Name: Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara a generare sferoidi di cellule epiteliali nasali umane per studiare la funzione CFTR nella fibrosi cistica. Questo metodo permette test personalizzati di farmaci modulatori CFTR in un modello ex vivo.

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Questo lavoro è stato supportato da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, grant numero CLANCY14XX0 e attraverso la Fondazione fibrosi cistica, concedere il numero CLANCY15R0. Gli autori desiderano ringraziare Kristina Ray per la sua assistenza nel reclutamento dei pazienti e la vigilanza regolamentare. Gli autori desiderano anche ringraziare il gruppo di lavoro di HNE, sostenuto dalla Fondazione fibrosi cistica, che ha assistito nella generazione di funzionalità di HNE cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Marty Solomon e Katherine Tuggle.

<ol><li>Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra043184">Cystic fibrosis.</a> N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li>
<li>Anderson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+triphosphates+are+required+to+open+the+CFTR+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel.</a> Cell. 67 (4), 775-784 (1991).</li>
<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+ion+transport.+Part+one%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Human airway ion transport. Part one.</a> Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).</li>
<li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%3A+an+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).</li>
<li>Accurso, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>De Boeck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Moss, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+an+Arg117His-CFTR+mutation%3A+a+double-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. , (2015).</li>
<li>Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor+alone+and+combined+with+ivacaftor%3A+preclinical+and+clinical+trial+experience+of+F508del+CFTR+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction.</a> Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CFTR2+Database%22">CFTR2 Database</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.cftr2.org">www.cftr2.org</a> (2017).</li>
<li>Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+for+cystic+fibrosis%3A+establishing+human+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems.</a> Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).</li>
<li>Worthington, E. N., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+ASL+measurements+and+mucus+transport+rates+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Hug, M. J., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+current+measurements+to+diagnose+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).</li>
<li>van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+biochemical+analysis+of+CFTR+in+human+rectal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies.</a> Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+modulators+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Zomer-van Ommen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. , (2015).</li>
<li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).</li>
<li>Di Lullo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%26%2334%3Bex+vivo+model%26%2334%3B+contributing+to+the+diagnosis+and+evaluation+of+new+drugs+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otorhinolaryngol+Ital%22%5BJournal%5D)">An &#34;ex vivo model&#34; contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis.</a> Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).</li>
<li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).</li>
<li>Devalia, J. L., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+in+culture%3A+an+overview+of+their+characteristics+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Proc%22%5BJournal%5D)">Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function.</a> Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).</li>
<li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).</li>
<li>Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+epithelial+cells+can+act+as+a+physiological+surrogate+for+paediatric+asthma+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies.</a> PLoS One. 9 (1), e85802(2014).</li>
<li>Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preservation+and+regeneration+of+cilia+on+human+nasal+epithelial+cells+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro.</a> Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> J Cyst Fibros. , (2017).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+downregulation+of+distinct+chloride+channels+in+cystic+fibrosis-affected+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia.</a> PLoS One. 9 (9), e106842(2014).</li>
<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+airway+surface+dehydration+as+the+initiating+event+in+CF+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease.</a> J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive la generazione di colture di sferoide paziente-derivato nasale cellulari in grado di produrre un modello individualizzato, specifico della funzione CFTR. Ci sono diversi passaggi chiave nel processo che dovrebbe essere frequentato molto attentamente per evitare difficoltà. In primo luogo è un'acquisizione di buon campione dal naso del paziente. Dovrebbe avere un buon campione > 50.000 cellule, limitato muco/detriti ed essere pronti per l'elaborazione all'interno di 4 h (anche se il successo è a...

La fibrosi cistica (CF) è una malattia fatale, autosomica recessiva riguardano oltre 70.000 persone in tutto il mondo1. Questa malattia genetica di vita-riduzione è causata da mutazioni nella conduttanza del Transmembrane di fibrosi cistica regolatore della proteina (CFTR)2. CFTR è un membro della famiglia vassoio Trifosfato di adenosina-legante e funzioni come un canale ionico che permette il movimento del cloruro e bicarbonato attraverso le membrane apicali di epiteli polarizzati multiple compreso il tratto gastrointestinale, della ghiandola di sudore, respiratorio e albero, tra gli altri3,4. Come tale, disfunzionale CFTR conduce alla disfunzione epiteliale multisistemica, con maggior mortalità derivante dalla malattia respiratoria1. Nel polmone CF, perdita di CFTR-driven delle vie respiratorie superficie liquida (ASL) regolamento e muco rilascio porta a muco ispessito, ostruzione delle vie respiratorie, infezione cronica e rimodellamento delle vie respiratorie progressiva e perdita di funzione polmonare1,5.
Nonostante l'identificazione della disfunzione CFTR come la causa della malattia, terapie in CF tradizionalmente focalizzato sulla mitigazione dei sintomi (ad esempio, la terapia sostitutiva enzimatica pancreatica, terapie di clearance delle vie aeree)1. Questo approccio è stato recentemente rivoluzionato dall'avvento di nuove terapie, definita "Modulatori CFTR," che incidono direttamente CFTR disfunzionale. Questo approccio ha spostato il paesaggio clinico da gestione dei sintomi a modificante la malattia cura ma comporta diverse limitazioni6,7,8,9,10. Attività di modulatore è specifico per il difetto di proteina che accompagna ogni mutazione CFTR e limitato a selezionare popolazioni genetiche11. Questa limitazione è guidata dalla natura eterogenea dei difetti di proteina, ma anche dall'impraticabilità delle sperimentazioni cliniche in gruppi di rara mutazione. Inoltre, fra gli oggetti con ben studiati genotipi (ad es., CFTR F508del/F508del, la più comune mutazione CFTR), c'è ampia variabilità nella malattia onere e modulatore risposta6,7,8 ,9,11.
Per risolvere entrambi i problemi, gli investigatori hanno proposto l'utilizzo di modelli personalizzati per test preclinici12. Questo concetto utilizza tessuto paziente-specifico per generare un sistema individualizzato ex vivo modello per test composto, predizione in vivo soggetto risposta alle terapie in modo personalizzato. Una volta convalidato, un tale modello potrebbe essere utilizzato dai clinici alla terapia di precisione di unità indipendentemente dal genotipo CFTR sottostante del paziente.
Cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) ottenute da espianto dei tessuti al momento del trapianto di polmone stabilito la possibilità di un tale modello per CF13,14. HBEs cresciuta a un'interfaccia aria-liquido (ALI) permettono per la quantificazione di CFTR funzionale direttamente attraverso la prova electrophysiologic o indirettamente attraverso misure di ASL omeostasi13,15. Questo modello è stato fondamentale per comprendere la biologia CFTR e fu un fattore chiave nello sviluppo di CFTR modulatori16. Purtroppo, i modelli HBE non sono tenable come un modello personalizzato a causa della invasività di acquisizione (trapianto di polmone o spazzolatura bronchiale) e la mancanza di campioni per quelli con mutazioni rare o malattia delicata. Viceversa, tessuto intestinale, ottenuto da campioni di biopsia rettale o duodenale, possa essere utilizzato per la misura di corrente intestinale (ICM) o un'analisi basata su gonfiore organoid allo studio individualizzato CFTR funzione17,18, 19. Organoid saggi, in particolare, sono molto sensibili modelli del CFTR attività20,21,22. Entrambi i modelli sono limitati dalla fonte di tessuto (tessuto intestinale, mentre la maggior parte delle patologia di malattia respiratoria) e il metodo semi-invasivo di acquisizione. In alternativa, parecchi ricercatori hanno studiato nasale cellule epiteliali umane di (HNE) al modello CFTR restauro23,24,25. HNEs possono essere raccolte in modo sicuro a pennello o il curettage in soggetti di qualsiasi età e, quando coltivate in ALI, ricapitolare molte caratteristiche del HBEs25,26,27,28. Colture monostrato HNE tradizionalmente sono stati limitati da trasformazione squamose e molto tempo a maturità29. Inoltre, riferito di cortocircuito misure di corrente in HNEs sono più piccole di quelle in HBEs, suggerendo una finestra più piccola per rilevare l'efficacia terapeutica25.
Data la necessità di un modello di coltura del tessuto personalizzato, non invadente, respiratorio della funzione CFTR, abbiamo cercato di unire la sensibilità di un dosaggio di organoid gonfiore-base, con la natura non invasiva e respiratoria di HNEs. Qui, descriviamo il nostro metodo di generazione di culture 3-dimensionale "sferoide" di HNEs per lo studio individualizzato di CFTR in un' analisi basata a gonfiore30. Sferoidi HNE polarizzano attendibilmente con l'apice epiteliale verso il centro della sfera, o lumen. Questo modello ricapitola le caratteristiche numerose di un epitelio respiratorio inferiore e fa maturare più velocemente di culture di ALI. Come un'analisi funzionale, sferoidi HNE quantificano in modo affidabile una funzione gamma di CFTR, come pure la modulazione in gruppi ben studiata mutazione (ad es., CFTR F508del). Questo test basati su gonfiore capitalizza le proprietà di trasporto di ioni/sale di CFTR, indirettamente di misurazione fluido afflusso nella sferoide come acqua segue efflusso sale apicale. In questo modo, stimolati sferoidi con CFTR completamente funzionale si gonfiano robustamente, mentre quelli con CFTR disfunzionale si gonfiano meno o ridursi. Questo viene quantificato attraverso analisi d'immagine di pre- e sferoidi di post-stimolazione 1h, misurazione area luminal e determinare la percentuale di cambiamento. Questa misura può essere confrontata attraverso gruppi sperimentali a schermo per bioattività di droga in modo specifico per ogni paziente.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL di provetta Eppendorf USA</td><td>Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Pallone filtrante da 150 mL</td><td>Midsci</td><td>TP99150</td><td>Per filtrare il terreno</td></tr><tr><td>15 mL Tubo conico</td><td>Midsci</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>Pallone filtrante da 1 l</td><td>Midsci</td><td>TP99950</td><td>Per filtrare il terreno</td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-Metilxantina opzionale (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>Preparare una soluzione madre da 100 mM di 22,0 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Midsci</td><td>&nbsp; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AT-104</td><td>Soluzione di distacco cellulare</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr><tr><td>Estratto di cervello bovino (9mg/mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Ceftazidima idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr><tr><td>Raschietti cellulari 20 cm&nbsp;</td><td>Midsci</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mM di 4,0 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Tossina Colera B (da Vibrio cholerae)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>Pennello citologico</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>Base Media; Vedere le Tabelle 1 e 2</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (proteina umana ricombinante, senza origine animale)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG6045</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>Epinefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16,6 mM soluzione; Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>TCI America&nbsp;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS ad alte prestazioni)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10082147</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mM di 4,1 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Growth Factor-Reduced Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Corning Matrigel Matrice di membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR), senza rosso fenolo, senza LDEV, 10 mL.</td></tr><tr><td>Emacitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagene umano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Soluzione di collagene</td></tr><tr><td>HyClone (aka FetalClone II)&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07904</td><td>Vedi Tabelle 1 e 2</td></tr><tr><td>Insulina, ricombinante umano, soluzione di zinco</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12585014</td><td>soluzione da 4 mg/mL; vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti IVF, NUNC non trattata</td><td>(via Fisher Scientific)</td><td>12566350</td><td>piastra a 4 pozzetti per sferoidi; dimensione del pozzetto simile a una piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>Fibroblasti embrionali murini irradiati</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software di analisi; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software per un preventivo</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Olympus IX51</td><td>Olympus Corporation</td><td>ha interrotto la produzione</td> del <td>microscopio per immagini. Sostituzione: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp; per un preventivo</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15140122</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Phsophorytheanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>Curette nasale</td></tr><tr><td>Slidebook 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td>Software di imaging fuori produzione</td><td>. Sostituzione: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook per un preventivo</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>Piastra per coltura tissutale per espansione</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>Transferrina (Transferrina Umana 0,5 mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>Vedi Tabella 2</td></tr><tr><td>Triiodotrionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-tironina sale sodico [T3]; Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Tripsina da pancreas suino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Crescent Chemical (via Fisher Scientific)</td><td>NC0393024</td><td>20 ml di polvere liofilizzata; Vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Vancomicicina cloridrato da Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td><td>Vedere la Tabella 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>Preparare una soluzione madre da 1 mM di 0,4 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td><td>Acquistare o preparare una soluzione madre da 10 mM da 4,5 mg in 1 mL di DMSO</td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato&nbsp; Inibitore di ROCK&nbsp;</td><td>Enzo LifeSciences</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>Vedi Tabella 1</td></tr></tbody></table>

generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Mentre l'introduzione di farmaci modulatore regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ha rivoluzionato la cura nella fibrosi cistica (CF), il modello di terapia genotipo-diretta attualmente in uso presenta diverse limitazioni. Gruppi di mutazione prima, rare o understudied sono esclusi dagli studi clinici definitivi. Inoltre, come farmaci aggiuntivi modulatore entrino sul mercato, sarà difficile ottimizzare le scelte di modulatore per un singolo soggetto. Entrambe le questioni sono affrontate con l'uso di sistemi modello preclinico paziente-derivato, individualizzato di funzione CFTR e modulazione. Cellule epiteliali nasali umane (HNEs) sono una fonte facilmente accessibile del tessuto respiratorio per tale modello. Qui, descriviamo la generazione di un modello tridimensionale della sferoide di funzione CFTR e modulazione utilizzando HNEs primario. HNEs sono isolati da soggetti in modo minimamente invasivo, ampliato in condizioni di riprogrammazione condizionale e seminato nella cultura della sferoide. Entro 2 settimane dalla semina, culture sferoide generano sferoidi HNE che possono essere stimolate con 3', 5'-adenosina monofosfato ciclico (cAMP)-generazione di agonisti per attivare la funzione CFTR. Gonfiore della sferoide è poi quantificato come proxy dell'attività CFTR. Sferoidi HNE capitalizzano l'origine come minimo dilagante, eppure respiratorio delle cellule nasali per generare un modello personalizzato, accessibile pertinente ad un epitelio che riflette la mortalità e la morbosità di malattia. Rispetto per le culture HNE interfaccia aria-liquido, sferoidi sono relativamente veloce per maturare, che riduce il tasso di contaminazione globale. Nella sua forma attuale, il modello è limitato dalla bassa velocità effettiva, anche se questo è compensata dalla relativa facilità di acquisizione del tessuto. Sferoidi HNE possono essere utilizzati per quantificare e caratterizzare l'attività CFTR a livello individuale in modo affidabile. Uno studio in corso per legare questa quantificazione di risposta ai farmaci in vivo stabilirà se sferoidi HNE sono un vero preclinico preannunciatore della risposta del paziente alla modulazione di CFTR.

HNEs dovrebbe fissare la piastra di coltura e formare piccole isole di cellule all'interno di 72 h di semina; esempi di buone e povere isola formazione presso una settimana sono mostrati in Figura 1A e 1B, rispettivamente. Queste isole dovrebbero espandersi per coprire il piatto nel corso di 15-30 giorni. Campioni piccoli o non ottimali possono richiedere più tempo e spesso non produrrà utili sferoidi. Contaminazione con agenti infettivi è te...

Qui descriviamo un metodo per generare colture sferoide tridimensionale di cellule epiteliali nasali umane. Sferoidi quindi sono stimolati a regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) in auto-dipendente dello ione e secrezione fluida, quantificare il cambiamento nella dimensione del luminal sferoide come proxy per funzione CFTR.

Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Nel complesso, questa procedura consiste nel generare sferoidi di cellule nasali umane che possono essere utilizzati come test per studi funzionali di CFTR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fibrosi cistica, come la valutazione della risposta di un singolo soggetto ai farmaci che alterano il CFTR in un sistema modello ex vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di sferoidi viene generato in un lasso di tempo relativamente veloce da un piccolo campione di cellule nasali, consentendo test approfonditi.A dimostrare la procedura saranno Lauren Strecker e Jessica Moncivaiz, tecnici del mio laboratorio. Dopo aver elaborato ed espanso le cellule epiteliali nasali umane o HNE su fibroblasti alimentatori secondo il protocollo di testo, portare il terreno di espansione precedentemente preparato, il terreno di differenziazione, la soluzione di tripsina EDTA allo 0,1% e il PBS sterile a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi utilizzare il 70% di etanolo per pulire i contenitori e trasferirli in una cappa di biosicurezza pulita.Nella cabina di biosicurezza, utilizzare una pipetta Pasteur collegata a una linea del vuoto per as

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Cellule epiteliali nasali, ottenuti attraverso superficiale raschiare la biopsia di volontari umani, vengono ampliati e trasferite su inserti di coltura tissutale. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono coltivate a interfaccia liquido aria, ottenendo colture di cellule ciliate e non ciliate. Colture di cellule epiteliali nasali differenziate offrono modelli sperimentali validi per lo studio della mucosa respiratoria.

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Questa pubblicazione dimostra metodi per il campionamento e la coltura di successo della mucosa epiteliale nasale dai bambini e per la riprogrammazione di queste cellule in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).

Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo descrive un test per misurare la funzione CFTR e le risposte del modulatore CFTR in tessuti coltivati da soggetti con fibrosi cistica (FC). Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia si gonfiano in modo guidato dal cAMP, una risposta che è difettosa (o fortemente ridotta) negli organoidi FC e può essere ripristinata dall'esposizione ai modulatori CFTR.

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

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Organoidi epiteliali mucociliari di cellule embrionali xenopus: generazione, coltura e imaging dal vivo ad alta risoluzione

Un protocollo dettagliato è presentato qui per descrivere un modello organoide in vitro da cellule epiteliali nasali umane. Il protocollo ha opzioni per le misurazioni che richiedono apparecchiature di laboratorio standard, con possibilità aggiuntive per attrezzature e software specializzati.

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Questo protocollo descrive la raccolta, l'espansione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali in modelli organotipici di cellule epiteliali delle vie aeree e la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia tramite imaging di cellule vive e script personalizzati.

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Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.

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Impara a generare sferoidi di cellule epiteliali nasali umane per studiare la funzione CFTR nella fibrosi cistica. Questo metodo permette test personalizzati di farmaci modulatori CFTR in un modello ex vivo.

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Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

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