Name: Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara a generare sferoidi di cellule epiteliali nasali umane per studiare la funzione CFTR nella fibrosi cistica. Questo metodo permette test personalizzati di farmaci modulatori CFTR in un modello ex vivo.

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Questo lavoro è stato supportato da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, grant numero CLANCY14XX0 e attraverso la Fondazione fibrosi cistica, concedere il numero CLANCY15R0. Gli autori desiderano ringraziare Kristina Ray per la sua assistenza nel reclutamento dei pazienti e la vigilanza regolamentare. Gli autori desiderano anche ringraziare il gruppo di lavoro di HNE, sostenuto dalla Fondazione fibrosi cistica, che ha assistito nella generazione di funzionalità di HNE cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Marty Solomon e Katherine Tuggle.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive la generazione di colture di sferoide paziente-derivato nasale cellulari in grado di produrre un modello individualizzato, specifico della funzione CFTR. Ci sono diversi passaggi chiave nel processo che dovrebbe essere frequentato molto attentamente per evitare difficoltà. In primo luogo è un'acquisizione di buon campione dal naso del paziente. Dovrebbe avere un buon campione > 50.000 cellule, limitato muco/detriti ed essere pronti per l'elaborazione all'interno di 4 h (anche se il successo è a...

La fibrosi cistica (CF) è una malattia fatale, autosomica recessiva riguardano oltre 70.000 persone in tutto il mondo1. Questa malattia genetica di vita-riduzione è causata da mutazioni nella conduttanza del Transmembrane di fibrosi cistica regolatore della proteina (CFTR)2. CFTR è un membro della famiglia vassoio Trifosfato di adenosina-legante e funzioni come un canale ionico che permette il movimento del cloruro e bicarbonato attraverso le membrane apicali di epiteli polarizzati multiple compreso il tratto gastrointestinale, della ghiandola di sudore, respiratorio e albero, tra gli altri3,4. Come tale, disfunzionale CFTR conduce alla disfunzione epiteliale multisistemica, con maggior mortalità derivante dalla malattia respiratoria1. Nel polmone CF, perdita di CFTR-driven delle vie respiratorie superficie liquida (ASL) regolamento e muco rilascio porta a muco ispessito, ostruzione delle vie respiratorie, infezione cronica e rimodellamento delle vie respiratorie progressiva e perdita di funzione polmonare1,5.
Nonostante l'identificazione della disfunzione CFTR come la causa della malattia, terapie in CF tradizionalmente focalizzato sulla mitigazione dei sintomi (ad esempio, la terapia sostitutiva enzimatica pancreatica, terapie di clearance delle vie aeree)1. Questo approccio è stato recentemente rivoluzionato dall'avvento di nuove terapie, definita "Modulatori CFTR," che incidono direttamente CFTR disfunzionale. Questo approccio ha spostato il paesaggio clinico da gestione dei sintomi a modificante la malattia cura ma comporta diverse limitazioni6,7,8,9,10. Attività di modulatore è specifico per il difetto di proteina che accompagna ogni mutazione CFTR e limitato a selezionare popolazioni genetiche11. Questa limitazione è guidata dalla natura eterogenea dei difetti di proteina, ma anche dall'impraticabilità delle sperimentazioni cliniche in gruppi di rara mutazione. Inoltre, fra gli oggetti con ben studiati genotipi (ad es., CFTR F508del/F508del, la più comune mutazione CFTR), c'è ampia variabilità nella malattia onere e modulatore risposta6,7,8 ,9,11.
Per risolvere entrambi i problemi, gli investigatori hanno proposto l'utilizzo di modelli personalizzati per test preclinici12. Questo concetto utilizza tessuto paziente-specifico per generare un sistema individualizzato ex vivo modello per test composto, predizione in vivo soggetto risposta alle terapie in modo personalizzato. Una volta convalidato, un tale modello potrebbe essere utilizzato dai clinici alla terapia di precisione di unità indipendentemente dal genotipo CFTR sottostante del paziente.
Cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) ottenute da espianto dei tessuti al momento del trapianto di polmone stabilito la possibilità di un tale modello per CF13,14. HBEs cresciuta a un'interfaccia aria-liquido (ALI) permettono per la quantificazione di CFTR funzionale direttamente attraverso la prova electrophysiologic o indirettamente attraverso misure di ASL omeostasi13,15. Questo modello è stato fondamentale per comprendere la biologia CFTR e fu un fattore chiave nello sviluppo di CFTR modulatori16. Purtroppo, i modelli HBE non sono tenable come un modello personalizzato a causa della invasività di acquisizione (trapianto di polmone o spazzolatura bronchiale) e la mancanza di campioni per quelli con mutazioni rare o malattia delicata. Viceversa, tessuto intestinale, ottenuto da campioni di biopsia rettale o duodenale, possa essere utilizzato per la misura di corrente intestinale (ICM) o un'analisi basata su gonfiore organoid allo studio individualizzato CFTR funzione17,18, 19. Organoid saggi, in particolare, sono molto sensibili modelli del CFTR attività20,21,22. Entrambi i modelli sono limitati dalla fonte di tessuto (tessuto intestinale, mentre la maggior parte delle patologia di malattia respiratoria) e il metodo semi-invasivo di acquisizione. In alternativa, parecchi ricercatori hanno studiato nasale cellule epiteliali umane di (HNE) al modello CFTR restauro23,24,25. HNEs possono essere raccolte in modo sicuro a pennello o il curettage in soggetti di qualsiasi età e, quando coltivate in ALI, ricapitolare molte caratteristiche del HBEs25,26,27,28. Colture monostrato HNE tradizionalmente sono stati limitati da trasformazione squamose e molto tempo a maturità29. Inoltre, riferito di cortocircuito misure di corrente in HNEs sono più piccole di quelle in HBEs, suggerendo una finestra più piccola per rilevare l'efficacia terapeutica25.
Data la necessità di un modello di coltura del tessuto personalizzato, non invadente, respiratorio della funzione CFTR, abbiamo cercato di unire la sensibilità di un dosaggio di organoid gonfiore-base, con la natura non invasiva e respiratoria di HNEs. Qui, descriviamo il nostro metodo di generazione di culture 3-dimensionale "sferoide" di HNEs per lo studio individualizzato di CFTR in un' analisi basata a gonfiore30. Sferoidi HNE polarizzano attendibilmente con l'apice epiteliale verso il centro della sfera, o lumen. Questo modello ricapitola le caratteristiche numerose di un epitelio respiratorio inferiore e fa maturare più velocemente di culture di ALI. Come un'analisi funzionale, sferoidi HNE quantificano in modo affidabile una funzione gamma di CFTR, come pure la modulazione in gruppi ben studiata mutazione (ad es., CFTR F508del). Questo test basati su gonfiore capitalizza le proprietà di trasporto di ioni/sale di CFTR, indirettamente di misurazione fluido afflusso nella sferoide come acqua segue efflusso sale apicale. In questo modo, stimolati sferoidi con CFTR completamente funzionale si gonfiano robustamente, mentre quelli con CFTR disfunzionale si gonfiano meno o ridursi. Questo viene quantificato attraverso analisi d'immagine di pre- e sferoidi di post-stimolazione 1h, misurazione area luminal e determinare la percentuale di cambiamento. Questa misura può essere confrontata attraverso gruppi sperimentali a schermo per bioattività di droga in modo specifico per ogni paziente.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL di provetta Eppendorf USA</td><td>Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Pallone filtrante da 150 mL</td><td>Midsci</td><td>TP99150</td><td>Per filtrare il terreno</td></tr><tr><td>15 mL Tubo conico</td><td>Midsci</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>Pallone filtrante da 1 l</td><td>Midsci</td><td>TP99950</td><td>Per filtrare il terreno</td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-Metilxantina opzionale (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>Preparare una soluzione madre da 100 mM di 22,0 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Midsci</td><td>&nbsp; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AT-104</td><td>Soluzione di distacco cellulare</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr><tr><td>Estratto di cervello bovino (9mg/mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Ceftazidima idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr><tr><td>Raschietti cellulari 20 cm&nbsp;</td><td>Midsci</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mM di 4,0 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Tossina Colera B (da Vibrio cholerae)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>Pennello citologico</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>Base Media; Vedere le Tabelle 1 e 2</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (proteina umana ricombinante, senza origine animale)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG6045</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>Epinefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16,6 mM soluzione; Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>TCI America&nbsp;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS ad alte prestazioni)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10082147</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mM di 4,1 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Growth Factor-Reduced Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Corning Matrigel Matrice di membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR), senza rosso fenolo, senza LDEV, 10 mL.</td></tr><tr><td>Emacitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagene umano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Soluzione di collagene</td></tr><tr><td>HyClone (aka FetalClone II)&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07904</td><td>Vedi Tabelle 1 e 2</td></tr><tr><td>Insulina, ricombinante umano, soluzione di zinco</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12585014</td><td>soluzione da 4 mg/mL; vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti IVF, NUNC non trattata</td><td>(via Fisher Scientific)</td><td>12566350</td><td>piastra a 4 pozzetti per sferoidi; dimensione del pozzetto simile a una piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>Fibroblasti embrionali murini irradiati</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software di analisi; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software per un preventivo</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Olympus IX51</td><td>Olympus Corporation</td><td>ha interrotto la produzione</td> del <td>microscopio per immagini. Sostituzione: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp; per un preventivo</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15140122</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Phsophorytheanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>Curette nasale</td></tr><tr><td>Slidebook 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td>Software di imaging fuori produzione</td><td>. Sostituzione: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook per un preventivo</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>Piastra per coltura tissutale per espansione</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>Transferrina (Transferrina Umana 0,5 mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Triiodotrionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-tironina sale sodico [T3]; Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Tripsina da pancreas suino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Crescent Chemical (via Fisher Scientific)</td><td>NC0393024</td><td>20 ml di polvere liofilizzata; Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Vancomicicina cloridrato da Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>Preparare una soluzione madre da 1 mM di 0,4 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td><td>Acquistare o preparare una soluzione madre da 10 mM da 4,5 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato&nbsp; Inibitore di ROCK&nbsp;</td><td>Enzo LifeSciences</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr></tbody></table>

generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Mentre l'introduzione di farmaci modulatore regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ha rivoluzionato la cura nella fibrosi cistica (CF), il modello di terapia genotipo-diretta attualmente in uso presenta diverse limitazioni. Gruppi di mutazione prima, rare o understudied sono esclusi dagli studi clinici definitivi. Inoltre, come farmaci aggiuntivi modulatore entrino sul mercato, sarà difficile ottimizzare le scelte di modulatore per un singolo soggetto. Entrambe le questioni sono affrontate con l'uso di sistemi modello preclinico paziente-derivato, individualizzato di funzione CFTR e modulazione. Cellule epiteliali nasali umane (HNEs) sono una fonte facilmente accessibile del tessuto respiratorio per tale modello. Qui, descriviamo la generazione di un modello tridimensionale della sferoide di funzione CFTR e modulazione utilizzando HNEs primario. HNEs sono isolati da soggetti in modo minimamente invasivo, ampliato in condizioni di riprogrammazione condizionale e seminato nella cultura della sferoide. Entro 2 settimane dalla semina, culture sferoide generano sferoidi HNE che possono essere stimolate con 3', 5'-adenosina monofosfato ciclico (cAMP)-generazione di agonisti per attivare la funzione CFTR. Gonfiore della sferoide è poi quantificato come proxy dell'attività CFTR. Sferoidi HNE capitalizzano l'origine come minimo dilagante, eppure respiratorio delle cellule nasali per generare un modello personalizzato, accessibile pertinente ad un epitelio che riflette la mortalità e la morbosità di malattia. Rispetto per le culture HNE interfaccia aria-liquido, sferoidi sono relativamente veloce per maturare, che riduce il tasso di contaminazione globale. Nella sua forma attuale, il modello è limitato dalla bassa velocità effettiva, anche se questo è compensata dalla relativa facilità di acquisizione del tessuto. Sferoidi HNE possono essere utilizzati per quantificare e caratterizzare l'attività CFTR a livello individuale in modo affidabile. Uno studio in corso per legare questa quantificazione di risposta ai farmaci in vivo stabilirà se sferoidi HNE sono un vero preclinico preannunciatore della risposta del paziente alla modulazione di CFTR.

HNEs dovrebbe fissare la piastra di coltura e formare piccole isole di cellule all'interno di 72 h di semina; esempi di buone e povere isola formazione presso una settimana sono mostrati in Figura 1A e 1B, rispettivamente. Queste isole dovrebbero espandersi per coprire il piatto nel corso di 15-30 giorni. Campioni piccoli o non ottimali possono richiedere più tempo e spesso non produrrà utili sferoidi. Contaminazione con agenti infettivi è te...

Qui descriviamo un metodo per generare colture sferoide tridimensionale di cellule epiteliali nasali umane. Sferoidi quindi sono stimolati a regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) in auto-dipendente dello ione e secrezione fluida, quantificare il cambiamento nella dimensione del luminal sferoide come proxy per funzione CFTR.

Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Nel complesso, questa procedura consiste nel generare sferoidi di cellule nasali umane che possono essere utilizzati come test per studi funzionali di CFTR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fibrosi cistica, come la valutazione della risposta di un singolo soggetto ai farmaci che alterano il CFTR in un sistema modello ex vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di sferoidi viene generato in un lasso di tempo relativamente veloce da un piccolo campione di cellule nasali, consentendo test approfonditi.A dimostrare la procedura saranno Lauren Strecker e Jessica Moncivaiz, tecnici del mio laboratorio. Dopo aver elaborato ed espanso le cellule epiteliali nasali umane o HNE su fibroblasti alimentatori secondo il protocollo di testo, portare il terreno di espansione precedentemente preparato, il terreno di differenziazione, la soluzione di tripsina EDTA allo 0,1% e il PBS sterile a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi utilizzare il 70% di etanolo per pulire i contenitori e trasferirli in una cappa di biosicurezza pulita.Nella cabina di biosicurezza, utilizzare una pipetta Pasteur collegata a una linea del vuoto per aspirare e scartare il terreno dalla coltura HNE. Quindi, con una pipetta sierologica pulita, utilizzare cinque millilitri di PBS per lavare il piatto aggiungendo, agitando e aspirando il tampone. Aggiungere cinque millilitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,1% alla coltura e rimetterla nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per cinque minuti.Quindi, al microscopio invertito a 4-10X, verificare che le cellule si stacchino dal piatto, diventino rotonde e galleggino. Picchiettare delicatamente il lato della piastra di coltura per rimuovere le cellule e, se necessario, incubare nuovamente la piastra per altri cinque minuti fino a quando la maggior parte delle cellule non si è staccata. Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, aggiungere cinque millilitri di terreno di dilatazione alla piastra e raccogliere tutto il liquido in una provetta conica sterile da 50 millilitri etichettata.Se le cellule rimangono aderenti alla piastra di coltura dopo tre cicli di tripsinizzazione, utilizzare un raschietto cellulare sterile per rilasciare delicatamente le cellule rimanenti e con cinque millilitri di terreno di espansione, lavare il raschietto e la piastra e raccogliere il contenuto nella stessa provetta conica etichettata. Centrifugare la provetta a 360 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il surnatante e utilizzare un millilitro di mezzo di espansione per risospendere il pellet cellulare.Quindi utilizzare un emocitometro per contare le cellule. Scongelare la matrice della membrana basale sul ghiaccio secondo le istruzioni del produttore. Separare un numero appropriato di celle di passaggio tripsinizzate in modo differenziale per una concentrazione finale di 500.000 cellule per millilitro di matrice.Per una piastra a quattro pozzetti, utilizzare 200.000 cellule e raccoglierle in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare la miscela di cellule a non più di 360 volte g per cinque minuti. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, aspirare completamente e accuratamente e scartare il terreno, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.Tenere il tubo di cellule sul ghiaccio quando non lo si maneggia attivamente. Utilizzare un puntale per pipetta da un millilitro per aggiungere 100 microlitri della matrice della membrana basale per pozzetto pianificato alle cellule. Senza svuotare completamente il puntale della pipetta per evitare l'introduzione di bolle d'aria, pipettare su e giù per risospendere accuratamente e accuratamente le cellule.Muoversi rapidamente per evitare la solidificazione della matrice. Per seminare aliquote di matrice da 100 millilitri in ciascun pozzetto di una piastra di coltura per fecondazione in vitro a quattro pozzetti, utilizzare un paio di forbici pulite per tagliare i tre o quattro millimetri distali da un puntale di pipetta da 200 microlitri. Pipettare con cura e lentamente una goccia da 100 microlitri di miscela di matrice cellulare al centro di ciascun pozzetto, assicurandosi che la goccia rimanga sferica e non tocchi i lati del pozzetto.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti fino a quando non si solidifica. Quindi pipettare con cura 500 microlitri di terreno di differenziazione in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non disturbare la goccia della matrice. Assicurati che il mezzo copra appena la goccia e aggiungine altro se necessario.Per coltivare gli sferoidi HNE, utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro, aspirare delicatamente tutto il terreno dal pozzetto evitando la matrice che distruggerà gli sferoidi. Quindi, con un puntale di pipetta fresco da un millilitro ed evitando di toccare o disturbare la matrice, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno di differenziazione al pozzetto intorno alla matrice. Continuare a incubare gli sferoidi, sostituendo il terreno di differenziazione tre volte alla settimana, come appena dimostrato.Sotto un microscopio invertito con ingrandimento 20X, valutare quotidianamente la morfologia degli sferoidi. Gli sferoidi dovrebbero formarsi entro tre-cinque giorni dalla placcatura e raggiungere la maturità entro circa 10 giorni. Gli HNE dovrebbero attaccarsi al piatto di coltura e formare piccole isole entro 72 ore dalla semina.Esempi di buona e cattiva formazione di isole in una settimana sono mostrati qui. Le isole dovrebbero espandersi fino a coprire il piatto nel corso di 15-30 giorni. Entro i primi tre o quattro giorni di coltura, piccole strutture cistiche dovrebbero iniziare a formarsi nella matrice e maturare in circa 10 giorni.Se piastrate alla densità descritta, le colture di successo conterranno da 50 a 100 sferoidi per goccia di matrice. I lumi possono essere relativamente chiari come nel CFTR wild-type o riempiti di detriti cellulari e muco come negli sferoidi CF. La mascheratura per delineare l'area luminale degli sferoidi è dimostrata in questi due pannelli.Qui sono mostrati esempi di colture di sferoidi mal formate e non riuscite. Come illustrato in questi grafici da saggi funzionali, gli sferoidi di soggetti con CFTR wild-type dovrebbero gonfiarsi per oltre un'ora quando stimolati e dovrebbero gonfiarsi meno o ridursi se stimolati in presenza dell'inibitore CFTR inh-172. Gli sferoidi di un soggetto omozigote per F508del-CFTR dovrebbero ridursi o gonfiarsi molto leggermente con un aumento del gonfiore o un minore restringimento quando farmacologicamente corretti con i modulatori CFTR VX809 e VX770.Una volta padroneggiata, la semina degli sferoidi delle cellule nasali può essere eseguita in 15-20 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere pulite le procedure operative all'interno della cabina di biosicurezza per ridurre al minimo il rischio di contaminazione del campione ed evitare qualsiasi rischio per la propria salute. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la fissazione, la colorazione e la microscopia per rispondere a ulteriori domande sulla morfologia e la composizione cellulare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare sferoidi di cellule nasali umane primarie che possono essere utilizzati come test personalizzato della funzione CFTR. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani primari può essere pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso corretto dei dispositivi di protezione individuale.

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Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

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