Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari da adulto Schistosoma japonicum

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le vescicole extracellulari dal terreno di Schistosoma japonicum adulto in vitro coltivato. Questo metodo è in grado di isolare in modo efficiente le EV in terreno di coltura in vitro da Schistosoma japonicum adulto. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di isolare in modo efficiente la vescicola extracellulare dal terreno di coltura in vitro a breve termine, il che può ridurre al minimo lo stress che può potenzialmente provocare una secrezione di EV non fisiologica.

La dimostrazione sarà tenuta da Juntao Liu, un tecnico del mio laboratorio. Raccogli i parassiti in un becher da 500 millilitri e lavali accuratamente ma delicatamente tre volte usando 200 millilitri di PBS caldo. Mantieni i lavaggi brevi e usa la sedimentazione per gravità per separare i parassiti.

Quindi, su piatti da 90 millimetri, impiattare circa 200 coppie di vermi per piatto. Nella pirofila, lavare i parassiti altre due volte usando la sedimentazione per gravità. Per questi lavaggi, utilizzare un mezzo RPMI caldo integrato con pen-strep.

Sostituire il secondo lavaggio con 40 millilitri di terreno senza antibiotici. Quindi, coltiva i parassiti a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per due ore. Dopo due ore, trasferire il terreno dalle piastre alle provette da centrifuga, quindi raccogliere le uova e i detriti di vermi a 2.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, raccogliere e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Successivamente, filtrare il surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron e raccogliere la soluzione filtrata in una sacca di dialisi con un taglio del peso molecolare di 3,5 kilodalton. Quindi, dializzare la soluzione utilizzando una soluzione all'8% PEG8000 a quattro gradi Celsius durante la notte.

Questo passaggio è importante per aumentare la resa delle vescicole extracellulari. Il giorno successivo, trasferire la soluzione dializzata in una nuova provetta e aggiungere 0,5 volumi del reagente di isolamento dell'esosoma totale. Mescolare la soluzione fino a renderla omogenea e incubare a circa cinque gradi Celsius durante la notte.

La mattina seguente, centrifugare il composto a 15.000 g per un'ora a circa cinque gradi Celsius. Quindi, aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet di EV in due millilitri di PBS. È probabile che il pellet non sia visibile.

Per l'analisi western blot, determinare innanzitutto la concentrazione proteica del campione, ad esempio con il test BCA. Quindi, preparare da 10 a 20 microgrammi di EV in 22,5 microlitri di tampone RIPA. Quindi, aggiungi 7,5 microlitri di tampone di caricamento 4X e riscalda la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo il trattamento termico, separare le proteine della vescicola extracellulare su un gel SDS-PAGE al 12%. Dopo aver eseguito il gel, le proteine vengono trasferite nella membrana in PVDF. Sondare la membrana con anticorpi anti-CD63 a una diluizione da uno a 1.000.

Quindi, trattare la membrana con IgG-HRP anti-coniglio a una diluizione da uno a 5.000. A questo punto, utilizzare un reagente di rilevamento ECL per sviluppare la membrana e procedere con l'analisi su un sistema di imaging a chemiluminescenza. Iniziare con il trasferimento di cinque microgrammi di campione in una provetta per ultracentrifuga in polipropilene e regolare il volume a 12 millilitri con il terreno RPMI-1640.

Quindi, centrifugare il campione a 110.000 g per 90 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura ed eliminare il surnatante. Quindi, preparare una sospensione di vescicole extracellulari 2X aggiungendo un millilitro di diluente C al pellet.

Risospendere il pellet con un pipettaggio delicato. Ora, prepara una soluzione di colorante 2X fresca. Aggiungere due microlitri di colorante etanolico PKH67 a un millilitro di diluente C in un tubo per microfuge e mescolare bene.

Quindi, colorare il campione mescolando insieme le due soluzioni e incubando la miscela a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi, fermare la colorazione aggiungendo quattro millilitri di FBS e attendere un altro minuto. Quindi, aggiungere il terreno RPMI-1640 per regolare il volume a 12 millilitri e far girare la sospensione verso il basso per isolare le vescicole colorate.

Rimuovere ed eliminare il surnatante. Quindi, risospendere le EV pellettate marcate con PKH67 in 12 millilitri di terreno RPMI-1640. Quindi, ripetere la centrifugazione, ma questa volta raccogliere le vescicole in un millilitro di PBS.

Per il saggio di captazione, preparare colture notturne di cellule di mammifero in piastre a sei pozzetti. La mattina successiva, aggiungere cinque microgrammi di vescicole marcate con PKH67 a ciascun pozzetto e continuare la coltura per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno e lavare le cellule con PBS due volte.

Quindi, fissare le cellule per 15 minuti, lavarle due volte con PBS e colorarle con DAPI prima dell'imaging. Gli schistosomi allo stadio epatico sono stati raccolti dai conigli 28 giorni dopo l'infezione. Le vescicole extracellulari sono state quindi raccolte dai vermi degli schistosomi e analizzate.

La dimensione delle loro particelle, come determinato dall'analisi delle nanoparticelle di Malvern, variava tra 100 e 400 nanometri, con la maggior parte della popolazione vicina ai 220 nanometri. La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che le vescicole extracellulari erano rotonde e avevano un diametro compreso tra 100 e 200 nanometri. L'analisi del western blotting ha indicato che le vescicole extracellulari isolate sono state riconosciute utilizzando gli anticorpi CD63, che è un tipico marcatore delle vescicole extracellulari.

La microscopia a fluorescenza delle vescicole extracellulari marcate con PKH67 internalizzate dalle cellule clone 1469 di NCTC ha mostrato che le vescicole extracellulari erano distribuite principalmente nel citoplasma delle cellule riceventi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'EV in terreno di coltura in vitro da Schistosoma japonicum adulto.