Name: Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione derrore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Scopri il sequenziamento con correzione degli errori per rilevare mutazioni rare in campioni genomici con sensibilità fino a 1 su 10.000. Questo metodo utilizza identificatori molecolari unici e chimica Illumina per analisi cliniche e di ricerca.

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Ringraziamo i partecipanti allo studio dei bambini AAML1531 del gruppo di oncologia e studio della salute degli infermieri per i loro contributi sotto forma di campioni dei pazienti. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (UM1 CA186107, CA49449 RO1 e RO1 CA149445), Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children Hospital (MC-II-2015-461) ed Eli Seth Matthews leucemia Foundation.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27546487">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484(2016).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1486">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, dimostriamo una suite di protocolli di sequenziamento di correzione d'errore che possono essere facilmente implementati per studiare le mutazioni con VAFs basso in diverse malattie. Il fattore più importante è l'incorporazione di UNMIS con ogni molecola prima di sequenziamento che permettono la correzione degli errori del crudi si legge. I metodi descritti qui permettono ai ricercatori di incorporare UNMIS personalizzato pannelli disponibili in commercio gene sia auto-progettato i oligos gene-specifico.
Protocollo standard di NGS esclude la rilevazione di mutazioni con VAF inferiore al 2% a causa del tasso di errore di sequenziamento, e questo limita l'applicazione di NGS in studi in cui il rilevamento di varianti rare è cruciale. Aggirando il tasso di errore standard di NGS, ECS consente un rilevamento sensibile di queste varianti crude. Per esempio, rilevazione di mutazioni patogene quando queste mutazioni derivano in primo luogo (quindi avendo basso VAF) è assolutamente necessario informare l'intervento precoce della malattia14,15. Nella ricerca di leucemia, la rilevazione di residua minima malattia (le cellule leucemiche residue post-trattamento) informa la stratificazione del rischio e potrebbero essere utilizzata per informare le opzioni di trattamento in modo che le valutazioni di cytometric di flusso binario non possono. Inoltre, ECS è applicabile per rilevare circolanti dell'acido nucleico del tumore e di valutare il potenziale metastatico in pazienti di tumore solido da valutare per la presenza/assenza, come pure l'onere di variante di determinate mutazioni che sono caratteristiche del primario tumore16.
Come dimostrato nella tabella 1, il potere di usare il modello di errore di posizione-specifiche basate su distribuzione binomiale per chiamare varianti dipende in gran parte il numero di librerie in sequenza così come la profondità del sequenziamento utilizzato per compilare il modello di errore. La robustezza del modello errore aumenta con il più alto numero di campioni e una maggiore profondità di sequenziamento. È consigliabile utilizzare almeno 10 campioni in sequenza con una media di correzione d'errore lettura copertura di 3000 x per campione per costruire un profilo di errore per ogni campione. L'approccio di posizione-specifiche è simile a Mastrapasqua, ma invece di utilizzare un tasso di errore di aggregazione per tutte le tipologie diverse di sostituzione (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, abbiamo il modello ogni sostituzione indipendentemente in ogni posizione. Per esempio, un tasso di errore di C > T in una determinata posizione genomica è diversa da un'altra posizione. Il nostro approccio inoltre prende in considerazione un effetto di batch di sequenziamento, come il tasso di sostituzione bassa osservato in una sequenza esecuzione potrebbe essere diverso da un altro giro. Quindi è importante per ogni posizione per tutti i tipi di sostituzione di modello, soprattutto quando campioni da sequenziamento diverse esecuzioni sono riuniti per creare il modello.
Una considerazione importante quando si progetta un esperimento ECS è la soglia di rilevamento desiderato. La bellezza di studi NGS è che può essere facilmente scalate in termini di obiettivi/geni di interesse, soglia di rilevamento (dettata dalla profondità del sequenziamento) e numero di individui interrogati. Ad esempio, se i ricercatori sono interessati a trovare rare mutazioni in due ampliconi con una soglia di rilevamento di 0,0001, essi possono piscina al massimo 75 campioni in un singolo sequenziamento eseguito utilizzando chimica MiSeq V2 che uscite fino a 15 milioni di letture (2 ampliconi * 10.000 molecole * 10 legge per correzione di errore * 75 campioni = 15 milioni sequenziamento letture). I ricercatori possono variare il numero di molecole andando in sequenza o il numero di campioni riuniti in un singolo ordinamento eseguire per regolare la soglia di rilevamento. Nei nostri studi, abbiamo mirato a trovare le mutazioni con una soglia di rilevamento di 0,0001 VAF (01:10, 000) utilizzando il pannello di gene Illumina. Utilizziamo abitualmente 250 ng di a partire del DNA per garantire che le molecole sufficienti sono acquisiti al fine di raggiungere la soglia di rilevamento di cui sopra. I ricercatori possono scegliere di iniziare con bassa quantità di DNA (50 ng è consigliato) se il limite di rilevamento desiderato è > 0.001 VAF.
Come l'UNMIS vengono aggiunti gli indici di i5, sequenziamento impostazioni devono essere modificato di conseguenza. Ad esempio, abbiamo usato 16 N UNMIS, e le impostazioni di sequenziamento sono stati accoppiati fine 2 x 144 letture, 8 cicli di indice 1 e 16 cicli di indice 2 anziché gli usuali 8 cicli di indice 2. L'aumento nel ciclo di indice 2 è compensato da una diminuzione del numero totale di cicli allocata per la legge. Se i ricercatori optano per utilizzare 12N UNMIS10,17, le impostazioni devono essere modificate per 12 cicli di indice 2.
Questo metodo di sequenziamento UMI è ottimizzato per correggere errori di sequenziamento. Rimane non ottimale nel trattare con jackpotting PCR, che è un problema per tutti i metodo basato sull'amplificazione. Abbiamo effettuato turni di post- sequenziamento e post-bioinformatica convalida utilizzando ddPCR, e abbiamo appena rilevare eventuali falsi positivi a causa di jackpotting PCR. Ciò nonostante, si raccomanda che i ricercatori conducono gli esperimenti usando polimerasi ad alta fedeltà per evitare errori di amplificazione basso.

Come abbiamo età, esposizione a sostanze mutagene e stocastici errori durante la divisione cellulare risultato nell'accumulazione delle aberrazioni somatiche nel genoma e questo è alla base della patogenesi fondamentale di trasformazione maligna, malattie neuro-inerente allo sviluppo, pediatriche disordini e invecchiamento normale1,2. Mutazioni somatiche con potenziale di malattia-guida sono importanti biomarkers diagnostici e prognostici per la diagnosi precoce e rischio gestione3,4,5. Per capire meglio clonogenesis fisiologico, che informerà clinica e di ricerca decisioni, accurata quantificazione e caratterizzazione di queste mutazioni è di primaria importanza. Sequenziamento di nuova generazione (NGS) attualmente è usato per studiare mutazioni clonali in campioni di DNA eterogenee; Tuttavia, è limitata all'identificazione di mutazioni a NGS > 0.02 frazione allele variante (VAF) — a causa del tasso di errore inerente di 0,5 – 2,0% del sequenziamento piattaforme6,7,8. Di conseguenza, monitoraggio diagnostico e prognosticamente significative varianti somatiche a VAF inferiore non possono essere realizzati utilizzando standard NGS.
Recentemente, i vari metodi sono stati sviluppati al fine di eludere il tasso di errore di NGS8,9,10,11. Questi metodi utilizzano molecolare tagging, che permette la correzione di errore dopo la sequenziazione. Ogni molecola o frammento genomic nella libreria di sequenziamento è etichettata con una casuale univoco molecolare identificatore (UMI) che è specifico per quella molecola. L'UNMIS sono costruiti da permutazioni di una stringa di nucleotidi randomizzate (N 8 – 16). Un secondo campione specifico codice a barre è anche integrato nel workflow che consente di multiplexing campioni multipli nel sequenziamento NGS stesso eseguito. L'amplificazione di PCR viene eseguita sulla libreria molecolarmente taggata, e successivamente la libreria viene inviata per il sequenziamento. Durante la preparazione della biblioteca, si prevede che gli errori saranno casualmente introdotto al frammento genomico durante l'amplificazione di PCR e sequenziamento8. Per rimuovere gli errori di sequenziamento casuale, sequenziamento crudo letture sono raggruppate secondo l'UMI. Artefatti da sequenziamento non dovranno essere presenti in tutte le letture con l'UMI stesso nella stessa posizione genomica a causa della natura stocastica di introduzione, considerando che una vera variante verrà essere fedelmente amplificata ed ordinata in tutte le letture che condividono la stessa UMI. I manufatti sono bioinformatically rimosso. Qui, descriviamo tre metodi di correzione d'errore Sequencing (ECS) ottimizzati sia in laboratorio per il DNA identificare varianti di singolo nucleotide (SNVs) e piccole inserimento-delezioni (Indels) e per il RNA facilitare la quantificazione dell'espressione genica sotto il Soglia di errore NGS.
Il primo metodo viene descritto un modo per cercare di raro evento somatico utilizzando primers specifici del gene progettato dai ricercatori. Prima della preparazione di libreria, i ricercatori dovrebbero disegnare primers per indirizzare i frammenti di interesse. Abbiamo usato la web-app Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Ampliconi di 200 – 250 bp sono ideali per reazione a catena della polimerasi (PCR) come questi, una volta che è stata integrata UNMIS, generare letture di fine accoppiato con 150 bp fine accoppiato letture di sovrapposizione. Le condizioni di progettazione ottimale primer da utilizzare sono: dimensione minima primer = 19; Dimensione ottimale primer = 25; Dimensione massima primer = 30; Minimo Tm = 64 ° C; Ottimale Tm = 70 ° C; Massimo Tm = 74 ° C; Differenza massima Tm = 5 ° C; Minimo contenuto di GC = 45; Massimo contenuto di GC = 80; Numero da restituire = 20; Massimo 3' fine stabilità = 100.
Nel metodo 2, descriviamo un metodo che unisce il protocollo ECS-DNA con Illumina chimica di indagine per SNVs clonale e piccolo Indels raro come 0,0001 VAF utilizzando pannelli di gene commercialmente disponibili che includono centinaia di ampliconi. Abbiamo usato il TruSight mieloide Sequencing pannello (Illumina) per il nostro esperimento e progettato un pannello espanso per includere ulteriori geni di interesse per le malattie pediatriche mieloide. Questi pannelli non hanno offerto molecolari identificatori univoci (UNMIS) che faciliterebbero la correzione degli errori, così abbiamo aggiunto la nostra strategia di adattatore per questi pannelli. ECS dovrebbe funzionare altrettanto bene con altri pannelli pensati per arricchire per geni associati a malattie diverse. Dopo isolamento del DNA e la successiva quantificazione dal tessuto o il campione di interesse, si raccomanda di avere almeno 500 ng di stock di DNA per esemplare. Facciamo abitualmente una libreria singola sequenza utilizzando 250 ng di DNA al fine di catturare a valle come molto unico frammento genomic da possibili per legge de-duplicazione e calcolo VAF. Una libreria di sequenziamento replica opzionale può essere fatta con i rimanenti 250 ng di DNA. Facciamo sempre due librerie di replicare per campione, e consideriamo solo gli eventi rilevati in modo indipendente in entrambi replicati come veri positivi. Abbiamo anche implementato un modello di genomica errore binomiale di posizione-specifiche per aumentare la precisione della variante chiamata4,13.
Infine, descriviamo un metodo accoppiamento ECS al sequenziamento di RNA per la quantificazione di trascrizione utilizzando pannelli di QIAseq mirati RNA COTS (Qiagen). L'UNMIS necessaria per-duplicazione e correzione di errore sono state integrate nei kit, e i ricercatori possono rendere librerie seguendo le raccomandazioni del produttore. Bioinformatically, i ricercatori possono seguire la pipeline descritta per ECS-DNA, che verrà spiegato in dettaglio nella sezione protocollo.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>Sequenze di adattatori UMI i5 Integrato</td><td>DNA</td> <td>Technologies-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil per Sistema</td> PCR digitale a gocce EvaGreen <td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Piastre a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartucce per generatore di gocce QX200/QX100 Guarnizioni</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 per generatore di gocce QX200/QX100</td> Bioanalizzatore <td>1863009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Pannello di sequenziamento mieloide TruSight</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td> <td>Pannello</td><td></td></tr> di <tr><td>RNA mirato QIAseq personalizzato</td><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di rna e dna di correzione d'errore

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Tecniche di sequenziamento di nuova generazione convenzionale (NGS) hanno permesso per la caratterizzazione genomica immenso per oltre un decennio. In particolare, NGS è stato utilizzato per analizzare lo spettro delle mutazioni clonali nella malignità. Anche se molto più efficiente rispetto ai metodi tradizionali Sanger, NGS lotte con l'identificazione di mutazioni rare clonale e subclonal a causa del suo alto tasso di errore pari al ~0.5–2.0%. Così, NGS standard ha un limite di rilevazione per le mutazioni che sono > 0.02 frazione allele variante (VAF). Mentre il significato clinico per le mutazioni di questo raro in pazienti senza malattia conosciuta rimane poco chiara, i pazienti trattati per leucemia hanno migliorato significativamente i risultati quando malattia residua è < 0,0001 tramite flusso cytometry. Per mitigare questo sfondo artefactual di NGS, sono stati sviluppati numerosi metodi. Qui descriviamo un metodo per la correzione d'errore del DNA e RNA Sequencing (ECS), che coinvolge tagging singole molecole con un indice casuale di 16 bp per correzione di errore sia un indice di paziente-specific bp 8 per multiplexing. Il nostro metodo è in grado di rilevare e monitorare clonale mutazioni all'allele variante frazioni (VAFs) due ordini di grandezza inferiore rispetto al limite di rilevazione di NGS e rari come 0,0001 VAF.

Con Targeted Error-Corrected sequenziamento del DNA, abbiamo effettuato una prova dell'esperimento di principio diluendo paziente mutante del DNA nel DNA genomico commerciale. Il paziente ha avuto una mutazione in GATA1 (chrX:48650264, C &gt; G) con originale VAF di 0,19. Dimostriamo che nella Figura 1 che ECS è quantitativa ad un livello di 1: 10.000 per la variante di singolo nucleotide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Figura 1: serie di diluizioni di GATA1 SNV dimostrando che ECS è quantitativa al livello di 1: 10.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Mostriamo anche che l'ECS-DNA rileva in modo affidabile clonale rare mutazioni in geni ricorrentemente in adulta leucemia mieloide acuta (AML) in individui anziani sani4. Abbiamo ottenuto i campioni del cappotto buffy da 20 individui sani nello studio della salute degli infermieri incassato circa ~ 10 anni di distanza. Abbiamo applicato il protocollo di pannello ECS-DNA su questi campioni. Per questo esperimento, abbiamo adattato la Illumina TruSight mieloide Sequencing pannello che consiste degli 568 ampliconi (maggiori informazioni su elenco gene su https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) ed ordinato 80 librerie da 20 individui (2 raccolte in diversi momenti, 2 ripetizioni per individuali a tempo punto) utilizzando la piattaforma Illumina NextSeq, che ha generato una media di 47,7 milioni accoppiato-fine letture e una media di 3,4 milioni correzione d'errore sequenze di consenso per biblioteca4. La copertura media del nucleotide per biblioteca era di circa 6.000 x (3,4 milioni divisi per 568). Per ogni campione, abbiamo costruito un profilo di posizione-specifiche errore utilizzando in sequenza le librerie che non sono dallo stesso campione. Abbiamo trovato 109 clonale mutazioni somatiche che erano presenti in entrambi replicati del punto di tempo di almeno un insieme. Queste mutazioni hanno VAF che vanno da 0,0003 – 0.1451. Abbiamo selezionato 21 mutazioni con rappresentazioni note cosmiche e convalidato 21 tutte le mutazioni in uno o due punti di tempo insieme utilizzando ddPCR (n = 34, Figura 2, adattato da giovane et al 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Figura 2: mutazioni identificate da ECS sono state verificate tramite ddPCR con VAFs altamente concordanti. (n = 34, per l'ultima volta da giovane et al 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Rispetto al livello di espressione di correzione d'errore tramite protocollo ECS-RNA, abbiamo personalizzato un pannello di gene usando QIAseq chimica che consiste dei 416 geni conosciuti per essere associato con vari tipi di cancro (adattati da QIAseq umano cancro Transcriptome pannello) e abbiamo amplificato l'esone più comunemente espressa di un dato gene (elenco di Gene in 1 materiale supplementare). Abbiamo ordinato le librerie utilizzando Illumina MiSeq piattaforma in formato accoppiato-fine che ha dato una media di 8,3 milioni di letture per libreria, e siamo riusciti a catturare una media di 0,417 milioni sequenze consenso di correzione d'errore. Abbiamo dimostrato che il livello di espressione della trascrizione di abbondanza bassa (&lt; trascrizione 1.000 totali in 50 ng di RNA totale) è altamente riproducibile tra repliche (punto dati n = 300, Figura 3). Convalida di ddPCR (sei geni selezionati di grado variabile dell'espressione) ha dimostrato che il livello di espressione dei geni era stato catturato correttamente dal protocollo ECS senza la necessità di normalizzazione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Figura 3: Top, correlazione di trascrizione conta di ECS-RNA tra repliche dello stesso campione (n = 300). Fondo, trascrizione identificati da ECS i conteggi sono stati verificati da ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un potente strumento per la caratterizzazione genomica che è limitato per l'alto tasso di errore della piattaforma (~0.5–2.0%). Descriviamo i nostri metodi di sequenziamento di correzione d'errore che ci permettono di ovviare il tasso di errore NGS e rilevare le mutazioni alle frazioni di variante allele rare come 0,0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande chiave in vari campi di ricerca, come l'individuazione di cloni precancerosi, la valutazione prognostica dei pazienti affetti da leucemia dopo il trattamento e l'identificazione di mutazioni potenzialmente patogene nei donatori di midollo osseo. A dimostrare questa procedura con me sarà Spencer, che è un tecnico di laboratorio. Questo video descrive come combinare il protocollo di sequenziamento con correzione degli errori con la chimica Illumina e i pannelli genici disponibili in commercio per rilevare varianti clonali a singolo nucleotide e piccoli indel con una sensibilità di uno su 10.000.Per incorporare gli identificatori molecolari univoci richiesti, gli adattatori 16N i5 e i7 personalizzati utilizzano la PCR. Innanzitutto, prepara il Q5 Master Mix, che utilizza una polimerasi con una fedeltà maggiore rispetto all'alternativa disponibile in commercio. Quindi, per ogni reazione, combinare 37,5 microlitri di Q5 Master Mix, sei microlitri di cinque adattatori micromolari 16N i5, che sono gli identificatori molecolari univoci, e sei microlitri di adattatori i7.Se l'obiettivo è il multiplexing, utilizzare adattatori i7 diversi in campioni separati. Ora, esegui la PCR utilizzando i seguenti parametri: trenta secondi a 98 gradi Celsius, seguiti da quattro a sei cicli di dieci secondi a 98 gradi Celsius, trenta secondi a 66 gradi Celsius e trenta secondi a 72 gradi Celsius. Termina la reazione con un'estensione di due minuti a 72 gradi Celsius e mantieni la posizione a quattro gradi Celsius.Quindi entrambi i cicli di PCR che devi fare su di essi molto probabilmente dipendono dalle dimensioni del pannello genetico che usi, dalla nostra esperienza, una PCR a quattro cicli è sufficiente se il pannello genetico ha circa 1500 percorsi diversi di oligo specifici del gene, mentre un pannello con circa cinque a 600 coppie di oligo richiede circa sei cicli di PCR. Quindi, pulire le reazioni PCR utilizzando biglie magnetiche, aggiungere 56,25 microlitri di soluzione di biglie magnetiche in ciascun prodotto PCR da 75 microlitri, quindi trasferire ciascuna reazione in una provetta separata da 1,5 millilitri a basso legame, miscelata pipettando su e giù almeno dieci volte, e attendere cinque minuti. Quindi, trasferisci le miscele in un supporto magnetico e lascia che i surnatanti si limpaghino per due minuti.Quindi, rimuovere e scartare i surnatanti. Quindi, aggiungi 200 microlitri di etanolo al 70%, attendi trenta secondi, quindi rimuovi l'etanolo. Ripeti questa fase di lavaggio con etanolo una volta, quindi lascia asciugare le perline all'aria per cinque minuti.Infine, eluire le librerie modificate dalle perle in venti microlitri di acqua distillata doppia. Quindi, posizionare le provette su una rastrelliera magnetica per separare le perle magnetiche dall'eluente. Innanzitutto, effettuare diluizioni seriali dieci volte delle librerie ECS rispetto al passaggio precedente, fino a una parte per 1.000 in strisce PCR.Successivamente, preparare un Master Mix in un tubo da 1,5 millilitri. Per ogni reazione, combinare 10 microlitri di ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitri di primer P5, 0,2 microlitri di primer P7 e 4,6 microlitri di acqua bidistillata. Quindi, pipettare 15 microlitri di EvaGreen Master Mix in un nuovo set di provette e infine aggiungere cinque microlitri di prodotto pulito da uno a 1.000 ECS al Master Mix.Quindi, crea goccioline PCR utilizzando il generatore di goccioline. Innanzitutto, caricare la cassetta, pipettare 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline nel pozzetto della cassetta, l'olio etichettato e pipettare 20 microlitri della miscela di reazione ddPCR nel campione ben etichettato. Quindi, coprire la cassetta con una guarnizione di gomma e caricarla nel generatore di gocce e procedere con tutta la generazione di goccioline.Ora, utilizzando una pipetta multicanale, caricare lentamente, per cinque secondi, 45 microlitri di goccioline prelevate da ciascun pozzetto della cassetta, su una nuova piastra PCR. Quindi, sigillare la piastra PCR con un foglio di alluminio. Ora, amplifica il segnale nelle goccioline utilizzando le seguenti condizioni: cinque minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 40 cicli di trenta secondi a 95 gradi Celsius e un minuto a 63 gradi Celsius, quindi, raffredda la reazione a quattro gradi Celsius per cinque minuti prima di aumentarla a 90 gradi Celsius per cinque minuti, e poi mantenendo a quattro gradi Celsius.Quindi, preparare la macchina per la lettura di goccioline del modello ddPCR. Selezionare i parametri per la quantificazione assoluta e l'uso del QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Quindi, esegui le reazioni attraverso il lettore di droplet.Al termine dell'analisi ddPCR, applicare le stesse soglie di divisione a ciascun campione. Quindi, normalizza ogni libreria al numero desiderato di molecole. Inizia con l'esecuzione di reazioni da 50 microlitri, costituite da 25 microlitri di Q5 Master Mix, due microlitri di un primer P5 micromolare, due microlitri di un primer P7 micromolare e 21 microlitri di libreria di DNA normalizzato.Successivamente, eseguire la PCR utilizzando i seguenti parametri: 30 secondi a 98 gradi Celsius, seguiti da 16 cicli di 10 secondi a 98 gradi Celsius, trenta secondi a 66 gradi Celsius e trenta secondi a 72 gradi Celsius, quindi due minuti a 72 gradi Celsius e mantieni premuto a quattro gradi Celsius. Successivamente, quantificare la concentrazione di DNA nelle librerie e raggruppare le librerie in quantità molari uguali per il sequenziamento, mirare a circa quattro nanomolari. Ora, sequenzia la libreria ECS in pool utilizzando la piattaforma di sequenziamento Illumina, con le seguenti impostazioni di sequenziamento: due volte 144 letture paired-end, otto cicli di indice uno e 16 cicli di indice due.Il DNA di un paziente con una mutazione in GATA1 è stato diluito in DNA genomico commerciale al VAF originale di 0,19. Utilizzando il protocollo descritto, l'ECS si è dimostrato quantitativo a un livello da uno a 10.000 per la variante a singolo nucleotide. Successivamente, i campioni di buffy coat di venti individui sani sono stati analizzati utilizzando un pannello di sequenziamento commerciale composto da 568 ampliconi.In sintesi, 109 mutazioni somatiche clonali erano presenti in entrambe le repliche di almeno un punto temporale di raccolta con frazioni alleliche varianti comprese tra 0,0003 e 0,1451.21 delle mutazioni con rappresentazioni cosmiche note sono state selezionate e ciascuna è stata convalidata utilizzando la PCR digitale a goccioline. Per dimostrare il livello di espressione corretto per errore del protocollo, è stato utilizzato un pannello genetico personalizzato composto da 415 geni noti per essere associati a vari tipi di cancro, per produrre una libreria costruita dall'esone più comunemente espresso di ciascun gene. Il livello di espressione del trascritto a bassa abbondanza era altamente riproducibile tra le repliche.La PCR digitale a goccioline è stata quindi utilizzata per convalidare sei geni selezionati con espressione variabile. Un confronto mostra che il livello di espressione dei geni è stato correttamente catturato dal protocollo ECS, senza la necessità di normalizzazione. Una volta padroneggiata la tecnica, questa tecnica può essere eseguita comodamente in un giorno e mezzo.La maggior parte del tempo sarà dedicata all'incubazione e la manipolazione manuale occuperà circa il 30-40% del tempo totale richiesto, a seconda del numero di campioni che i ricercatori stanno elaborando contemporaneamente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante disporre di una libreria di sequenziamento delle repliche per lo stesso campione. Questo ti darà più sicurezza che una mutazione a bassa frequenza sia veramente positiva se la mutazione stessa è nucleo indipendente in entrambe le repliche.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre questioni come l'RNA del SEC per rispondere a domande come il rilevamento del trascritto a bassa abbondanza o del trascritto di fusione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori principalmente nel campo delle neoplasie ematologiche e utilizziamo questa tecnica per esplorare i cloni pre-leucemici in individui sani e per rilevare la malattia minima residua nei pazienti affetti da leucemia in remissione.

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Sequenziamento del DNA pool è una strategia rapida ed efficace per individuare le varianti rare associate a fenotipi complessi in coorti di grandi dimensioni. Qui si descrive l'analisi computazionale del pool, sequenziamento di prossima generazione di 32 geni legati al cancro utilizzando il pacchetto software SPLINTER. Questo metodo è scalabile, e applicabile a qualsiasi fenotipo di interesse.

Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

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PCR digitale basata su chip per rilevare rare varianti di trascritto utilizzando un chip nanofluidico

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Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

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sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un'unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

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