Name: Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Scopri la purificazione di proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma ACC-MESO-4 mediante desthiobiotina-streptavidina. Questo metodo consente di identificare proteine citosoliche che legano specifici motivi ARE.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione Swiss National Science Foundation Sinergia CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung e Zürich Krebsliga.

1. preparazione di frazione delle proteine citosoliche e nucleari
<ol><li>Piatto 4 x 106 ACC-MESO-4 cellule in un matraccio di cultura cellulare T150 coltivate in RPMI - 1640 medio completati con 10% FBS, 1 x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM). Quando le cellule raggiungono una confluenza di 80-90% (~5-5.5 x 106 cellule), procedere con estrazione della proteina della frazione citosolica e nucleare. Nota: ACC-MESO-4 linea cellulare è stata ottenuta dal RIKEN BioResource centro11.</li>
	<li>Medio di aspirare, lavare le cellule con l'aggiunta di 15 mL di PBS 1X, inclinare il piatto delicatamente un paio di volte e aspirare il PBS 1X. Aggiungere 3 mL di 0,25% tripsina-EDTA e incubare la beuta di coltura a 37 ° C per 3 min. Nota: Esaminare le cellule sotto il microscopio per distacco; Se ancora attaccato tocca il pallone contro il palmo di una mano 3 volte.</li>
	<li>Aggiungere 7 mL di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 1x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM), raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e spin giù a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Aspirare il medio e risospendere il pellet cellulare con 1,5 mL di 1X PBS, quindi trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g e a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante. Nota: Da questo punto in poi, eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 ° C e mantenere tutti i reagenti sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare con gelida 1,5 mL di 1X PBS e spin-down le cellule a 500 x g e a 4 ° C per 3 min. scartare il surnatante. Nota: Le quantità necessarie di CER I, CER II e reagenti NER sono 10, 0.55 e 5 volumi di pellet cellulare stimato pranzo volume, rispettivamente; il seguente protocollo presuppone un volume di 20 µ l. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente CER io.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione citoplasmico ghiacciata (CER mi) completati con 2 µ l di 1x inibitore della proteinasi, ad es., diluire 1 compressa dell'inibitore di proteasi (privo di EDTA) in 500 µ l di acqua per ottenere stock x 100. Questa quantità di reagente CER basterà lisare 20 µ l di un pellet cellulare imballato volume.<ol>
<li>Per stimare il volume di pellet imballato delle cellule, confrontare la provetta contenente il pellet cellulare con un tubo di 1,5 mL riempito con 10, 20, 50 o 100 µ l di PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare vigorosamente nel Vortex il tubo per 15 s e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min aggiungere 11 µ l di reagente di estrazione citoplasmico ghiacciata II (CER II) al tubo, vigorosamente vortex per 5 s e incubare 1 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Agitare vigorosamente per 5 s e centrifugare la provetta a 16.000 x g e 4 ° C per 5 min. trasferire il surnatante nella provetta pre-refrigerata pulita sul ghiaccio. Il supernatante è la frazione citoplasmatica che è ulteriormente utilizzato nell'esperimento RNA-pulldown.</li>
	<li>Risospendere in 100 µ l di reagente di estrazione nucleare ghiacciata (NER) completati con 1 µ l di inibitore della proteinasi (100x) e vigorosamente vortex per 15 s. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente NER completati con inibitori della proteasi.</li>
	<li>Incubare il campione in ghiaccio per 40 min con occasionali su vortex per 15 s (ogni 10 min).</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 16.000 x g per 10 min trasferimento il surnatante (questa è la frazione di proteina nucleare) in una provetta pulita pre-refrigerata.</li>
	<li>Procedere immediatamente misurando la concentrazione di proteine mediante il metodo bicinconinico (BCA) (Vedi Tabella materiali). Per controllare per la purezza della proteina di ogni frazione, eseguire immunoblotting (Figura 1) contro Poli ADP-ribosio polimerasi - PARP (rilevamento positivo solo nella frazione nucleare) e α-tubulina (rilevamento positivo solo nella frazione citosolica). Per la visualizzazione di proteine, fare riferimento alla sezione 4.</li>
	<li>Al fine di mantenere l'attività della proteina e loro stato nativo, preparare 25 µ l di aliquote di estratti citosolici e nucleari. Snap-congelare queste aliquote ponendoli in azoto liquido per 5 s e direttamente a-80 ° C.</li>
</ol>2. etichettatura di RNA con Desthiobiotin
<ol><li>Le sonde del RNA sintetizzato commercialmente e HPLC purificato. Risospendere con acqua priva di nucleasi a 10 µM. Nota: La sonda sequenze sono elencati nella tabella 1.</li>
	<li>Utilizzare 50 pmoli di RNA per reazione di RNA-pulldown. Scongelare e conservare tutti i reagenti su ghiaccio tranne per PEG 30%, utilizzato con etichetta 3' capolinea del RNA oligo.</li>
	<li>Trasferire 5 µ l di 10 µM le sonde del RNA, etichettato come CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) e nessuna relazione-RNA (IRE), in 0,5 mL a parete sottile microcentrifuga tubi e procedere all'incubazione in una macchina PCR a 85 ° C per 5 min. Posizionare i tubi immediatamente sul ghiaccio. Nota: Questo passaggio è importante, in quanto favorisce il rilassamento e l'accessibilità della sonda RNA per l'etichettatura.</li>
	<li>Per una singola reazione di 30 µ l, aggiungere alla provetta contenente RNA la seguente miscela di 10 µ l: 3 µ l di acqua libera nucleasi, 3 µ l di tampone di reazione ligasi di RNA, 1 µ l di RNAsi inibitore 10x (40 U / µ l), 1 µ l di Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 2 µ l di ligasi T4 RNA (20 U / µ l). Nota: Per preparare mix master A 3 campioni in eccesso (3.2), mescolare acqua gratuita, 9,6 µ l di tampone di reazione ligasi di RNA, 3,2 µ l di RNAsi inibitore 10x 9.6 µ l di nucleasi (40 U / µ l), 3,2 µ l di Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 6,4 µ l della ligasi T4 RNA (20 U / µ l).</li>
	<li>Aggiungere attentamente 15 µ l di PEG 30% alla reazione. Utilizzare un altro suggerimento per mescolare la reazione. Incubare la reazione durante la notte a 16 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, preparare quanto segue: 5 M di NaCl (fresco/nucleasi-free), cloroformio: alcool isoamilico in rapporto 24:1 (ad esempio, per reazione - 96 µ l cloroformio e 4 µ l di alcool isoamilico), ghiacciata 100% etanolo e ghiacciata etanolo al 70%.</li>
	<li>Aggiungere 70 µ l di acqua priva di nucleasi per le provette di reazione RNA-etichettatura. Aggiungere 100 µ l di cloroformio: isoamil alcool e agitare brevemente. Rallentamento a 13.000 x g per 3 minuti, rimuovere con attenzione solo la fase superiore e il trasferimento ad un nuovo tubo privo di nucleasi 1,5 mL; evitare di toccare la fase inferiore.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di 5m NaCl, 1 µ l di glicogeno e 300 µ l di etanolo al 100% ghiacciata. Posizionare il tubo a-20 ° C per 2 h. Nota: In questa fase, l'esperimento può essere continuato il giorno seguente.</li>
	<li>Centrifugare a 13.000 x g e a 4 ° C per 15 min., attentamente, scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 300 µ l di etanolo al 70% ghiacciata e centrifugare nuovamente a 13.000 x g e a 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante completamente e asciugare il pellet (15 min). Risospendere il pellet in 20 µ l di acqua priva di nucleasi. Nota: Procedere con RNA-pulldown nello stesso giorno.</li>
	<li>Incubare il RNA a 90 ° C per 2 min e metterli su ghiaccio. Mettere il RNA etichettati sul ghiaccio durante il passaggio seguente di prelavaggio dei branelli magnetici streptavidina. Nota: Un tempo di incubazione più lungo potrebbe danneggiare la sonda RNA.</li>
</ol>3. RNA-proteina Pulldown
<ol><li>
Prelavaggio biglie streptavidin-magnetiche e incubazione con desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Utilizzare 50 µ l di streptavidina perline magnetico per 50 pmol RNA. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato a seconda dell'esperimento.</li>
		<li>Vortice il tubo con perline streptavidina-magnetiche per 15 s e rapidamente rimuovere 200 µ l (mix master; abbastanza per reazioni di 3 + 1) in un tubo di sicurezza bloccaggio pulito 1,5 mL utilizzando taglia punte di pipetta. Posizionare il tubo su un supporto magnetico in modo che le perline raccolgono sul lato del tubo e attendere 1 minuto Rimuovi il liquido di risospensione.</li>
		<li>Lavare le perle, togliere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 400 µ l di 0.1 M NaOH 0,05 M NaCl soluzione e delicatamente dispensare su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico. Attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Lavare le perle con 200 µ l di NaCl 100 mM. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di 20 mM Tris (pH 7.5), risospendere perline pipettando, posizionare il tubo sul supporto magnetico, attendere per 1 min e rimuovere il surnatante. Ripetere il passaggio.</li>
		<li>Togliere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 200 µ l di buffer di acquisizione di RNA: 1x e risospendere le microsfere magnetiche streptavidina brevemente nel Vortex. Rimuovere 50 µ l di biglie magnetiche streptavidina e aggiungere ad ogni provetta etichettata-RNA utilizzando un puntale di taglio. Incubare le provette per 30 min a temperatura ambiente su un rullo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Grippaggio della proteina al RNA
	<ol>
<li>Disporre le provette in un supporto magnetico, attendere 1 min e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di 20 mM Tris (pH 7,5) ai talloni e risospendere pipettando. Disporre le provette in un supporto magnetico, attendere 1 min e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di legame proteina-RNA 1x ai talloni e risospendere pipettando.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare la seguente miscela: 10 µ l di 10x buffer obbligatorio della proteina-RNA, 30 µ l di glicerolo al 50%, 50 µ g di proteine citoplasmatiche e nucleasi-free fino a 100 µ l di acqua. Nota: Preparare mix master B per 3 campioni in eccesso (3.3) come segue: 33 µ l di tampone di legame proteina-RNA 10x, 99 µ l di glicerolo al 50%, 165 µ g di proteine citoplasmatiche e acqua priva di nucleasi fino a 330 µ l. tenere il tubo di mix master B sul ghiaccio.</li>
		<li>Inserire i tubi di supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Aggiungere 100 µ l di master mix B, risospendere pipettando delicatamente su e giù ed evitare di creare bolle. Incubare le provette di reazione per 60 min a 4 ° C su un rullo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavaggio ed eluizione
	<ol>
<li>Disporre le provette in un supporto magnetico, raccogliere il surnatante (che è il flusso attraverso - FT) e trasferire in una nuova provetta. Nota: Mantenere questa FT sul ghiaccio per un'analisi successiva.</li>
		<li>Pipettare 100 µ l di tampone di lavaggio sui branelli: 1x, Risospendere delicatamente, rimettere il supporto magnetico, attendere 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.</li>
		<li>Aggiungere 40 µ l di tampone di eluizione ai branelli magnetici, Miscelare pipettando su e giù e incubare a 37 ° C in un agitatore di tubo (950 giri/min) per 30 min.</li>
		<li>Posizionare i tubi in un supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere eluito campione (che è eluito - E). Posizionare sul ghiaccio e utilizzare per analisi a valle. Nota: In questa fase, ogni testata sonda RNA consiste di un flusso continuo (FT) e campione eluito (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi della macchia occidentale e poliacrilammide elettroforesi
Nota: Vedere la tabella 2 per le ricette per i buffer utilizzati in questa sezione. Eseguire un Western blot secondo il metodo di Laemmli12.
<ol><li>Handcast 12% gel di SDS-PAGE (10-pozzi, spessore 1,5 mm., 66 µ l). Preparare una miscela di gel in esecuzione: 4 mL di soluzione madre di 30% acrilammide-bisacrylamide, 2,4 mL di Tris più basso del buffer, 3,2 mL di dH2O, 9,6 µ l di TEMED, 96 µ l di soluzione di 10% ammonio persolfato (APS). Preparare la miscela di gel di impilamento: 3,25 mL di dH2O, 0,5 mL di 30% acrilammide - soluzione bisacrylamide, 1,3 mL di tampone Tris superiore, 10 µ l di TEMED, 20 µ l di 10% di APS.</li>
	<li>Aggiungere 16,6 µ l di tampone x Laemmli 6 (ad esempio, 14 mL a pH 6.8 Tris/HCl/SDS (tampone Tris superiore), 2 g di SDS, 1,86 g di DTT, 6 mL di glicerolo e 0.012% bromofenolo; conservati a-20 ° C) nel campione FT e 6,6 µ l del 6 x Laemmli buffer nel campione E. Incubare i campioni per 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Caricare i campioni (20 µ l di FT e intera eluire ~ 40 µ l) ed eseguirli per 30 min a 60 V, continuando con 20 V durante la notte.</li>
	<li>Utilizzando un sistema semi-secco electroblotting, trasferire proteine su una membrana PVDF per 80 minuti a 15 V. Nota: La membrana PVDF deve essere attivata prima di eseguire il trasferimento di proteine. Incubare la membrana in metanolo al 100% per 1 min, seguita da un'incubazione di 2 min in acqua ultrapura.</li>
	<li>Dopo il trasferimento di proteine, incubare il gel di SDS-PAGE con Coomassie soluzione per 3 h, seguito da tre fasi di lavaggio con acqua ultrapura, ogni 30 min.</li>
	<li>Alla fine del trasferimento di proteina, lasciate la membrana PVDF asciugare per 1 h. riattivare la membrana come indicato al punto 4.5. Bloccare la membrana 1 h con 5% BSA in 1 x TTBS.</li>
	<li>Incubare la membrana con il primo anticorpo: HuR o mesotelina, entrambi diluiti 1: 1000 in 5% BSA in 1 x TTBS per 4 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare la membrana tre volte per 7 min in 1 x TTBS e incubare coniglio anti-topo alla perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario coniugato diluito 1: 10.000 in 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>Visualizzare le proteine usando chemiluminescenza e un dispositivo di imaging digitale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

3' UTR appartengono al genoma non codificante3e tutti gli RNA non codificanti possa interagire con proteine al fine di esercitare la loro funzione7. Quando il genoma dei mammiferi è stato trovato per essere trascritto pervasively e prodotto una porzione significativa di lunghi non codificanti RNA16, emergenti evidenze hanno dimostrato che questi RNA non codificante lungo funzionano nella regolazione dell'espressione genica come essi interagiscono con...

Espressione genica e il livello finale del prodotto del gene può essere strettamente regolate che interessano la stabilità del mRNA e mRNA traduzione tasso1. Questi meccanismi di regolazione post-trascrizionali sono esercitati attraverso le interazioni di non codificanti proteine RNA e/o RNA-binding (RBPs) con mRNA mirati. È solitamente la regione non tradotta 3' del mRNA (3' UTR - appartenendo alla parte non codificante del genoma2) che contiene specifiche cis-elementi regolatori (CRE), che sono riconosciuti da trans-in qualità di fattori quali miRNA o RBPs 3. la migliore studiati cis-elemento all'interno di 3' UTR, è il motivo di elemento ricco di adenina (ARE), che è riconosciuto da specifiche proteine che legano il AU (AUBP) e, a sua volta, induce la degradazione sia mRNA/deadenylation (decadimento sono-mediata) o mRNA stabilizzazione4.
La dimensione del 3' UTR di calretinina mRNA (CALB2) è 573 bp lungo e contiene un pentamero AUUUA putativo, come predetto da AREsite2, un tool di bioinformatic5. Coerente con la presenza di un motivo sono presunto, l'analisi di vettore-reporter di pmirGLO ha dimostrato un ruolo di stabilizzazione di questo elemento all'interno di mRNA di CALB26. Infine, l' in vitro RNA-pulldown è stato utilizzato per identificare il AUBP che stabilizza calretinina mRNA attraverso il motivo sono.
Poiché tutti gli RNA non codificanti interagisce con proteine7, lo in vitro RNA-pulldown è un buon modo e analisi prima della scelta per l'identificazione di interattori di RNA per aiutare a decifrare i meccanismi molecolari. In questo metodo di RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA, che sono state etichettate con una forma modificata di biotina (desthiobiotin) all'estremità 3' del filamento di RNA, sono state utilizzate. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con l'associazione-RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Tali RNA-proteine vengono eluite dai branelli magnetici, eseguire attraverso un gel di SDS-PAGE 12%, trasferito ad una membrana e sondato con anticorpi differenti.
Nella procedura di purificazione di affinità standard streptavidina-biotina, denaturazione dura condizioni sono necessarie per interrompere il legame biotina-streptavidina irreversibile forte per eluire le proteine rilegate8, che potrebbe portare alla dissociazione di complessi proteici. A differenza di biotina, desthiobiotin reversibilmente si lega alla streptavidina e competitivo è spostata con una soluzione tamponata di biotina, consentendo per la delicata eluizione delle proteine ed evitando l'isolamento di naturalmente biotinilati molecole9, suggerendo che la tecnica è ideale per isolare i complessi della proteina nativa in condizioni native.
In vitro condizioni vincolanti e rigore, che sono determinate dalla concentrazione salina, agenti riducenti e percentuale di detergente, dovrebbe essere vicine a quelle presenti nel contesto del cellulare al fine di identificare le interazioni vere in vivo . Le condizioni di associazione implementate nel presente documento sono state dimostrate in precedenza come appropriato per l'identificazione del HuR come un AU-binding protein10. Questo approccio potrebbe risparmiare tempo, poiché l'ottimizzazione delle condizioni di associazione corretto può essere lungo e impegnativo. Inoltre, questo metodo potrebbe essere usato come un protocollo di partenza per qualsiasi esperimento di RNA-pulldown e può essere ottimizzato gradualmente cambiando la concentrazione di sali e detergenti, modificando la percentuale di glicerolo, e aggiungendo altri sali. Inoltre, abbiamo dimostrato che anche una breve 25 nucleotidi RNA-sonda che harboring un pentamero sono-motivo poteva essere utilizzato per dimostrare l'interazione con un AUBP specifico.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Kit di estrazione nucleare e citoplasmatica</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Compresse di inibitori della proteasi Pierce, senza EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr> Kit per il <tr><td>dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pull-down per proteine RNA magnetiche Pierce.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Include perline magnetiche e quindi il kit deve essere conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Perfora l'RNA 3' Kit di destiobitinilazione fine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>Il kit fa parte del "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" e deve essere conservato a -20 gradi C a differenza del kit a scomparsa (4 &deg; C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2, supporto magnetico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti - HuR (MOUSE)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>Scientific-L'anticorpo è incluso nel kit di pull-down della proteina RNA magnetica Pierce&nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secondario anti-topo di coniglio 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti - &&alpha; - tubulina (MOUSE)</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secondario anti-topo di coniglio 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-PARP (RABBIT)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secondario anti-coniglio di capra 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti - mesotelina (MOUSE)&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario di capra anti-coniglio</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo di coniglio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Siero bovino filtrato</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina - streptomicina (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-Glutammina (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco di Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 celle</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Lastre di vetro&nbsp;</td>Piastre distanziatrici <td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN con distanziatore integrato da 1,5 mm</td><td>Pettine Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN, 10 pozzetti, 1,5 mm, 66 &; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Moduli</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Soluzione di decontaminazione della RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - soluzione stock acquosa al 30% di acrilammide e bisacrilammide a una razione di 37,5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td>Membrana di trasferimento in PVDF <td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Deve essere attivato incubando in metanolo puro per 1 minuto seguito da lavaggio in acqua per 2 minuti.</td></tr><tr><td>Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SD&nbsp;</td><td>Substrato ECL occidentale Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; Digital Imager</td><td>Vilber-RNA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oligosintesi</td><td>Mycrosynth AG,</td> <td>Svizzera-la</td> <td>scala di sintesi - 0,04 &micro; mol -</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td> purificata HPLC <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra puro 1 M Tris, pH 7,5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 15567027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerolo&nbsp;</td><td>Aliquote sterili Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>da conservare a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin perline magnetiche&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Si prega di notare che queste perle magnetiche hanno un diametro medio di 1 & micro; m (intervallo da 0,5 a 1,5 &micro; m). Inoltre, Dynabeads-M280 Streptavidin, che sono perle di dimensione omogenea 2,8 & micro; m, sono utilizzati anche nell'RNA-pulldown, ma tieni presente che ciò può influenzare il processo di purificazione.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di alluminio-(14-18)-idrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>acido orto-fosforico&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con rna nelle cellule di mesotelioma

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Lo in vitro RNA-pulldown è ancora largamente utilizzato nei primi passi di protocolli volti ad identificare RNA-binding proteins che riconoscere specifici RNA strutture e motivi. In questo protocollo RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA sono etichettate con una forma modificata di biotina, desthiobiotin, all'estremità 3' del filamento di RNA, che si lega reversibilmente al streptavidina e permette così di eluizione delle proteine sotto più fisiologico condizioni. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con il RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare l'interazione tra proteine RNA associazione di note e una sonda 25 nucleotidi (nt) lunga RNA contenente una sequenza di interesse. Questo è utile per completare la caratterizzazione funzionale di stabilizzare o destabilizzare gli elementi presenti nelle molecole di RNA ottenute utilizzando un'analisi di vettore reporter.

In questo esperimento, un frammento lungo 25-nt di calretinin 3' UTR harboring sono motivo (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) è stato utilizzato per verificare se si lega specificamente alla proteina umana-antigene R (HuR), un noto stabilizzatore di mRNA. Per verificare la specificità dell'elemento sono, un RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contenente una mutazione sono-motivo, che precedentemente è stata indicata ad abolire l'effetto di stabilizzazione del motivo sono, era usato<sup class="xr...

Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.

Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di catturare le proteine citosoliche che si legano a una sequenza specifica situata nella molecola di RNA nelle cellule di mesotelioma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA, ad esempio se una proteina legante l'RNA prevista può legare l'adenosina o una sequenza ricca di uridina in un trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che integra la caratterizzazione funzionale di elementi stabilizzanti o destabilizzanti valutati mediante saggio reporter.A dimostrare questa tecnica sarà la dottoressa Jelena Kresoja-Rakic, una postdoc del mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, procurarsi cellule ACC-MESO-4 precedentemente preparate con una confluenza dall'80 al 90%. Aspirare il terreno, lavare le cellule con 15 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1X, o PBS, e aspirare il PBS.Quindi, aggiungere tre millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare il pallone di coltura a 37 gradi Celsius per tre minuti. Aggiungere sette millilitri di terreno RPMI-1640 integrato, raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri e farle girare a 200 volte g per cinque minuti. Quindi, aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare con 1,5 millilitri di PBS 1X.Quindi, trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Far girare nuovamente le celle a 500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante, risospendere il pellet di cella con 1,5 millilitri di PBS 1X ghiacciato e far girare le cellule a 500 volte g e quattro gradi Celsius per tre minuti.Scartare il surnatante e stimare il volume impacchettato del pellet cellulare confrontando il tubo contenente il pellet cellulare con un tubo da 1,5 millilitri con 10, 20, 50 e 100 microlitri di 1X PBS. Aggiungere 200 microlitri di reagente per l'estrazione citoplasmatica ghiacciato, o CER I, integrati con due microlitri di inibitore della proteinasi 1X. Agitare energicamente il pellet per 15 secondi e incubare la provetta sul ghiaccio per 10 minuti.Aggiungere 11 microlitri di reagente di estrazione citoplasmatica ghiacciato II, o CER II, agitando vigorosamente per cinque secondi e incubare la provetta per un minuto sul ghiaccio. Agitare energicamente il campione per cinque secondi e centrifugare la provetta a 16.000 volte g per cinque minuti. Trasferire il surnatante nel tubo pulito e pre-raffreddato con ghiaccio.Risospendere il pellet rimanente in 100 microlitri di reagente di estrazione nucleare ghiacciato, o NER, integrato con un microlitro di inibitore della proteinasi, e agitare energicamente per 15 secondi. Incubare il campione su ghiaccio per 40 minuti e agitare ogni 10 minuti per 15 secondi. Centrifugare la provetta a 16.000 volte g per 10 minuti.Trasferire il surnatante, che è la frazione proteica nucleare, in una provetta pulita e pre-raffreddata. Misurare immediatamente la concentrazione proteica utilizzando il metodo bicinchoninico. Quindi, preparare 25 microlitri di aliquote di estratti citosolici e nucleari.Congela queste aliquote mettendole in azoto liquido per cinque secondi e conservale direttamente a meno 80 gradi Celsius. Trasferire cinque microlitri di sonde di RNA da 10 micromolari in provette da microcentrifuga a parete sottile da 0,5 millilitri e incubarle in una macchina PCR a 85 gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.Per una singola reazione da 30 microlitri, aggiungere 10 microlitri di miscela precedentemente preparata alla provetta contenente RNA. Aggiungere con cura 15 microlitri di PEG 30% alla reazione e utilizzare una punta fresca per mescolare la reazione. Incubare la reazione per una notte a 16 gradi Celsius.Il giorno successivo, prepara i reagenti. Aggiungere 70 microlitri di acqua priva di nucleasi alle provette di reazione per la marcatura dell'RNA. Aggiungere 100 microlitri di alcol cloroformico-isoamilico, agitare brevemente e centrifugare il campione a 13.000 volte g per tre minuti.Rimuovere con cura solo la fase superiore. Evitare di toccare la fase inferiore. Trasferiscilo in una nuova provetta da 1,5 millilitri priva di nucleasi.Aggiungi 10 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari, un microlitro di glicogeno e 300 microlitri di etanolo ghiacciato al 100%. Posizionare il tubo a meno 20 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, centrifugare a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 300 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare di nuovo a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare completamente il surnatante e asciugare il pellet all'aria per 15 minuti.Risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Incubare l'RNA a 90 gradi Celsius per due minuti e metterlo sul ghiaccio. Posizionare l'RNA marcato sul ghiaccio durante la fase successiva del prelavaggio delle microsfere magnetiche di streptavidina.Prelavare 50 microlitri di perle magnetiche di streptavidina per 50 picomoli di RNA. Agitare il tubo con perle magnetiche di streptavidina per 15 secondi. Dopo aver agitato rapidamente, rimuovere 200 microlitri in una provetta Safe-Lock pulita da 1,5 millilitri utilizzando puntali per pipette tagliati.Quindi, posiziona il tubo su un supporto magnetico in modo che le perline si raccolgano sul lato del tubo e attendi un minuto. Rimuovere il liquido di risospensione. Per lavare le perline, rimuovere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 400 microlitri di idrossido di sodio 0,1 molare, soluzione di cloruro di sodio 0,05 molari e pipettare delicatamente su e giù più volte.Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e attendere un minuto. Quindi, raccogli il surnatante. Lavare le perle con 200 microlitri di cloruro di sodio da 100 millimolari e rimuovere il surnatante.Aggiungere 200 microlitri di tris da 20 millimolari, risospendere le microsfere mediante pipettaggio e posizionare la provetta sul supporto magnetico. Dopo un minuto, rimuovere il surnatante. Quindi, rimuovere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di tampone di cattura dell'RNA 1X e risospendere le perle magnetiche di streptavidina facendo un breve vortex.Rimuovere 50 microlitri di perle magnetiche di streptavidina e aggiungerle a ciascuna provetta di RNA etichettata utilizzando una punta di pipetta tagliata. Incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente su un rullo. Dopo che il tubo è rimasto sul supporto magnetico per un minuto, rimuovere il surnatante.Aggiungere 50 microlitri di tris da 20 millimolari alle perline e risospenderle. Quindi, posizionare i tubi nel supporto magnetico. Dopo un minuto, rimuovere il surnatante.Aggiungere 100 microlitri di tampone legante l'RNA proteico 1X alle perle e risospenderle. Quindi, riposizionare i tubi nel supporto magnetico. Una volta che i tubi sono rimasti nel supporto per un minuto, raccogliere il surnatante.Aggiungere 100 microlitri di master mix B, risospendere pipettando delicatamente su e giù ed evitare la formazione di bolle. Incubare le provette di reazione per 60 minuti a quattro gradi Celsius su un rullo. Passare alle fasi di lavaggio ed eluizione.Posizionare i tubi in un supporto magnetico, raccogliere il flusso e trasferirlo in un nuovo tubo. Pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio 1X sulle perline, risospendere delicatamente, rimetterle nel supporto, attendere un minuto ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.Aggiungere 40 microlitri di tampone di eluizione alle microsfere magnetiche, mescolare pipettando su e giù e incubare su un agitatore per provette. Posizionare le provette in un supporto magnetico, attendere un minuto e raccogliere il campione di eluato. Posizionare sul ghiaccio e utilizzare per l'analisi a valle.Per dimostrare la purezza delle frazioni nucleari/citosoliche, le proteine sono state analizzate mediante Western blot, che ha dimostrato che l'alfa-tubulina è stata rilevata solo nella frazione citosolica e la proteina PARP è stata rilevata solo nella frazione nucleare. L'eluato della sonda CALB2 a tre prime UTR ARE ha dimostrato il legame dell'R umano ed era assente nell'eluato della sonda mutante e della sonda RNA non correlata, che lega la proteina ferro-responsiva. Per dimostrare ulteriormente la specificità tra l'UTR a tre primi CALB e l'R umano, la membrana è stata sondata con anticorpo anti-mesotelina e tutti e tre i campioni di eluato non hanno mostrato alcuna presenza di mesotelina, indicando che il motivo ARE stabilizzante all'interno dell'UTR a tre primi CALB2 può legare specificamente la proteina R umana.La colorazione Coomassie del gel mostra che quantità uguali di proteine sono state utilizzate per incubare con le tre diverse sonde di RNA. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un metodo aggiuntivo incentrato sulla proteina, come l'immunoprecipitazione di una data proteina, al fine di affrontare ulteriori questioni, come quale sequenza si lega ad essa. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per esplorare i possibili partner interagenti di uno specifico RNA.

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Un ostacolo importante per le analisi biochimiche dei ribosomi contenente nascente peptidil-tRNA è stata la presenza di ribosomi altri nei medesimi campioni, i ribosomi non coinvolti nella traduzione della sequenza di mRNA specifico oggetto di analisi. Abbiamo sviluppato una metodologia semplice per purificare, esclusivamente, i ribosomi contenente il nascente peptidil-tRNA di interesse.

Isolamento dei ribosomi Tradurre contenenti peptidil-tRNA per le analisi funzionali e strutturali

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con...

Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

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Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

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Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma (Video) | JoVE Journal

Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

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