Name: Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Scopri come modulare l'espressione del transgene con il sistema pEUI(+) e tebufenozide nelle cellule HEK 293. Questo metodo offre controllo temporale e reversibile dell'attivazione genica per studi di biologia molecolare.

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Gli autori ringraziano S-Y Choi (Università nazionale di Chonnam) per i preziosi commenti e lettura approfondita del nostro manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di ricerca dell'Università nazionale di Chungnam.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>Scegli un sito di riconoscimento degli enzimi di limitazione appropriato (o siti) a MCS di pEUI(+) e subclone il gene di interesse nella direzione desiderata (Figura 1). Nota: Il ankyrin epitopo-etichetta EGFP o bandiera ripetere dominio 13A transgene (ANKRD13A) è stato subclonato nel sito EcoRI del vettore pEUI(+) tramite T4 DNA polimerasi in una sequenza e legatura-indipendente dalla clonazione metodo19.</li>
	<li>Linearizzare il pEUI(+) con EcoRI per 1h a 37 ° C. Mix 50 ng / µ l di linearizzato pEUI(+) con 40 ng / µ l di PCR-amplificato EGFP o ANKRD13A e reagiscono con T4 DNA polimerasi (1 U) per 1 min a temperatura ambiente (TA) prima dell'incubazione in ghiaccio per 10 min. aggiungere 10 µ l della miscela di reazione direttamente a 100 µ l di DH10B cellule competenti per la trasformazione seguente esperimento. Nota: Anche se diversi siti di riconoscimento degli enzimi di limitazione sono stati aggiunti per il MCS di pEUI(+) (Figura 1B), si consiglia di subcloning del gene target nel sito EcoRI, utilizzare legatura-indipendente clonazione tecnologia19,20.</li>
	<li>Verificare l'inserimento di sequenziamento e poi purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione di DNA che è adatto per la transfezione.</li>
</ol>2. transitori di transfezione e trattamento di Teb
<ol><li>Preparare quattro piastre di coltura delle cellule (60 mm di diametro) contenenti cellule HEK293 appena secondarie in 5 mL di terreno dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) completate con 5-10% siero bovino fetale (FBS) e antibiotici (100 U/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina). Qui di seguito, "terreno di coltura cellulare" o semplicemente "terreno di coltura" rappresenta il DMEM completate con FBS e antibiotici. Mantenere le cellule HEK293 a 37 ° C.</li>
	<li>Transfect 1 µ g di DNA purificato nelle cellule HEK293 a 50-60% densità utilizzando 3 µ l di reagente di transfezione. Aggiungere il reagente di transfezione a 200 µ l di diluente (DMEM senza FB e antibiotici) che contengono il DNA. Dopo l'incubazione della miscela di reazione per 30 min a RT, aggiungere la miscela per le cellule HEK-293 sulla piastra di coltura. Utilizzare due piatti per la transfezione e lasciare gli altri due non trattata come controlli.</li>
	<li>Dopo 12-24 h di transfezione, aggiungere Teb (concentrazioni finali, 0.2 - 10 µmol) ad uno dei campioni trasfettati e uno dei controlli non trasfettate. Lasciare gli altri due campioni non trattati come controlli sperimentali. Nota: La soluzione di riserva di Teb (50mm disciolto in dimetilsolfossido) può essere diluita in mezzo di coltura cellulare, DMEM o tampone fosfato salino (PBS) a una concentrazione appropriata prima di aggiungere le cellule coltivate a seconda dei parametri sperimentali. Tuttavia, a causa della bassa solubilità di Teb in soluzione acquosa, evitare di preparare un mix master con un'alta concentrazione di Teb in mezzo; invece, sostituire il mezzo di coltura cellulare completa con mezzo fresco contenente Teb alla concentrazione desiderata.</li>
	<li>Coltivare le cellule Teb-trattati e non trattate per 12-48 h a 37 ° C.</li>
	<li>Se utilizzando la EGFP insert, analizzare espressione di EGFP sotto un microscopio a fluorescenza ( Figura 2). In caso contrario, raccogliere le cellule per un test di immunoblotting.<ol>
<li>Per il dosaggio di immunoblotting, sciacquare le cellule due volte con PBS ghiacciata e poi li raschiare con un raschietto in cella.</li>
		<li>Per l'accatastamento delle cellule, rallentare i raccolti in una provetta conica da 15 mL a 21.000 x g per 2 min a 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Dopo aver scartato il PBS completamente, aggiungere 0,5 mL di reagente di estrazione di proteine derivate da mammiferi ghiacciata (M-a), insieme con l'inibitore della proteasi (5 µ l di 100 x cocktail dell'inibitore di proteasi), per il pellet se le cellule sono coltivate in un piatto di 60 mm.</li>
		<li>Risospendere le cellule con diversi cicli di pipettaggio e poi incubare le cellule sospese per 15 min a 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Girare la cella lysata a 21.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire il surnatante acquoso in un tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL.</li>
		<li>Analizzare il surnatante immunoblotting, seguenti protocolli standard con gli anticorpi adatti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. generazione di linee di cellule HEK293 stabile con integrazione genomica di pEUI(+) Gene Switch
<ol><li>Transfect 5-10 µ g del pEUI(+) purificata con il transgene in cellule HEK293 che sono 50-60% confluenti in una piastra di coltura cellulare di 90 mm diametro, utilizzando 15-30 µ l di reagente di transfezione. Aggiungere il reagente di transfezione di 500 µ l di diluente (DMEM senza FB e antibiotici) che contengono il DNA. Dopo l'incubazione della miscela di reazione per 30 min a RT, aggiungere la miscela di cellule HEK-293 sulla piastra di coltura.</li>
	<li>Dopo la trasfezione, consentire la trasfettanti di crescere e di esprimere i prodotti del gene di resistenza con puromicina sotto terreno di coltura non-selettivi (senza con puromicina) per 24-48 h a 37 ° C.</li>
	<li>Dissociare le cellule dai piatti di cultura di trypsinization. Dopo aver scartato il terreno di coltura, sciacquare il trasfettanti con PBS preriscaldata (37 ° C), aggiungere 1 mL di acido di 0,25% tripsina/etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 1 min a 37 ° C. Dopo tempra la tripsina/EDTA con l'aggiunta di terreno di coltura pre-riscaldato (10ml, 37 ° C), raccogliere le celle utilizzando un raschietto di cella, seguito da centrifugazione in una provetta conica da 15 mL a 21.000 x g per 2 min a 18-25 ° C.</li>
	<li>Risospendere il trasfettanti in 50 mL di terreno di coltura pre-riscaldata (37 ° C) e il trasferimento 10 mL delle cellule in piastre di coltura di cellule fresche 90 mm. Coltura le cellule a 37 ° C fino al confluency di 50-60% prima del trattamento con puromicina (in generale, questo richiede circa 24-48 h).</li>
	<li>Coltivare il trasfettanti a 37 ° C in terreno di coltura cellulare completato con 3 con puromicina µ g/mL per 3-4 settimane. Durante il periodo di selezione, cambiare il mezzo di coltura cellulare contenente con puromicina (3 µ g/mL) ogni 2-3 giorni per mantenere la pressione di selezione. Quando le cellule diventano completamente confluenti, dividerli seguendo le procedure in passi 3.3-3.4, con terreno di coltura contenente con puromicina. Scartare le cellule rimanenti nel terreno di coltura, se non necessario. Nota: Condizioni di selezione con puromicina devono essere stabilite sperimentalmente per tipi cellulari specifici. Abbiamo usato 3 µ g/mL di con puromicina nel mezzo di coltura cellulare; Questo era sufficiente per indurre la morte delle cellule in HEK293 transfettate non.</li>
	<li>Raccogliere le cellule da diverse colonie, utilizzando una bomboletta di clonazione e seguire le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Scartare il mezzo di coltura cellulare. Sciacquare la piastra due volte con pre-riscaldato (37 ° C) PBS per rimuovere le cellule galleggiante.</li>
		<li>Utilizzando pinze sterili, impostare il cilindro clonazione sopra le singole colonie.</li>
		<li>Aggiungere 0,2 mL di tripsina/EDTA 0.35% per ogni cilindro.</li>
		<li>Incubare il piatto a 37 ° C per 1 minuto fino a quando le cellule sono staccate e poi aggiungere qualche goccia di terreno di coltura pre-riscaldata (37 ° C) ai cilindri.</li>
		<li>Trasferire le cellule da ogni cilindro singoli pozzetti di una piastra a 6 pozzetti, con 2 mL di terreno di coltura e 1 µ g/mL di con puromicina in ciascun pozzetto. Nota: Quando le cellule diventano confluenti, scala la cultura. Ora clone(s) può essere stabilita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenere singoli cloni nel mezzo di coltura cellulare addizionata di 1 µ g/mL di con puromicina.</li>
	<li>Convalidare singole colonie testando loro sensibilità al trattamento di Teb (concentrazione finale, 10 µM) per 24 h. prova la reattività dei cloni per la Teb analizzando il livello di espressione del transgene con immunoblotting. Selezionare un clone desiderato (o cloni). Coltivare un Teb-trattati e un campione non trattato in terreno di coltura per 12-48 ore a 37 ° C prima di analizzare il livello di induzione del transgene. Il livello di espressione del transgene può essere misurato mediante immunoblotting, seguendo le procedure in passi 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. lo svuotamento di Teb
<ol><li>Placare gli stimoli di Teb sostituendo Teb contenente terreno di coltura cellulare con medium senza Teb. Nota: Si consiglia di sostituire i media di crescita senza prima reseeding le cellule su un nuovo piatto di cultura. Teb residuo sembra aggrapparsi al piatto plastica e suscitare un'espressione forte background del transgene. Prima reseeding le cellule su una nuova piastra di coltura, sciacquare le cellule raccolte diverse volte con terreno di coltura o di PBS.<ol>
<li>Dissociare le cellule dai piatti di cultura di trypsinization. Dopo aver scartato la Teb contenente terreno di coltura, sciacquare le cellule stimolate Teb due volte con PBS preriscaldata (37 ° C), aggiungere 1 mL di tripsina/EDTA 0.25% e incubare per 1 min a 37 ° C. Dopo tempra la tripsina/EDTA con l'aggiunta di mezzo di coltura privo di Teb del pre-riscaldato (10ml, 37 ° C), raccogliere le celle utilizzando un raschietto di cella, seguito da centrifugazione in una provetta conica da 15 mL a 21.000 x g per 2 min a 18-25 ° C.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 50 mL di terreno di coltura pre-riscaldato privo di Teb (37 ° C) e il trasferimento 5ml delle cellule in tre piastre di coltura cellule fresche di 60 mm. Rispettivamente della coltura le cellule a 37 ° C per 24, 48 e 72 h.</li>
		<li>Raccogliere le cellule in diversi momenti e misurare il livello di espressione del transgene mediante immunoblotting. Nota: In queste condizioni sperimentali, l'espressione del transgene è diventato inosservabile circa 3 giorni post-coltura delle cellule nel medium culturale privo di Teb (Figura 3). Il livello di espressione del transgene può essere misurato dall'immunoblotting, secondo passi 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.

Lo svantaggio principale dell'utilizzo di un interruttore di espressione genica binario è la necessità di trasportare contemporaneamente due plasmidi separati (driver ed effettrici) nella cella di destinazione. Questo può portare a una distribuzione iniqua dei plasmidi e causare una risposta incoerente dell'interruttore a induttori1,2,3. Altro difetto del sistema due-vector è che un minimo di due turni di selezione antibiotica s...

Numerose opzioni differenti del gene sono stati esplorati per la loro capacità di regolare con precisione l'espressione del transgene in colture cellulari e modelli animali, con vari gradi di successo1,2,3. Sistemi di interruttori potenziale gene devono soddisfare diversi criteri rigorosi, tra cui: direzionale precisa espressione del transgene, la risposta dose - e tempo-dipendente di induttori, trascurabile permeabilità del promotore, reversibilità del transgene attivazione attraverso la rimozione di induttore e livelli di tossicità induttore tollerabili da linee cellulari e laboratorio animali1,2,3. Parecchi induttori di piccole molecole sono stati sfruttati, tra cui tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristone9,10, ed ecdisone11,12,13,14. In generale, questi sistemi richiedono almeno due plasmidi contenenti due o tre unità di espressione discreti, uno o due dei quali comporre un elemento normativo (plasmide induttore) che associa un induttore di piccola molecola di acquisire attività trascrizionale; e un altro plasmide (plasmide effettrici) contenente il transgene sotto il controllo di una regione di DNA normativo che consente l'accesso dell'elemento normativo associato a induttore. Lo svantaggio principale del sistema binario è che richiede l'introduzione concomitante di due vettori (induttore ed effettrici) nella cella di destinazione. Negli esperimenti di espressione del transgene transitoria, la transfezione simultanea di due plasmidi produce inevitabilmente una popolazione delle cellule che è singolarmente transfettate con l'induttore o l'effettore, o co-trasfettate diversamente. Inoltre, il sistema binario richiede almeno due turni di selezione antibiotica per stabilire linee cellulari stabili, che è lunga e laboriosa. Così, combinando tutti i componenti necessari per l'espressione del transgene e regolamento in un singolo vettore sarebbe l'ideale per garantire l'espressione concomitante di tutti gli elementi richiesti in una singola cella e consentire la regolazione dell'espressione del transgene attraverso il trattamento con induttori di piccola molecola.
Per superare le carenze delle opzioni binarie gene, abbiamo sviluppato recentemente un interruttore gene singolare, utilizzando una Drosophila melanogaster genica basati su EcR sistema inducibile15. Ecdisone media l'espressione genica quando si lega all'eterodimero EcR/ultraspiracle (USP), che a sua volta induce il legame dell'EcR al DNA elementi regolatori3,11. Il recettore di vertebrati retinoide X (RXR), un gene ortologo di insetto USP, reclute EcR per formare un attivatore trascrizionale attivo16. Così, per l'espressione mirata di un transgene in tessuto o cellule dei vertebrati, l'EcR e RXR deve essere co-espressi contemporaneamente prima di essere stimolata da ecdisone o suoi agonisti. Poiché la funzionalità heterodimeric dello switch basati su EcR gene può essere influenzata dalla endogeno RXR livello, Paolessi et al. sostituito i domini di legame al DNA di EcR e attivazione con eterologa GAL4 DNA-binding, herpes simplex virus proteina vmw65 domini di attivazione (VP16) fuso a dominio legante-legante EcR, che poi è diventato insensibile a RXR endogeno e formate un omodimero per ottenere l'attività trascrizionale17. L'interruttore del gene basati su EcR è stata ulteriormente migliorata con la costruzione di una proteina chimerica composta da minimo VP16 attivazione dominio combinato con GvEcR, che formava un omodimero e localizzata nel citosol in assenza dell'agonista ecdisone, Teb16, 18. Legandosi agli Teb, la GvEcR ha cambiato la sua localizzazione subcellulare dal cytosol al nucleo di riconoscere un promotore ibrido composto da zebrafish E1b promotore minimo combinato con un tandem dieci ripetute sequenze di attivazione a Monte (UAS) per avviare la trascrizione del gene bersaglio16.
Per semplificare il gene precedentemente segnalato basati su EcR interruttori16,18, abbiamo combinato le caratteristiche binarie del sistema in un singolo vettore dotato di tutti gli elementi richiesti per l'espressione del transgene stimolante e quindi designato il vettore appena generato, pEUI(+) (numero di accessione GenBank: KP123436, Figura 1A)15. L'effettore risponde al GvEcR driver (driver di seguito) è costituito da dieci tandem UAS ripete accanto un promotore minimo E1b seguito da un polylinker (MCS) con sequenze di riconoscimento EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII (Figura 1B). Inoltre, per facilitare la selezione di transfected le cellule, una con puromicina promotore-driven di SV40 N-acetile-gene della transferasi (PAC) è stato collocato tra le regioni pilota ed effettrici di mantenere linee cellulari stabili (Figura 1).
Descriviamo un protocollo dettagliato per la modulazione transiente e stabile di espressione del transgene utilizzando pEUI(+). Inoltre, forniamo istruzioni dettagliate per l'utilizzo corretto di Teb come un agonista di ecdisone.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>La licenza di brevetto è stata trasferita a TransLab Inc.</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Gene-Fect</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro di clonazione</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>SPL scienze della vita</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>topo FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa tubulina</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro di clonazione</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Proteina di mammifero Reagente di estrazione</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Inibitore della proteasi . III</td><td>T& I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare gene per deliberata espressione del transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Controllo preciso dell'espressione del transgene è auspicabile in studi biologici e clinici. Tuttavia, poiché la funzionalità binaria di gene attualmente impiegati interruttori richiede il trasferimento di due unità di espressione terapeutica simultaneamente in una singola cella, l'applicazione pratica del sistema per la terapia genica è limitato. Per semplificare il sistema di espressione del transgene, abbiamo generato un interruttore gene designato come pEUI(+) che comprende un set completo di moduli di espressione del transgene in un singolo vettore. Che comprende il dominio di legame al DNA di GAL4 e modificate EcR (GvEcR), un dominio di attivazione VP16 minimal fuso con un dominio di legame al DNA di GAL4, così come un recettore di ecdisone di Drosophila (EcR), modificato l'opzione di nuova concezione singolare gene è altamente sensibile alla somministrazione di un induttore chimico in un modo dipendente dal tempo e dal dosaggio. Il vettore di pEUI(+) è uno strumento potenzialmente potente per migliorare il controllo dell'espressione del transgene in studi pre-clinici e ricerca biologica. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la modulazione di un'espressione del transgene transiente e stabile utilizzando il vettore pEUI(+) dal trattamento di tebufenozide (Teb). Inoltre, condividiamo importanti linee guida per l'uso di Teb come un induttore chimico.

L'interruttore GvEcR-based singolare gene è raffigurato in Figura 1A. Il vettore di pEUI(+) è stato ottimizzato per l'espressione del transgene regolamentato dal trattamento con Teb. La regione dell'effettore di pEUI(+) comprende un 10xUAS e un E1b promotore minimo seguita da un MCS contenenti siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII. Un segnale di poli (a) di SV40 è stato aggiunto dietro il MCS (<strong class="...

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell'espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di modulare l'espressione del transgene mediante la somministrazione dell'induttore chimico tebufenozide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e molecolare, ad esempio quando è necessario stimolare l'espressione di un gene di interesse in un momento desiderato con una forza desiderata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, combinando tutti gli elementi necessari per l'espressione del transgene all'interno di un singolo vettore, l'espressione del transgene può essere stimolata dalla somministrazione dell'induttore chimico tebufenozide.Dopo aver sottoclonato l'EGFP o ANKRD13A transgeni secondo il protocollo di testo, preparare quattro piastre di coltura cellulare contenenti cellule HEK 293 appena passate in cinque millilitri di DMEM integrati con FBS dal 5 al 10% e antibiotici, che d'ora in poi saranno indicati come terreno di coltura. Mantenere le celle a 37 gradi Celsius. Quando le cellule raggiungono il 50-60% di densità, aggiungere tre microlitri di reagente di trasfezione a 200 microlitri di diluente contenente il DNA.Dopo aver incubato la reazione a temperatura a

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Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Fonte: Berens, C. et al. Applicazione di un sistema di espressione indutibile per studiare l'interferenza dei fattori di virulenza batterica con la segnalazione intracellulare. J. Vis. Esp. (2015)Questo video dimostra l'uso di un sistema di espressione indutibile per identificare dove la proteina batterica effettrice CaeB interrompe la cascata apoptotica dell'ospite. Descrive i passaggi per la trasfettazione delle cellule che esprimono CaeB con un sistema sensibile alla tetraciclina per indurre...

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Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile (Video) | JoVE Journal

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

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