Name: Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari da adulto Schistosoma japonicum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri il protocollo per isolare vescicole extracellulari da Schistosoma japonicum adulti in coltura. Questo metodo minimizza lo stress sui parassiti garantendo una secrezione fisiologica delle vescicole per studi di biologia parassitaria.

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Questo studio è stato, in parte o in toto, supportati da National Natural Science Foundation of China (31472187 e 31672550) e The Agricultural Science e Technology Innovation Program dell'Accademia cinese delle scienze agrarie.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico locale dell'Istituto di ricerca veterinaria di Shanghai, Accademia cinese delle scienze agricole (permesso numero: SHVRIAU-14-0101).
1. cultura in Vitro di Schistosomes
Nota: Schistosomes rappresentano un rischio biologico. I lavoratori devono indossare guanti in lattice a tutti volte quando correlate a handling vermi, sospensioni schistosomal o altri materiali biologici. Nuova Zelanda conigli sono stati infettati con ~ 2.000 cercarie via addominale dell'esposizione. Schistosomes nella fase del fegato sono stati raccolti da conigli infettati con S. japonicum cercarie a 28 giorni post-infezione di aspersione del fegato e vene mesenteriche. Le procedure di raccolta di vite senza fine sono stato fatto riferimento in precedenti pubblicazioni che riportano studi in topi18.
<ol><li>Raccogliere i parassiti in un becher da 500 mL. Lavarli accuratamente e delicatamente 3 x 200 ml di preriscaldato (37 ° C) PBS (pH 7.4).</li>
	<li>Separare le coppie di verme di ~ 200 per ogni piatto di Petri di 90 mm. Quindi lavare i parassiti accuratamente e delicatamente 2 x 50 ml di preriscaldato (37 ° C) terreno di coltura RPMI-1640 che contiene 100 U di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina.</li>
	<li>Mantenere i parassiti in 40 mL di terreno di coltura RPMI-1640 preriscaldato senza antibiotici a 37 ° C, inferiore al 5% CO2 ad una densità di verme ~ 5 coppie/ml per 2 h a 90 millimetri Petri dish. Note: Il medium RPMI 1640 non deve contenere siero, altrimenti saranno introdotte delle vescicole extracellulari esogena.</li>
</ol>2. pre-trattati condizione Media
<ol><li>Raccogliere il terreno di coltura e poi Centrifugare il mezzo a 4 ° C a 2.000 × g per 30 min rimuovere uova e detriti tegmentale a vite senza fine.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e quindi filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,22 µm.</li>
	<li>Raccogliere la soluzione filtrata in un sacchetto di dializzato (cut-off peso molecolare: 3.5kD) e poi Dializzare la soluzione utilizzando 8% PEG8000 soluzione a 4 ° C durante la notte. Note: Questo passaggio è importante per arricchire SjEVs per aumentare il rendimento di isolamento SjEVs.</li>
</ol>3. isolamento di SjEVs
<ol><li>Trasferire la soluzione dializzata ad un nuovo tubo e quindi aggiungere 0,5 volumi del reagente esosomi totale isolamento.</li>
	<li>Miscelare la soluzione bene da Vortex o su e giù il pipettaggio per garantire l'omogeneità della soluzione.</li>
	<li>Incubare la miscela a 2 ° C-8 ° C per una notte.</li>
	<li>Centrifugare la miscela a 15.000 × g per 1 h a 2 ° C – 8 ° C.</li>
	<li>Aspirare e scartare il surnatante. Note: SVE sono contenute nel pellet nella parte inferiore del tubo (non visibile nella maggior parte dei casi).</li>
	<li>Risospendere il pellet di EVs in 2 mL di PBS e quindi conservare la soluzione di EVs a-80 ° C fino a ulteriore analisi.</li>
</ol>4. caratterizzazione del SVE mediante Western Blotting
<ol><li>Determinare la concentrazione nella proteina del campione SjEVs, per esempio, dall'analisi di BCA.</li>
	<li>Preparare 10-20 µ g di SVE in 22,5 µ l di tampone RIPA. Quindi aggiungere 7,5 µ l di 4 x caricamento buffer e calore per 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Separare le proteine SjEVs di gel di SDS-PAGE 12%.</li>
	<li>Trasferire le proteine alla membrana PVDF e quindi sonda con anticorpi anti-CD63 (1:1, 000 diluizione), seguiti da sondare con anti-coniglio IgG-HRP (1:5, 000 diluizione).</li>
	<li>Utilizzare il reagente di rivelazione ECL per lo sviluppo della membrana e rilevare i segnali da una sistema di imaging di chemiluminescenza.</li>
</ol>5. caratterizzazione del SVE da microscopia elettronica di trasmissione
<ol><li>Aggiungere 2 µ l di SjEVs isolato a 200 mesh rivestite con formvar griglie e quindi lasciare asciugare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Macchia con 2% acido fosfotungstico per 1 min e poi lasciare asciugare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Caricare le griglie sul supporto del campione del microscopio elettronico a trasmissione ed esposto ad un fascio di elettroni kV 80 per l'acquisizione immagine.</li>
</ol>6. SjEVs etichetta con PKH67 e analisi di assorbimento cellulare
Note: Tutti i passaggi successivi sono stati effettuati a temperatura ambiente (20-25 ° C), se non diversamente indicato.
<ol><li>Trasferire 5 µ g SjEVs soluzione in una provetta di polipropilene fondo conico e regolare il volume di 12 mL aggiungendo medium RPMI 1640.</li>
	<li>Centrifugare il SjEVs a 110.000 × g per 90 min a 4 ° C per pellet SjEVs.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aspirare accuratamente il supernatante. Nota: Il colorante etanolico di PKH67 non deve essere aggiunte direttamente per il pellet SjEV, quanto ne risulterebbe in colorazione eterogenea e vitalità cellulare ridotto.</li>
	<li>Preparare una soluzione di sospensione EV 2x aggiungendo 1 mL di diluente C al pellet di SjEV; per garantire la completa dispersione, risospendere con delicata pipettaggio.</li>
	<li>Appena prima della colorazione in diluente C, preparare un fresco 2 x soluzione colorante aggiungendo 2 µ l della soluzione etanolica tintura PKH67 a 1 mL di diluente C in una provetta da centrifuga in polipropilene e mescolando bene per disperdere.</li>
	<li>Consente di aggiungere rapidamente il 1 mL di 2 x EV sospensione (punto 6.4) a 1 mL di 2 x soluzione colorante (passo 6,5) e immediatamente mescolare il campione di pipettaggio.</li>
	<li>Incubare la miscela a temperatura ambiente per 4 min.</li>
	<li>Interrompere la colorazione con l'aggiunta di 4 mL di FBS e poi incubare per 1 min.</li>
	<li>Aggiungere il terreno RPMI1640 per regolare il volume di 12 mL e poi Centrifugare a 110.000 × g a 4 ° C per 90 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere mezzo RPMI1640 per risospendere il PKH67 con l'etichetta SjEV pellet.</li>
	<li>Centrifugare a 110.000 × g a 4 ° C per 90 min lavare una volta e quindi aggiungere PBS per risospendere il pellet di SjEVs.</li>
</ol>7. SjEVs cella analisi di assorbimento
<ol><li>Le cellule di mammiferi di seme come NCTC clonare cellule 1469 o HEK293T cellule in piastre da 6 pozzetti (2 × 105 cellule per pozzetto) e le cellule della coltura durante la notte.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ g SjEVs PKH67-etichettati e quindi della coltura le cellule a 37 ° C per 2-4 h.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule con PBS due volte.</li>
	<li>Fissare le cellule con soluzione di formaldeide 4% per 15 min e lavato due volte con PBS.</li>
	<li>Macchia i nuclei delle cellule con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Osservare le cellule mediante microscopia a fluorescenza.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Extracellular+Vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+Cargo+Selection%2C+Content%2C+Release%2C+and+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+of+helminths%3A+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).</li>
<li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cancer%3A+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes%3A+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li>
<li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).</li>
<li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen%2C+Fasciola+hepatica%3A+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li>
<li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25421927">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488(2014).</li>
<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Studi recenti su EVs hanno dimostrato quel schistosome che EVS svolgono un ruolo importante nelle interazioni ospite-patogeno3,9,12,16. Per affrontare altre loro funzioni di regolamentazione, è essenziale per isolare SVE da schistosomes. Qui, descriviamo un metodo alternativo per l'isolamento di SjEV. Questo metodo restituisce una dimensione vasta gamma di SjEVs, da 100 nm a 400 nm, in adulto <...

Vescicole extracellulari (EVs) sono una popolazione di piccole vescicole di membrana-limitano incapsulato con varie proteine, lipidi e acidi nucleici. Studi recenti hanno dimostrato che EVs svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione cellula-cellula e sono coinvolti nella regolazione di numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo delle cellule, regolazione immunitaria, angiogenesi e cella migrazione2, 3,4,5. Raccogliendo la prova indica che EVs, circolazione esosomi e loro carico di miRNA rappresenta potenziali biomarcatori di determinate malattie6.
Alcuni protozoi quali Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., hanno dimostrato di essere in grado di secernere EVs; elminti inoltre sono stati trovati per secernere EVs in vita ospita7. EVs parassita sono stati indicati per essere coinvolti nel mantenimento dell'infezione, patogenicità8e9di regolazione immunitaria. Recenti studi in schistosomes entrambi Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 hanno indicato che adulti schistosomes secernono esosomi-come vescicole che possono essere coinvolto nei regolamenti funzionali di specifici processi biologici.
Ad oggi, sono stati utilizzati diversi metodi per isolare le vescicole extracellulari, quali ultracentrifugazione, ultrafiltrazione13, l'uso di reagenti a base di polimeri, cromatografia di esclusione dimensionale e l'isolamento di immunoaffinità. Questi metodi differenti possiedono i propri vantaggi e limitazioni14. Generalmente, ultracentrifugazione è considerato il metodo gold standard per l'isolamento delle vescicole. Tuttavia, questo metodo soffre dalla limitazione del potenziale di aggregazione EV14.
In schistosomes, sono stati segnalati un paio di metodi per l'isolamento di EV: questi includono ultracentrifugazione11,12,10 e l'uso di kit commerciali isolamento di EV16 per diverse fasi (uova16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dato che microvescicole sono di una vasta gamma di dimensioni da diverse centinaia di nanometri a mille nanometri, abbiamo sviluppato un metodo alternativo che si combina con l'uso della centrifuga di panca, ultrafiltrazione e un kit di isolamento commerciale EV per isolare lo SVE da adulto Schistosoma japonicum. Lo SVE isolato in genere ha posseduto un diametro di 100-400 nm e con successo sono stato interiorizzato dalle cellule del destinatario.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (da terreni di coltura cellulare)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>Per isolare le vescicole extracellulari di S. japonicum</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Per la marcatura Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>Per la coltura di parassiti</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,22&mu; m filtro per siringhe</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Tubo per dialisi</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&commercio; Immobilon&commercio; Substrato HRP chemiluminescente occidentale (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>Kit BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 anticorpi</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosfotungstico</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>clone NCTC 1469 cellule</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-9.1&commercio;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE sistema di imaging a chemioluminescenza</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica a trasmissione</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q acqua</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrifuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Incubatore per ultracentrifuga</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari da adulto schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Vescicole extracellulari (EVs) sono membranose vescicole rilasciate da una varietà di cellule nel microambiente extracellulare. SVE rappresentano una popolazione di vescicole eterogenee, cui intervallo di grandezza tra 40 e 1.000 nm. Prove accumulate indicavano che EVs svolgere ruoli importanti regolatori in interazioni ospite-patogeno. Una profonda comprensione di schistosome EVs dovrebbe fornire i meccanismi alla base di interazioni di schistosome-ospite, che permette lo sviluppo di nuove strategie contro la schistosomiasi: intuizioni. Qui, ci proponiamo di studiare ulteriormente funzioni di EVs in schistosomes presentando un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione del SVE da adulto Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE sono state isolate da in vitro mezzo di coltura mediante centrifugazione combinato con un kit di isolamento commerciale esosomi. L' isolato S. japonicum EVs (SjEVs) in genere possiedono un diametro di 100-400 nm e sono caratterizzate da microscopia elettronica di trasmissione e western blotting. L'utilizzo di PKH67 tingere-contrassegnati SjEVs ha dimostrato che SjEVs sono interiorizzati dalle cellule del destinatario. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo alternativo per isolare SVE da adulto schistosomes; il SjEVs isolato può essere adatto per l'analisi funzionale.

Per quantificare il rendimento di SjEVs isolato utilizzando il protocollo descritto, abbiamo usato l'analisi della proteina di BCA per accedere la concentrazione nella proteina del SjEVs isolato da schistosomes adulto 28 giorni. Come illustrato nella tabella 1, la concentrazione di proteina SjEV ha variata da 208 µ g a 250 µ g / 100 mL di terreno (tabella 1). La dimensione delle particelle, come determinato mediante analisi di nanoparticelle di Malvern, i...

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere isolamento di vescicole extracellulari (SVE) nel mezzo di coltura in vitro da adulto Schistosoma japonicum.

Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari da adulto Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le vescicole extracellulari dal terreno di Schistosoma japonicum adulto in vitro coltivato. Questo metodo è in grado di isolare in modo efficiente le EV in terreno di coltura in vitro da Schistosoma japonicum adulto. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di isolare in modo efficiente la vescicola extracellulare dal terreno di coltura in vitro a breve termine, il che può ridurre al minimo lo stress che può potenzialmente provocare una secrezione di EV non fisiologica.La dimostrazione sarà tenuta da Juntao Liu, un tecnico del mio laboratorio. Raccogli i parassiti in un becher da 500 millilitri e lavali accuratamente ma delicatamente tre volte usando 200 millilitri di PBS caldo. Mantieni i lavaggi brevi e usa la sedimentazione per gravità per separare i parassiti.Quindi, su piatti da 90 millimetri, impiattare circa 200 coppie di vermi per piatto. Nella pirofila, lavare i parassiti altre due volte usando la sedimentazione per gravità. Per questi lavaggi, utilizzare un mezzo RPMI caldo integrato con pen-strep.Sostituire il secondo lavaggio con 40 millilitri di terreno senza antibiotici. Quindi, coltiva i parassiti a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per due ore. Dopo due ore, trasferire il terreno dalle piastre alle provette da centrifuga, quindi raccogliere le uova e i detriti di vermi a 2.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi, raccogliere e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Successivamente, filtrare il surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron e raccogliere la soluzione filtrata in una sacca di dialisi con un taglio del peso molecolare di 3,5 kilodalton. Quindi, dializzare la soluzione utilizzando una soluzione all'8% PEG8000 a quattro gradi Celsius durante la notte.Questo passaggio è importante per aumentare la resa delle vescicole extracellulari. Il giorno successivo, trasferire la soluzione dializzata in una nuova provetta e aggiungere 0,5 volumi del reagente di isolamento dell'esosoma totale. Mescolare la soluzione fino a renderla omogenea e incubare a circa cinque gradi Celsius durante la notte.La mattina seguente, centrifugare il composto a 15.000 g per un'ora a circa cinque gradi Celsius. Quindi, aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet di EV in due millilitri di PBS. È probabile che il pellet non sia visibile.Per l'analisi western blot, determinare innanzitutto la concentrazione proteica del campione, ad esempio con il test BCA. Quindi, preparare da 10 a 20 microgrammi di EV in 22,5 microlitri di tampone RIPA. Quindi, aggiungi 7,5 microlitri di tampone di caricamento 4X e riscalda la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Dopo il trattamento termico, separare le proteine della vescicola extracellulare su un gel SDS-PAGE al 12%. Dopo aver eseguito il gel, le proteine vengono trasferite nella membrana in PVDF. Sondare la membrana con anticorpi anti-CD63 a una diluizione da uno a 1.000.Quindi, trattare la membrana con IgG-HRP anti-coniglio a una diluizione da uno a 5.000. A questo punto, utilizzare un reagente di rilevamento ECL per sviluppare la membrana e procedere con l'analisi su un sistema di imaging a chemiluminescenza. Iniziare con il trasferimento di cinque microgrammi di campione in una provetta per ultracentrifuga in polipropilene e regolare il volume a 12 millilitri con il terreno RPMI-1640.Quindi, centrifugare il campione a 110.000 g per 90 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura ed eliminare il surnatante. Quindi, preparare una sospensione di vescicole extracellulari 2X aggiungendo un millilitro di diluente C al pellet.Risospendere il pellet con un pipettaggio delicato. Ora, prepara una soluzione di colorante 2X fresca. Aggiungere due microlitri di colorante etanolico PKH67 a un millilitro di diluente C in un tubo per microfuge e mescolare bene.Quindi, colorare il campione mescolando insieme le due soluzioni e incubando la miscela a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi, fermare la colorazione aggiungendo quattro millilitri di FBS e attendere un altro minuto. Quindi, aggiungere il terreno RPMI-1640 per regolare il volume a 12 millilitri e far girare la sospensione verso il basso per isolare le vescicole colorate.Rimuovere ed eliminare il surnatante. Quindi, risospendere le EV pellettate marcate con PKH67 in 12 millilitri di terreno RPMI-1640. Quindi, ripetere la centrifugazione, ma questa volta raccogliere le vescicole in un millilitro di PBS.Per il saggio di captazione, preparare colture notturne di cellule di mammifero in piastre a sei pozzetti. La mattina successiva, aggiungere cinque microgrammi di vescicole marcate con PKH67 a ciascun pozzetto e continuare la coltura per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno e lavare le cellule con PBS due volte.Quindi, fissare le cellule per 15 minuti, lavarle due volte con PBS e colorarle con DAPI prima dell'imaging. Gli schistosomi allo stadio epatico sono stati raccolti dai conigli 28 giorni dopo l'infezione. Le vescicole extracellulari sono state quindi raccolte dai vermi degli schistosomi e analizzate.La dimensione delle loro particelle, come determinato dall'analisi delle nanoparticelle di Malvern, variava tra 100 e 400 nanometri, con la maggior parte della popolazione vicina ai 220 nanometri. La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che le vescicole extracellulari erano rotonde e avevano un diametro compreso tra 100 e 200 nanometri. L'analisi del western blotting ha indicato che le vescicole extracellulari isolate sono state riconosciute utilizzando gli anticorpi CD63, che è un tipico marcatore delle vescicole extracellulari.La microscopia a fluorescenza delle vescicole extracellulari marcate con PKH67 internalizzate dalle cellule clone 1469 di NCTC ha mostrato che le vescicole extracellulari erano distribuite principalmente nel citoplasma delle cellule riceventi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'EV in terreno di coltura in vitro da Schistosoma japonicum adulto.

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