Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma
25 aprile 2018
Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di catturare le proteine citosoliche che si legano a una sequenza specifica situata nella molecola di RNA nelle cellule di mesotelioma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA, ad esempio se una proteina legante l'RNA prevista può legare l'adenosina o una sequenza ricca di uridina in un trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che integra la caratterizzazione funzionale di elementi stabilizzanti o destabilizzanti valutati mediante saggio reporter.
A dimostrare questa tecnica sarà la dottoressa Jelena Kresoja-Rakic, una postdoc del mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, procurarsi cellule ACC-MESO-4 precedentemente preparate con una confluenza dall'80 al 90%. Aspirare il terreno, lavare le cellule con 15 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1X, o PBS, e aspirare il PBS.
Quindi, aggiungere tre millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare il pallone di coltura a 37 gradi Celsius per tre minuti. Aggiungere sette millilitri di terreno RPMI-1640 integrato, raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri e farle girare a 200 volte g per cinque minuti. Quindi, aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare con 1,5 millilitri di PBS 1X.
Quindi, trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Far girare nuovamente le celle a 500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante, risospendere il pellet di cella con 1,5 millilitri di PBS 1X ghiacciato e far girare le cellule a 500 volte g e quattro gradi Celsius per tre minuti.
Scartare il surnatante e stimare il volume impacchettato del pellet cellulare confrontando il tubo contenente il pellet cellulare con un tubo da 1,5 millilitri con 10, 20, 50 e 100 microlitri di 1X PBS. Aggiungere 200 microlitri di reagente per l'estrazione citoplasmatica ghiacciato, o CER I, integrati con due microlitri di inibitore della proteinasi 1X. Agitare energicamente il pellet per 15 secondi e incubare la provetta sul ghiaccio per 10 minuti.
Aggiungere 11 microlitri di reagente di estrazione citoplasmatica ghiacciato II, o CER II, agitando vigorosamente per cinque secondi e incubare la provetta per un minuto sul ghiaccio. Agitare energicamente il campione per cinque secondi e centrifugare la provetta a 16.000 volte g per cinque minuti. Trasferire il surnatante nel tubo pulito e pre-raffreddato con ghiaccio.
Risospendere il pellet rimanente in 100 microlitri di reagente di estrazione nucleare ghiacciato, o NER, integrato con un microlitro di inibitore della proteinasi, e agitare energicamente per 15 secondi. Incubare il campione su ghiaccio per 40 minuti e agitare ogni 10 minuti per 15 secondi. Centrifugare la provetta a 16.000 volte g per 10 minuti.
Trasferire il surnatante, che è la frazione proteica nucleare, in una provetta pulita e pre-raffreddata. Misurare immediatamente la concentrazione proteica utilizzando il metodo bicinchoninico. Quindi, preparare 25 microlitri di aliquote di estratti citosolici e nucleari.
Congela queste aliquote mettendole in azoto liquido per cinque secondi e conservale direttamente a meno 80 gradi Celsius. Trasferire cinque microlitri di sonde di RNA da 10 micromolari in provette da microcentrifuga a parete sottile da 0,5 millilitri e incubarle in una macchina PCR a 85 gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.
Per una singola reazione da 30 microlitri, aggiungere 10 microlitri di miscela precedentemente preparata alla provetta contenente RNA. Aggiungere con cura 15 microlitri di PEG 30% alla reazione e utilizzare una punta fresca per mescolare la reazione. Incubare la reazione per una notte a 16 gradi Celsius.
Il giorno successivo, prepara i reagenti. Aggiungere 70 microlitri di acqua priva di nucleasi alle provette di reazione per la marcatura dell'RNA. Aggiungere 100 microlitri di alcol cloroformico-isoamilico, agitare brevemente e centrifugare il campione a 13.000 volte g per tre minuti.
Rimuovere con cura solo la fase superiore. Evitare di toccare la fase inferiore. Trasferiscilo in una nuova provetta da 1,5 millilitri priva di nucleasi.
Aggiungi 10 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari, un microlitro di glicogeno e 300 microlitri di etanolo ghiacciato al 100%. Posizionare il tubo a meno 20 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, centrifugare a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 300 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare di nuovo a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare completamente il surnatante e asciugare il pellet all'aria per 15 minuti.
Risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Incubare l'RNA a 90 gradi Celsius per due minuti e metterlo sul ghiaccio. Posizionare l'RNA marcato sul ghiaccio durante la fase successiva del prelavaggio delle microsfere magnetiche di streptavidina.
Prelavare 50 microlitri di perle magnetiche di streptavidina per 50 picomoli di RNA. Agitare il tubo con perle magnetiche di streptavidina per 15 secondi. Dopo aver agitato rapidamente, rimuovere 200 microlitri in una provetta Safe-Lock pulita da 1,5 millilitri utilizzando puntali per pipette tagliati.
Quindi, posiziona il tubo su un supporto magnetico in modo che le perline si raccolgano sul lato del tubo e attendi un minuto. Rimuovere il liquido di risospensione. Per lavare le perline, rimuovere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 400 microlitri di idrossido di sodio 0,1 molare, soluzione di cloruro di sodio 0,05 molari e pipettare delicatamente su e giù più volte.
Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e attendere un minuto. Quindi, raccogli il surnatante. Lavare le perle con 200 microlitri di cloruro di sodio da 100 millimolari e rimuovere il surnatante.
Aggiungere 200 microlitri di tris da 20 millimolari, risospendere le microsfere mediante pipettaggio e posizionare la provetta sul supporto magnetico. Dopo un minuto, rimuovere il surnatante. Quindi, rimuovere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di tampone di cattura dell'RNA 1X e risospendere le perle magnetiche di streptavidina facendo un breve vortex.
Rimuovere 50 microlitri di perle magnetiche di streptavidina e aggiungerle a ciascuna provetta di RNA etichettata utilizzando una punta di pipetta tagliata. Incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente su un rullo. Dopo che il tubo è rimasto sul supporto magnetico per un minuto, rimuovere il surnatante.
Aggiungere 50 microlitri di tris da 20 millimolari alle perline e risospenderle. Quindi, posizionare i tubi nel supporto magnetico. Dopo un minuto, rimuovere il surnatante.
Aggiungere 100 microlitri di tampone legante l'RNA proteico 1X alle perle e risospenderle. Quindi, riposizionare i tubi nel supporto magnetico. Una volta che i tubi sono rimasti nel supporto per un minuto, raccogliere il surnatante.
Aggiungere 100 microlitri di master mix B, risospendere pipettando delicatamente su e giù ed evitare la formazione di bolle. Incubare le provette di reazione per 60 minuti a quattro gradi Celsius su un rullo. Passare alle fasi di lavaggio ed eluizione.
Posizionare i tubi in un supporto magnetico, raccogliere il flusso e trasferirlo in un nuovo tubo. Pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio 1X sulle perline, risospendere delicatamente, rimetterle nel supporto, attendere un minuto ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.
Aggiungere 40 microlitri di tampone di eluizione alle microsfere magnetiche, mescolare pipettando su e giù e incubare su un agitatore per provette. Posizionare le provette in un supporto magnetico, attendere un minuto e raccogliere il campione di eluato. Posizionare sul ghiaccio e utilizzare per l'analisi a valle.
Per dimostrare la purezza delle frazioni nucleari/citosoliche, le proteine sono state analizzate mediante Western blot, che ha dimostrato che l'alfa-tubulina è stata rilevata solo nella frazione citosolica e la proteina PARP è stata rilevata solo nella frazione nucleare. L'eluato della sonda CALB2 a tre prime UTR ARE ha dimostrato il legame dell'R umano ed era assente nell'eluato della sonda mutante e della sonda RNA non correlata, che lega la proteina ferro-responsiva. Per dimostrare ulteriormente la specificità tra l'UTR a tre primi CALB e l'R umano, la membrana è stata sondata con anticorpo anti-mesotelina e tutti e tre i campioni di eluato non hanno mostrato alcuna presenza di mesotelina, indicando che il motivo ARE stabilizzante all'interno dell'UTR a tre primi CALB2 può legare specificamente la proteina R umana.
La colorazione Coomassie del gel mostra che quantità uguali di proteine sono state utilizzate per incubare con le tre diverse sonde di RNA. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un metodo aggiuntivo incentrato sulla proteina, come l'immunoprecipitazione di una data proteina, al fine di affrontare ulteriori questioni, come quale sequenza si lega ad essa. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per esplorare i possibili partner interagenti di uno specifico RNA.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per isolare proteine citosoliche che si legano a sequenze specifiche di RNA in cellule di mesotelioma. La tecnica utilizza l'etichettatura con desthiobiotina di un oligonucleotide di RNA sintetico contenente un motivo ricco di adenina (ARE), facilitando lo studio delle proteine leganti l'RNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- biologia dell'RNA
- interazioni proteina-RNA
- ricerca sul mesotelioma
Sfondo
- Comprendere le proteine leganti l'RNA è fondamentale per chiarire la biologia dell'RNA.
- Gli elementi ricchi di adenina (ARE) svolgono un ruolo importante nella regolazione della stabilità dell'mRNA.
- La caratterizzazione funzionale degli elementi di RNA può essere migliorata mediante questo metodo.
- I metodi precedenti potrebbero non mirare specificamente alle proteine di interesse.
Scopo dello studio
- Isolare e identificare proteine citosoliche che si legano a sequenze specifiche di RNA.
- Studiare le capacità di legame di proteine leganti l'RNA precedentemente previste.
- Complementare i metodi esistenti per lo studio della stabilità e delle interazioni dell'RNA.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di cellule ACC-MESO-4 al 80-90% di confluenza.
- Lavaggio delle cellule con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS).
- Etichettatura degli oligo di RNA con destiobiotina per il legame specifico.
- Valutazione delle interazioni proteiche con l'RNA etichettato.
Risultati principali
- Acquisizione riuscita di proteine citosoliche che si legano al motivo ARE.
- Convalida del legame di proteine leganti l'RNA predette.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica negli studi di biologia dell'RNA.
- Potenziali applicazioni nella comprensione dei meccanismi di stabilità dell'RNA.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per lo studio delle interazioni RNA-proteina.
- Migliora la comprensione della biologia dell'RNA nelle cellule di mesotelioma.
- Studi futuri potranno basarsi su questa tecnica per esplorare altri elementi dell'RNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Documento
Questo metodo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di convalidare le interazioni RNA-proteina in un contesto cellulare rilevante per la malattia, supportando la riduzione del rischio del bersaglio nella scoperta di farmaci oncologici. Catturando le proteine citosoliche che si legano a specifici motivi dell'RNA in cellule di mesotelioma, fornisce informazioni meccanicistiche sulla regolazione post-trascrizionale rilevante per la stabilità dell'mRNA e il controllo traduttivo. L'approccio integra saggi funzionali, aumentando la sicurezza predittiva nei flussi di lavoro di convalida precoce del bersaglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni tra proteine leganti l'RNA e sequenze specifiche, come elementi ricchi di adenina, in modelli rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Utilizza estratti citosolici di cellule di mesotelioma per mantenere la rilevanza fisiologica e preservare i complessi proteici nativi.
- Valore predittivo: Supporta la verifica di ipotesi su proteine leganti l'RNA predette, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili di eluizione quantitativi che distinguono il legame specifico all'RNA dai controlli non specifici o delle sonde mutanti.
- Valore operativo: Sfrutta il legame destiobiotina-streptavidina reversibile per eluire complessi proteici attivi in condizioni quasi fisiologiche.
- Prontezza del saggio: Produce frazioni proteiche purificate adatte ad applicazioni successive come il Western blotting o la spettrometria di massa.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la funzione del motivo dell'RNA al legame proteico nel mesotelioma, un modello rilevante per il cancro del polmone e le neoplasie pleuriche.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce se elementi dell'RNA stabilizzanti o destabilizzanti esercitano i loro effetti attraverso il reclutamento specifico di proteine.
- Allineamento Preclinico: Permette studi successivi come l'immunoprecipitazione per mappare i siti di legame o valutare le conseguenze funzionali.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio dopo la previsione bioinformatica iniziale e prima dell'ottimizzazione del composto leader, in particolare per terapie mirate all'RNA o che modulano l'RNA.
- Biologia della scoperta: Verifica se le proteine leganti l'RNA predette interagiscono con sequenze di RNA specifiche, chiarificando il meccanismo d'azione.
- Screening: Consente il recupero riproducibile e quantitativo di proteine da sonde di RNA definite, permettendo il confronto tra mutanti o competitori.
- Analisi: Produce eluati idonei per analisi mediante Western blot o approcci proteomici, fornendo output misurabili per la valutazione dell'interazione con il bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Collega la funzione di elementi di RNA all'interazione con proteine in un sistema rilevante per il cancro, supportando ipotesi su biomarcatori o meccanismi.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a diverse sequenze di RNA e tipi cellulari, rendendolo una piattaforma riutilizzabile per lo screening di proteine leganti l'RNA.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo confermando il legame diretto RNA-proteina in un contesto di lisato nativo.
- Valore operativo: Utilizza un protocollo basato su microsferette magnetiche con eluizione reversibile, minimizzando la denaturazione delle proteine e preservandone l'attività.
- Valore strategico: Riduce i falsi positivi nell'identificazione delle proteine leganti l'RNA, migliorando l'efficienza degli studi funzionali successivi.
- Impatto sul portafoglio: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze meccanicistiche sui meccanismi regolatori mediati dall'RNA nei modelli di malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella frazionamento citosolico/nucleare e nella manipolazione dell'RNA per mantenere l'integrità del campione.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per la separazione magnetica e a centrifughi compatibili con camera fredda per la conservazione dei complessi nativi.
- Necessita di etichettatura standardizzata delle sonde di RNA e di controlli di qualità per garantire un'incorporazione costante del desthiobiotina.
- Richiede l'ottimizzazione delle condizioni di legame e dei lavaggi per ridurre al minimo le interazioni non specifiche preservando al contempo i complessi specifici.
- Limitato a condizioni in vitro; non riesce a catturare interazioni transitorie o vincolate spazialmente presenti nelle cellule vive.
