Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

Nel complesso, questa procedura consiste nel generare sferoidi di cellule nasali umane che possono essere utilizzati come test per studi funzionali di CFTR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fibrosi cistica, come la valutazione della risposta di un singolo soggetto ai farmaci che alterano il CFTR in un sistema modello ex vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di sferoidi viene generato in un lasso di tempo relativamente veloce da un piccolo campione di cellule nasali, consentendo test approfonditi.

A dimostrare la procedura saranno Lauren Strecker e Jessica Moncivaiz, tecnici del mio laboratorio. Dopo aver elaborato ed espanso le cellule epiteliali nasali umane o HNE su fibroblasti alimentatori secondo il protocollo di testo, portare il terreno di espansione precedentemente preparato, il terreno di differenziazione, la soluzione di tripsina EDTA allo 0,1% e il PBS sterile a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi utilizzare il 70% di etanolo per pulire i contenitori e trasferirli in una cappa di biosicurezza pulita.

Nella cabina di biosicurezza, utilizzare una pipetta Pasteur collegata a una linea del vuoto per aspirare e scartare il terreno dalla coltura HNE. Quindi, con una pipetta sierologica pulita, utilizzare cinque millilitri di PBS per lavare il piatto aggiungendo, agitando e aspirando il tampone. Aggiungere cinque millilitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,1% alla coltura e rimetterla nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per cinque minuti.

Quindi, al microscopio invertito a 4-10X, verificare che le cellule si stacchino dal piatto, diventino rotonde e galleggino. Picchiettare delicatamente il lato della piastra di coltura per rimuovere le cellule e, se necessario, incubare nuovamente la piastra per altri cinque minuti fino a quando la maggior parte delle cellule non si è staccata. Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, aggiungere cinque millilitri di terreno di dilatazione alla piastra e raccogliere tutto il liquido in una provetta conica sterile da 50 millilitri etichettata.

Se le cellule rimangono aderenti alla piastra di coltura dopo tre cicli di tripsinizzazione, utilizzare un raschietto cellulare sterile per rilasciare delicatamente le cellule rimanenti e con cinque millilitri di terreno di espansione, lavare il raschietto e la piastra e raccogliere il contenuto nella stessa provetta conica etichettata. Centrifugare la provetta a 360 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il surnatante e utilizzare un millilitro di mezzo di espansione per risospendere il pellet cellulare.

Quindi utilizzare un emocitometro per contare le cellule. Scongelare la matrice della membrana basale sul ghiaccio secondo le istruzioni del produttore. Separare un numero appropriato di celle di passaggio tripsinizzate in modo differenziale per una concentrazione finale di 500.000 cellule per millilitro di matrice.

Per una piastra a quattro pozzetti, utilizzare 200.000 cellule e raccoglierle in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare la miscela di cellule a non più di 360 volte g per cinque minuti. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, aspirare completamente e accuratamente e scartare il terreno, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.

Tenere il tubo di cellule sul ghiaccio quando non lo si maneggia attivamente. Utilizzare un puntale per pipetta da un millilitro per aggiungere 100 microlitri della matrice della membrana basale per pozzetto pianificato alle cellule. Senza svuotare completamente il puntale della pipetta per evitare l'introduzione di bolle d'aria, pipettare su e giù per risospendere accuratamente e accuratamente le cellule.

Muoversi rapidamente per evitare la solidificazione della matrice. Per seminare aliquote di matrice da 100 millilitri in ciascun pozzetto di una piastra di coltura per fecondazione in vitro a quattro pozzetti, utilizzare un paio di forbici pulite per tagliare i tre o quattro millimetri distali da un puntale di pipetta da 200 microlitri. Pipettare con cura e lentamente una goccia da 100 microlitri di miscela di matrice cellulare al centro di ciascun pozzetto, assicurandosi che la goccia rimanga sferica e non tocchi i lati del pozzetto.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti fino a quando non si solidifica. Quindi pipettare con cura 500 microlitri di terreno di differenziazione in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non disturbare la goccia della matrice. Assicurati che il mezzo copra appena la goccia e aggiungine altro se necessario.

Per coltivare gli sferoidi HNE, utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro, aspirare delicatamente tutto il terreno dal pozzetto evitando la matrice che distruggerà gli sferoidi. Quindi, con un puntale di pipetta fresco da un millilitro ed evitando di toccare o disturbare la matrice, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno di differenziazione al pozzetto intorno alla matrice. Continuare a incubare gli sferoidi, sostituendo il terreno di differenziazione tre volte alla settimana, come appena dimostrato.

Sotto un microscopio invertito con ingrandimento 20X, valutare quotidianamente la morfologia degli sferoidi. Gli sferoidi dovrebbero formarsi entro tre-cinque giorni dalla placcatura e raggiungere la maturità entro circa 10 giorni. Gli HNE dovrebbero attaccarsi al piatto di coltura e formare piccole isole entro 72 ore dalla semina.

Esempi di buona e cattiva formazione di isole in una settimana sono mostrati qui. Le isole dovrebbero espandersi fino a coprire il piatto nel corso di 15-30 giorni. Entro i primi tre o quattro giorni di coltura, piccole strutture cistiche dovrebbero iniziare a formarsi nella matrice e maturare in circa 10 giorni.

Se piastrate alla densità descritta, le colture di successo conterranno da 50 a 100 sferoidi per goccia di matrice. I lumi possono essere relativamente chiari come nel CFTR wild-type o riempiti di detriti cellulari e muco come negli sferoidi CF. La mascheratura per delineare l'area luminale degli sferoidi è dimostrata in questi due pannelli.

Qui sono mostrati esempi di colture di sferoidi mal formate e non riuscite. Come illustrato in questi grafici da saggi funzionali, gli sferoidi di soggetti con CFTR wild-type dovrebbero gonfiarsi per oltre un'ora quando stimolati e dovrebbero gonfiarsi meno o ridursi se stimolati in presenza dell'inibitore CFTR inh-172. Gli sferoidi di un soggetto omozigote per F508del-CFTR dovrebbero ridursi o gonfiarsi molto leggermente con un aumento del gonfiore o un minore restringimento quando farmacologicamente corretti con i modulatori CFTR VX809 e VX770.

Una volta padroneggiata, la semina degli sferoidi delle cellule nasali può essere eseguita in 15-20 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere pulite le procedure operative all'interno della cabina di biosicurezza per ridurre al minimo il rischio di contaminazione del campione ed evitare qualsiasi rischio per la propria salute. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la fissazione, la colorazione e la microscopia per rispondere a ulteriori domande sulla morfologia e la composizione cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare sferoidi di cellule nasali umane primarie che possono essere utilizzati come test personalizzato della funzione CFTR. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani primari può essere pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso corretto dei dispositivi di protezione individuale.