Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande chiave in vari campi di ricerca, come l'individuazione di cloni precancerosi, la valutazione prognostica dei pazienti affetti da leucemia dopo il trattamento e l'identificazione di mutazioni potenzialmente patogene nei donatori di midollo osseo. A dimostrare questa procedura con me sarà Spencer, che è un tecnico di laboratorio. Questo video descrive come combinare il protocollo di sequenziamento con correzione degli errori con la chimica Illumina e i pannelli genici disponibili in commercio per rilevare varianti clonali a singolo nucleotide e piccoli indel con una sensibilità di uno su 10.000.

Per incorporare gli identificatori molecolari univoci richiesti, gli adattatori 16N i5 e i7 personalizzati utilizzano la PCR. Innanzitutto, prepara il Q5 Master Mix, che utilizza una polimerasi con una fedeltà maggiore rispetto all'alternativa disponibile in commercio. Quindi, per ogni reazione, combinare 37,5 microlitri di Q5 Master Mix, sei microlitri di cinque adattatori micromolari 16N i5, che sono gli identificatori molecolari univoci, e sei microlitri di adattatori i7.

Se l'obiettivo è il multiplexing, utilizzare adattatori i7 diversi in campioni separati. Ora, esegui la PCR utilizzando i seguenti parametri: trenta secondi a 98 gradi Celsius, seguiti da quattro a sei cicli di dieci secondi a 98 gradi Celsius, trenta secondi a 66 gradi Celsius e trenta secondi a 72 gradi Celsius. Termina la reazione con un'estensione di due minuti a 72 gradi Celsius e mantieni la posizione a quattro gradi Celsius.

Quindi entrambi i cicli di PCR che devi fare su di essi molto probabilmente dipendono dalle dimensioni del pannello genetico che usi, dalla nostra esperienza, una PCR a quattro cicli è sufficiente se il pannello genetico ha circa 1500 percorsi diversi di oligo specifici del gene, mentre un pannello con circa cinque a 600 coppie di oligo richiede circa sei cicli di PCR. Quindi, pulire le reazioni PCR utilizzando biglie magnetiche, aggiungere 56,25 microlitri di soluzione di biglie magnetiche in ciascun prodotto PCR da 75 microlitri, quindi trasferire ciascuna reazione in una provetta separata da 1,5 millilitri a basso legame, miscelata pipettando su e giù almeno dieci volte, e attendere cinque minuti. Quindi, trasferisci le miscele in un supporto magnetico e lascia che i surnatanti si limpaghino per due minuti.

Quindi, rimuovere e scartare i surnatanti. Quindi, aggiungi 200 microlitri di etanolo al 70%, attendi trenta secondi, quindi rimuovi l'etanolo. Ripeti questa fase di lavaggio con etanolo una volta, quindi lascia asciugare le perline all'aria per cinque minuti.

Infine, eluire le librerie modificate dalle perle in venti microlitri di acqua distillata doppia. Quindi, posizionare le provette su una rastrelliera magnetica per separare le perle magnetiche dall'eluente. Innanzitutto, effettuare diluizioni seriali dieci volte delle librerie ECS rispetto al passaggio precedente, fino a una parte per 1.000 in strisce PCR.

Successivamente, preparare un Master Mix in un tubo da 1,5 millilitri. Per ogni reazione, combinare 10 microlitri di ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitri di primer P5, 0,2 microlitri di primer P7 e 4,6 microlitri di acqua bidistillata. Quindi, pipettare 15 microlitri di EvaGreen Master Mix in un nuovo set di provette e infine aggiungere cinque microlitri di prodotto pulito da uno a 1.000 ECS al Master Mix.

Quindi, crea goccioline PCR utilizzando il generatore di goccioline. Innanzitutto, caricare la cassetta, pipettare 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline nel pozzetto della cassetta, l'olio etichettato e pipettare 20 microlitri della miscela di reazione ddPCR nel campione ben etichettato. Quindi, coprire la cassetta con una guarnizione di gomma e caricarla nel generatore di gocce e procedere con tutta la generazione di goccioline.

Ora, utilizzando una pipetta multicanale, caricare lentamente, per cinque secondi, 45 microlitri di goccioline prelevate da ciascun pozzetto della cassetta, su una nuova piastra PCR. Quindi, sigillare la piastra PCR con un foglio di alluminio. Ora, amplifica il segnale nelle goccioline utilizzando le seguenti condizioni: cinque minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 40 cicli di trenta secondi a 95 gradi Celsius e un minuto a 63 gradi Celsius, quindi, raffredda la reazione a quattro gradi Celsius per cinque minuti prima di aumentarla a 90 gradi Celsius per cinque minuti, e poi mantenendo a quattro gradi Celsius.

Quindi, preparare la macchina per la lettura di goccioline del modello ddPCR. Selezionare i parametri per la quantificazione assoluta e l'uso del QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Quindi, esegui le reazioni attraverso il lettore di droplet.

Al termine dell'analisi ddPCR, applicare le stesse soglie di divisione a ciascun campione. Quindi, normalizza ogni libreria al numero desiderato di molecole. Inizia con l'esecuzione di reazioni da 50 microlitri, costituite da 25 microlitri di Q5 Master Mix, due microlitri di un primer P5 micromolare, due microlitri di un primer P7 micromolare e 21 microlitri di libreria di DNA normalizzato.

Successivamente, eseguire la PCR utilizzando i seguenti parametri: 30 secondi a 98 gradi Celsius, seguiti da 16 cicli di 10 secondi a 98 gradi Celsius, trenta secondi a 66 gradi Celsius e trenta secondi a 72 gradi Celsius, quindi due minuti a 72 gradi Celsius e mantieni premuto a quattro gradi Celsius. Successivamente, quantificare la concentrazione di DNA nelle librerie e raggruppare le librerie in quantità molari uguali per il sequenziamento, mirare a circa quattro nanomolari. Ora, sequenzia la libreria ECS in pool utilizzando la piattaforma di sequenziamento Illumina, con le seguenti impostazioni di sequenziamento: due volte 144 letture paired-end, otto cicli di indice uno e 16 cicli di indice due.

Il DNA di un paziente con una mutazione in GATA1 è stato diluito in DNA genomico commerciale al VAF originale di 0,19. Utilizzando il protocollo descritto, l'ECS si è dimostrato quantitativo a un livello da uno a 10.000 per la variante a singolo nucleotide. Successivamente, i campioni di buffy coat di venti individui sani sono stati analizzati utilizzando un pannello di sequenziamento commerciale composto da 568 ampliconi.

In sintesi, 109 mutazioni somatiche clonali erano presenti in entrambe le repliche di almeno un punto temporale di raccolta con frazioni alleliche varianti comprese tra 0,0003 e 0,1451.21 delle mutazioni con rappresentazioni cosmiche note sono state selezionate e ciascuna è stata convalidata utilizzando la PCR digitale a goccioline. Per dimostrare il livello di espressione corretto per errore del protocollo, è stato utilizzato un pannello genetico personalizzato composto da 415 geni noti per essere associati a vari tipi di cancro, per produrre una libreria costruita dall'esone più comunemente espresso di ciascun gene. Il livello di espressione del trascritto a bassa abbondanza era altamente riproducibile tra le repliche.

La PCR digitale a goccioline è stata quindi utilizzata per convalidare sei geni selezionati con espressione variabile. Un confronto mostra che il livello di espressione dei geni è stato correttamente catturato dal protocollo ECS, senza la necessità di normalizzazione. Una volta padroneggiata la tecnica, questa tecnica può essere eseguita comodamente in un giorno e mezzo.

La maggior parte del tempo sarà dedicata all'incubazione e la manipolazione manuale occuperà circa il 30-40% del tempo totale richiesto, a seconda del numero di campioni che i ricercatori stanno elaborando contemporaneamente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante disporre di una libreria di sequenziamento delle repliche per lo stesso campione. Questo ti darà più sicurezza che una mutazione a bassa frequenza sia veramente positiva se la mutazione stessa è nucleo indipendente in entrambe le repliche.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre questioni come l'RNA del SEC per rispondere a domande come il rilevamento del trascritto a bassa abbondanza o del trascritto di fusione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori principalmente nel campo delle neoplasie ematologiche e utilizziamo questa tecnica per esplorare i cloni pre-leucemici in individui sani e per rilevare la malattia minima residua nei pazienti affetti da leucemia in remissione.