Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

L'obiettivo generale di questa mutagenesi casuale è quello di individuare le mutazioni che destabilizzano l'eterocromatina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'eterocromatina, come i fattori che regolano la formazione e il mantenimento dell'eterocromatina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può mirare in modo specifico a un gene desiderato per la mutagenesi, anche se il gene è essenziale.

Per iniziare, prepara l'estratto di lievito con integratori, o SI, senza adenina, Pombe Glutamate Medium, o PMG, e PMG senza adenina, mescolando i componenti come mostrato in questa tabella. Dopo la sterilizzazione in autoclave e l'aggiunta di G418 se necessario, mescolare il mezzo per altri cinque-dieci minuti. Quindi, aliquotare il terreno in piastre di Petri da 90 millilitri e conservare le piastre a quattro gradi Celsius.

Utilizzando il rpt4 positivo clonato, con i suoi cinque UTR primi e tre primi e mutazione silente, così come i primer p5 e p6 e una speciale polimerasi, progettati per generare un alto tasso di errore, eseguono la PCR soggetta a errori in un volume totale di 50 microlitri. Dopo aver generato un costrutto di trasformazione-fusione, secondo il protocollo di testo, inoculare dieci millilitri di terreno YES con lievito e incubarlo per più di 16 ore fino alla saturazione. Utilizzare 200 millilitri di terreno YES per diluire le cellule a un OD600 di 0,2 e incubare la coltura a 30 gradi Celsius agitando per cinque o sei ore fino a un OD600 da 0,6 a 0,8.

Calcola il volume delle celle che sommano fino a OD600 di 30. Quindi, erogare le cellule in quattro provette coniche da 50 millilitri e raffreddarle con ghiaccio per 10 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1050 G e quattro gradi Celsius per tre minuti.

Quindi, posizionare le provette microfuge con cassetta DNA e 10 cuvette elettroelettriche sul ghiaccio. Mentre è ancora in ghiaccio, scartare il surnatante e aggiungere 15 millilitri di sorbitolo da 1,2 molari, agitare delicatamente le provette per risospendere le cellule, quindi centrifugare le cellule a 1050 G e quattro gradi Celsius per tre minuti. Scartare il surnatante ed eseguire un secondo lavaggio con sorbitolo.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Quindi, risospendere le cellule e raccoglierle tutte in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi, aggiungere 1,2 molari di sorbitolo fino a 2,4 millilitri.

Mantieni il tubo di cellule sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cellule sospese in sorbitolo a una provetta contenente il costrutto PCR di fusione, mescolare bene e trasferire il campione in un'elettrocuvetta. È importante non utilizzare una quantità eccessiva di cassetta PCR, poiché comporterebbe errori di scarica.

Elettroporare le celle utilizzando le seguenti opzioni:aggiungere 600 microlitri di sorbitolo da 1,2 molari a ciascuna elettrocuvetta per un volume totale di 800 microlitri. Quindi, distribuire le celle su quattro piastre SÌ. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore.

Quindi, eseguire la placcatura della replica su YES plus G418 prima di incubare le piastre per altri tre giorni. Per ogni piastra YES plus G418, eseguire la placcatura della replica secondo YES senza adenina e PMG senza placche adenina. Incubare le piastre di replica a 30 gradi Celsius per uno o due giorni fino a quando alcune delle colonie sulle piastre YES senza adenina mostrano una colorazione bianca.

Confrontate SÌ senza piastre adenina e PMG senza adenina e selezionate le cellule che mostrano rosa o bianco sulla piastra SÌ senza adenina e crescono anche sulla piastra PMG senza adenina. Non selezionare colonie senza crescita su PMG senza adenina, poiché sono falsi positivi. Raccogli ogni colonia e aggiungila a 10 microlitri di soluzione SPZ contenente 2,5 milligrammi per millilitro di zimoliasi 100T.

Quindi, incubare le colonie a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare un microlitro di questa soluzione come modello di partenza per la PCR delle colonie. Dopo aver digerito le colonie selezionate ed eseguito l'elettroforesi su gel secondo il protocollo di testo, contrassegnare le colonie i cui prodotti PCR sono stati tagliati da XHO1 e applicarle alle piastre YES plus G418.

Dopo l'isolamento del gDNA dalle cellule di lievito a fissione e il sequenziamento dei prodotti PCR secondo il protocollo di testo, confrontare la sequenza ottenuta con la sequenza wild-type per identificare le mutazioni. Una volta che le mutazioni sono state reintrodotte nelle cellule wild-type, utilizzare lo spotting per confermare il fenotipo nelle cellule mutanti appena create. I mutanti rpt4 generati utilizzando il protocollo dimostrato in questo video possono essere analizzati valutando i colori delle colonie.

Come mostrato in questa figura, le colonie sono state individuate sulle relative piastre in numero decrescente di cellule. Il reporter adeninico inserito nella regione dell'eterocromatina viene silenziato in cellule wild-type e produce colonie rosse su piastre YES without adennine. Una volta che l'eterocromatina è destabilizzata e l'adenina reporter è espressa, le colonie bianche possono essere osservate sulle piastre YES senza adenina come si è visto con il mutante clr4-delta.

I mutanti rpt4 sottoposti a screening sono, come mostrato, con il mutante rpt4-1 che mostra la più grave destabilizzazione dell'eterocromatina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane per ottenere i mutanti desiderati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante eliminare i falsi positivi in quanto sono più frequenti del previsto.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la purificazione delle proteine e i test di attività enzimatica per rispondere a ulteriori domande, come la natura delle proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare mutanti in un gene bersaglio con il fenotipo desiderato.