Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di modulare l'espressione del transgene mediante la somministrazione dell'induttore chimico tebufenozide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e molecolare, ad esempio quando è necessario stimolare l'espressione di un gene di interesse in un momento desiderato con una forza desiderata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, combinando tutti gli elementi necessari per l'espressione del transgene all'interno di un singolo vettore, l'espressione del transgene può essere stimolata dalla somministrazione dell'induttore chimico tebufenozide.

Dopo aver sottoclonato l'EGFP o ANKRD13A transgeni secondo il protocollo di testo, preparare quattro piastre di coltura cellulare contenenti cellule HEK 293 appena passate in cinque millilitri di DMEM integrati con FBS dal 5 al 10% e antibiotici, che d'ora in poi saranno indicati come terreno di coltura. Mantenere le celle a 37 gradi Celsius. Quando le cellule raggiungono il 50-60% di densità, aggiungere tre microlitri di reagente di trasfezione a 200 microlitri di diluente contenente il DNA.

Dopo aver incubato la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti, aggiungere la miscela alle celle HEK 293. Usa due piatti per la trasfezione e lascia gli altri due non trattati come controlli. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 12-24 ore.

Dopo l'incubazione, aggiungere Teb a uno dei campioni trasfettati e a uno dei controlli non trasfettati. Lasciare gli altri due campioni non trattati come controlli sperimentali. Incubare le piastre per 12-48 ore.

Se si utilizza l'inserto EGFP, analizzare l'espressione di EGFP al microscopio a fluorescenza. Altrimenti, per raccogliere le cellule per l'immunoblotting, utilizzare il PBS ghiacciato per sciacquare le cellule due volte. Quindi, utilizzare un raschietto per cellule per rimuoverli dalla piastra e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi, centrifuga i tubi a 21.000 volte g e da 18 a 25 gradi Celsius per due minuti. Quindi, dopo aver scartato il PBS, aggiungere 0,5 millilitri di reagente per l'estrazione di proteine di mammifero ghiacciato, o M-PER, e inibitore della proteasi al pellet. Risospendere le cellule con diversi cicli di pipettaggio.

Quindi, incubare la sospensione cellulare a una temperatura compresa tra 18 e 25 gradi Celsius e temperatura ambiente per 15 minuti. Centrifugare il lisato cellulare a 21.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, trasferire il surnatante acquoso in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e analizzarlo mediante immunoblotting con gli anticorpi appropriati.

Per spegnere gli stimoli Teb, rimuovere il terreno di coltura contenente Teb dalle cellule e utilizzare PBS preriscaldato per sciacquare le cellule due volte. Quindi, aggiungere un millilitro di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un minuto. Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura preriscaldato e privo di Teb alle cellule e utilizzare un raschietto cellulare per raccoglierle.

Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le celle a 21.000 volte g e da 18 a 25 gradi Celsius per due minuti. Risospendere le cellule in 50 millilitri di terreno di coltura preriscaldato e privo di Teb e trasferire cinque millilitri di cellule in tre piastre di coltura cellulare fresche da 60 millimetri.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24, 48 e 72 ore, rispettivamente. Infine, raccogliere le cellule in diversi punti temporali e misurare i livelli di espressione del transgene utilizzando l'immunoblotting. In questo esperimento che ha valutato l'attività e la permeabilità di pEUI-plus-EGFP, i finti trasfettanti vettoriali non hanno mostrato alcun segnale fluorescente indipendentemente dal trattamento con Teb.

Tuttavia, i transfettanti pEUI-plus-EGFP sono diventati progressivamente sensibilizzati alla crescente quantità di Teb. Ancora più importante, i transfettanti pEUI-plus-EGFP non trattati con Teb non hanno suscitato alcun segnale EGFP rilevabile. Il ANKRD13A con tag FLAG è stato utilizzato per convalidare ulteriormente la reattività di pEUI-plus a Teb.

Come mostrato in questo western blot con anticorpi anti-FLAG, le cellule HEK 293 trasfettate hanno mostrato una forte espressione ANKRD13A dopo un trattamento di 24 ore con Teb. Inoltre, la deplezione di Teb ha dimostrato la reversibilità dell'interruttore genico pEUI-plus, poiché ANKRD13A non era più rilevabile nelle cellule coltivate senza Teb. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire quasi tutto l'esperimento in condizioni prive di germi. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il sistema Tet-On o Tet-Off, possono essere applicati per esprimere in modo differenziale due transgeni distinti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la fisiologia molecolare a livello cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il vettore di commutazione genica pEUI-plus allo scopo di indurre l'espressione del transgene in un momento desiderato con una forza desiderata. Non dimenticare che lavorare con tebufenozide può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare un camice da laboratorio.