule. Ora, aggiungere ai campioni il composto di prova OT48 da solo o in combinazione con A1210477.Preparare una provetta separata come controllo per il solvente utilizzato, come il DMSO. Quindi, agitare i campioni per un minuto. Per ogni analisi, versare un millilitro della miscela nel pozzetto centrale di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.Quindi, utilizzare un millilitro di acqua sterile o PBS per riempire i pozzetti vuoti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per 10 giorni. Quindi, aggiungere 200 microlitri di una soluzione madre MTT da cinque milligrammi per millilitro a ciascun pozzetto.Dopo aver incubato le piastre per dieci minuti, verificare la presenza di colonie vitali che diventeranno viola. Utilizzando una lastra di sfondo bianca, acquisisci le immagini utilizzando le seguenti impostazioni:Per metodo, scegli digitalizza. Per Tipo di esposizione, scegliere precisione.Per il tempo di esposizione, scegliere manuale e un secondo. Per la sensibilità e la risoluzione, scegliere l'alta risoluzione. Quindi, salvare le immagini acquisite in formato TIFF.Con il software ImageJ, è possibile quantificare le colonie vitali selezionando il menu immagine, tipo, 8 bit. Selezionare il menu di regolazione e la soglia. Imposta la soglia da controllare e mantienila costante per tutte le condizioni.Quindi, seleziona il menu analizza, analizza le particelle. Salva i dati e analizzali con un software statistico per la rappresentazione grafica. Dopo aver preparato i reagenti di riserva secondo il protocollo di testo, separare una femmina e un maschio di pesce zebra in una vasca divisoria riempita con acqua di rubinetto sterilizzata UV e filtrata a 28,5 gradi Celsius e metterli al buio.Dopo 24 ore dalla separazione, rimuovere la partizione per avviare l'accoppiamento. Trasferire le uova fecondate dalla vasca di accoppiamento in una capsula di Petri contenente cinque millilitri di soluzione fresca di Danios. Utilizzare cinque millilitri di soluzione Danios per lavare le uova tre volte utilizzando una pipetta per aspirare accuratamente le uova e trasferirle in cinque millilitri di soluzione fresca.Quindi, incubare le uova a 28,5 gradi Celsius per otto ore. Passare alla soluzione di Danios contenente lo 0,03% di PTU per inibire la pigmentazione e selezionare gli ovuli opachi non fecondati per prevenire la contaminazione. 24 ore dopo la fecondazione, utilizzare una pinza affilata per decoionare gli embrioni.Quindi, incubare gli embrioni in soluzione Danios con PTU fino a 48 ore dopo la fecondazione. Dopo aver seminato le cellule A549 e averle incubate con composti secondo il protocollo di testo, 24 ore prima della fine del trattamento, aggiungere quattro micromolari del colorante tracciatore di cellule fluorescenti, CM-Dil, per colorare le cellule e incubarle per due ore. Dopo l'incubazione, utilizzare lo 0,05% di tripsina-EDTA per tripsinizzare le cellule.Quindi, diluire da dieci a un sesto di cellule in 50 microlitri di soluzione di rosso fenolo PBS prima dell'iniezione. Per eseguire la microiniezione di cellule tumorali, estrarre un capillare di vetro da 1,0 millimetri utilizzando le seguenti impostazioni del programma:Utilizzare una siringa per tagliare il capillare per produrre un bordo affilato. Quindi, caricare il microcapillare con 20 microlitri della soluzione di rosso fenolo cellulare.Dopo aver anestetizzato il pesce zebra secondo il protocollo di testo, iniettare da 100 a 200 cellule nel sacco vitellino iniettando da sei a dieci nanolitri tramite tre o cinque iniezioni. Le microiniezioni devono essere eseguite con molta attenzione e precisione per garantire che venga iniettato il volume corretto delle cellule e che il danno da iniezione sia minimo e che la pressione dell'anidride carbonica sia ottimale per evitare una fessura laterale. Dopo l'iniezione, lasciare che il pesce si riprenda per dieci-30 minuti in cinque millilitri di soluzione fresca di Danios contenente PTU.Trasferire il pesce in piastre a 24 pozzetti con un millilitro di soluzione di Danios PTU e incubarlo a 28,5 gradi Celsius per 72 ore. Dopo l'incubazione, dopo aver anestetizzato i pesci secondo il protocollo di testo, immobilizzarli su un vetrino con una goccia di metilcellulosa al 3%. Scatta immagini fluorescenti 5x a una lunghezza d'onda compresa tra 620 e 750 nanometri.Utilizza il software ImageJ per quantificare le dimensioni dei tumori a fluorescenza selezionando analizza e misura. Quindi, salva i valori di fluorescenza e analizzali con un software di statistica per la rappresentazione grafica. In questo esperimento, la linea cellulare di cancro del polmone A549 è stata seminata in MCBM per formare colonie dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico, A1210477, alla concentrazione osservata qui.I risultati hanno mostrato che la combinazione ha ridotto significativamente il numero, le dimensioni e la superficie totale delle colonie dopo dieci giorni di incubazione. Qui, dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico, A1210477, le cellule sono state lasciate formare sferoidi utilizzando la tecnica della piastra con fondo a U. Dopo un'incubazione di tre giorni, gli sferoidi sono stati ripresi e quantificati e sono state generate immagini 3D.Questa figura illustra il potenziale inibitorio di OT48 e/o A1210477 sulla formazione del tumore dalla quantificazione dei tumori fluorescenti generati quando le cellule trattate sono state iniettate nel sacco vitellino di pesce zebra. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il numero di pesci per ogni condizione intorno a dieci o più per evitare variazioni importanti che influenzano la valutazione statistica dei dati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi istologica, al fine di valutare l'espressione della proteina bersaglio nello xenotrapianto di zebrafish.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci per esplorare l'efficacia dei composti in un microambiente in vivo nello xenotrapianto di pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come convalidare l'efficacia dei farmaci in un ambiente di coltura 3D.

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