Name: Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri come generare mutazioni puntiformi genomiche in C. elegans utilizzando ribonucleoproteine CRISPR/Cas9 e templati di riparazione omologa. Questo metodo rapido consente studi funzionali sulle varianti genetiche nel controllo regolatorio endogeno.

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Tutti cura degli animali e procedure sperimentali seguite le linee guida dal National Institutes of Health e istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università del Michigan. Utilizzare soluzioni RNasi-free e dispensare consigli in tutto il protocollo. Pulire l'area di lavoro, le pipette, tubi e centrifuga con soluzione di decontaminazione di RNAsi seguendo le linee guida del produttore (Vedi Materiali tavolo).
1. sgRNA selezione destinazione
<ol><li>Utilizzando un browser web, aprire la pagina Web: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60 paia di basi (bp) di sequenza che fiancheggia la modifica desiderata di interesse di ingresso (cioè 30 bp 5' e 3' di modifica desiderata).</li>
		<li>Dal menu a discesa, selezionare il genoma di Caenorhabditis elegans .</li>
		<li>Selezionare il motivo adiacente Protospacer (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) dal menu a discesa.</li>
		<li>Fare clic su Invia. Nella pagina dei risultati, scegliere la sequenza di destinazione n superiore più vicina per la modifica di interesse. Se esistono siti bersaglio adatto all'interno della sequenza di input bp 60 fiancheggianti, espandere la sequenza di query fino a 100 bp (cioè 50 bp entrambi i lati del desiderato modificare).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Da una fonte disponibile, ad esempio synthego, ottenere un 20-mer destinazione sgRNA con le seguenti specifiche: 3 nmol; senza modifiche.</li>
	<li>Al ricevimento, centrifugare sgRNA liofilizzato contenente tubo a > 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Aggiungere 60 µ l di TE privo di nucleasi alla provetta e Risospendere delicatamente pipettando su e giù per 15 - 20 volte superiori usando una pipetta P200. La concentrazione finale è di 50 µM.</li>
</ol>2. disegno del modello di riparazione omologia-regia
<ol><li>Progettare un modello HDR ssODN contenente: 1) la mutazione di interesse, 2) un sito unico endonucleasi di restrizione nel telaio, 3) una mutazione silenziosa di uno o entrambi del Gs all'interno della sequenza di NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' omologia braccia che fiancheggiano la prima e l'ultima mutazione. (Figura 1) 9 , 10.<ol>
<li>Se non è possibile mutazione della sequenza NGG PAM, introdurre 5-6 mutazioni silenti all'interno della sequenza di riconoscimento di destinazione sgRNA per prevenire sgRNA-mediata scissione del modello HDR ssODN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Da una fonte disponibile, ad esempio idtdna, ottenere un "oligonucleotide Ultramer DNA" con i seguenti parametri: scala: 4 nmol; Formulazione: Nessuno; Purificazione: Standard desalificazione.</li>
	<li>Al ricevimento, centrifugare ssODN liofilizzato contenente tubo a > 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Risospendere delicatamente ssODN ad una concentrazione finale di 100 µM in ddH nucleasi-free2O pipettando su e giù per 15 - 20 volte superiori usando una pipetta P200.</li>
</ol>3. design genotipizzazione primer
<ol><li>Progettare un set che fiancheggiano la modificazione del genoma per generare un ~ 400-700 bp PCR amplicone11di primer.</li>
	<li>Ottimizzare le condizioni di ciclismo di PCR per produrre un singolo e specifico amplicone11.</li>
</ol>4. preparare la miscela di iniezione
<ol><li>Centrifugare i reagenti di tabella 1 alla massima velocità per 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Nell'ordine elencato, è necessario aggiungere tabella 1 reagenti ad un tubo PCR nucleasi-free.</li>
	<li>Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù 10 volte con una pipetta P20.</li>
	<li>Incubare il mix di iniezione per 10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. iniezione protocollo
<ol><li>Carico iniezione micropipetta con circa la metà dell'iniezione mescolare12. Salvare restanti mix di iniezione nel caso in cui l'ago per iniezione zoccoli o si rompe.</li>
	<li>Rompere una micropipetta punta affinché p.s.i. ~ 20-30 produce una graduale che scorre soluzione12. Nota: Più grande diametro consigli negativamente incidere sulla salute degli animali e diminuiscono il rendimento di progenie di F1 .</li>
	<li>Iniettare 10-15 giovane adulto worm in entrambi i bracci gonadici possibilmente12. In caso contrario, l'iniezione in un braccio gonadico è sufficiente.</li>
	<li>Permettono animali iniettati (P0) recuperare per 1-2 h a temperatura ambiente su un piatto di media (NGM) crescita del nematode OP50-seminato 35 mm. Successivamente, singoli animali di0 P iniettati a piastre NGM individuali OP50-seminato 35 mm utilizzando una vite senza fine del legare di platino pick12.</li>
</ol>6. schermo P0 piastre e singolo mCherry(+) F1s
<ol><li>Post-iniezione di due giorni, identificare piastre0 P contenente progenie di1 F esprimendo mCherry nella faringe utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 1, giorno 2 - 3). Scegliere piastre0 tre P che contengono la maggior parte degli animali1 mCherry(+) F.</li>
	<li>Da ciascuna delle tre selezionate piastre0 P, scegliere singola 8-12 mCherry(+) F1 animali per un totale di 24-36 mCherry(+) F1s utilizzando una vite senza fine (Figura 1, giorno 2 - 3). Nota: mCherry(-) animali possono anche essere individuati da queste piastre0 P, ma la probabilità di identificare correttamente modificato gli animali è molto più basso (Figura 2A).</li>
	<li>Consentire singoli F1s per note e deporre le uova per 1-2 giorni a temperatura ambiente.</li>
</ol>7. singolo verme PCR e genotipizzazione
<ol><li>Dopo 1-2 giorni di deposizione delle uova, è possibile trasferire il F1s nei tappi individuali di tubo del striscia PCR contenente 7 µ l di tampone di lisi Worm usando un plettro di vite senza fine (tabella 2, Figura 1, giorno 4-5).</li>
	<li>Provette per PCR centrifuga alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per portare gli animali alla parte inferiore del tubo e congelamento tubi a-80 ° C per 1 h. Nota: Vermi possono essere memorizzati a-80 ° C a tempo indeterminato.</li>
	<li>Lyse vermi congelati in un termociclatore usando il seguente programma: 60 ° C per 60 min, 95 ° C per 15 min, 4 ° C tenere.</li>
	<li>Set-up PCR mastermix come mostrato nella tabella 3.</li>
	<li>µ L 21 di PCR mastermix nelle provette PCR puliti e quindi aggiungere 4 µ l di lisi verme dal passaggio 3. Mescolare bene usando una pipetta ed eseguire il programma PCR seguendo le indicazioni del produttore (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Purificare le reazioni di PCR usando un kit DNA pulito e concentrato, seguendo le istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo). Eluire il DNA aggiungendo 10 µ l acqua nella colonna di selezione.</li>
	<li>Set-up degli enzimi di limitazione mastermix come illustrato nella tabella 4.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di mastermix l'enzima di restrizione ad ogni reazione di PCR puliti e incubare per 1-2 h a 37 ° C13.</li>
	<li>Separato digerito i prodotti di PCR su un gel di agarosio 1.5% a 120 V utilizzando 1. tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) x14.</li>
</ol>8. identificazione e verifica di sequenza degli animali modificati
<ol><li>Esaminare campioni di enzima digerito per la presenza di bande che indicano il potenziale modificato animali14 (Figura 1, giorno 4-5). Nota: Caricare un controllo N2 per identificare potenziali mutazioni indel che possono essere osservate come turni in taglia e/o digestione degli enzimi di restrizione di imprevisti e complessi disegni a strisce.</li>
	<li>Dopo aver identificato potenziali animali modificati, utilizzare i rimanenti 3 µ l di lisi di vite senza fine e ripetere la reazione di PCR. Non pulire o degli enzimi di limitazione digerire la reazione di PCR dopo avere completato il programma. Caricare la reazione di PCR su un gel di agarosio all'1%, separato ed estrarre la band utilizzando un kit di estrazione gel15 (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Gel di Sanger sequenza16 estratto il DNA utilizzando il primer di F1 per identificare correttamente modificati animali (Figura 1A) Nota: Heterozygote letture conterrà sovrapposti picchi a causa della presenza di tipo selvatico e ingegnerizzato allele.</li>
	<li>Per ottenere animali omozigoti da verificato eterozigoti modificati animali, singoli 8-122 animali ed eseguire i passaggi 7-8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
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<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
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<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Ringraziamo i membri del laboratorio Beg per la lettura critica di questo manoscritto. Ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Ricerca in laboratorio Beg è sostenuta da sovvenzioni dal NIH (R01 NS094678) e Muscular Dystrophy Association (MDA382300) a A.A.B.

Il sistema di CRISPR-Cas9 è uno strumento potente ed efficace per proprio modificando il genoma degli organismi modello. Qui, dimostriamo che chimerico sgRNAs20 accoppiato con ssODN HDR modelli permettono la generazione altamente efficiente di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. D'importanza, dimostriamo che consegna RNP produce alta efficienza di editing quando fluorescenza viene utilizzato come un indicatore di co-selezione, mettendo in evidenza la facilità e l'affidabilità della...

I recenti progressi tecnologici hanno radicalmente trasformato e accelerato la possibilità al proprio genoma di ingegnere. In particolare, il sistema CRISPR-Cas9, che si basa sull'endonucleasi di RNA-guida Cas9 per indurre una rottura del doppio filamento (DSB) vicino alla sequenza di destinazione di interesse, è stato ampiamente utilizzato per progettare accuratamente il genoma della maggior parte degli organismi di modello utilizzato in ricerca biomedica1,2,3,4. Significativamente, l'uso di CRISPR-Cas9 ha sbloccato l'editing genomico anche in specie difficili come elegans del c.5. Indipendentemente dalla specie, generando mutazioni puntiformi con il genoma di CRISPR-Cas9 basato sistema di editing si basa su tre componenti principali: 1) Cas9 endonucleasi, 2) una singola guida RNA (sgRNA) che indirizza l'endonucleasi Cas9 a una sequenza di destinazione e 3) un utente progettato modello di omologia-regia di riparazione (HDR) contenente la modifica desiderata in/he / di interesse2.
Ci sono diversi metodi che possono essere utilizzati per introdurre il targeting sgRNA e Cas9 nucleasi nelle cellule incluse plasmide e RNA virale basato consegna metodi6. Recentemente, consegna diretta di pre-complessati sgRNA-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) è emerso come uno strumento potente ed efficace nel genoma basati su CRISPR-Cas97di editing. La consegna diretta di pre-complessati CRISPR-Cas9 RNP ha diversi vantaggi distinti, vale a dire: 1) RNP ignorare la necessità di trascrizione cellulare e traduzione, 2) RNP sono rapidamente eliminato, che può aumentare la specificità riducendo il tempo disponibile per fuori bersaglio fenditura e 3) RNP non contenere nessun elementi di DNA/RNA estranei che aggira l'introduzione delle sequenze non-nativi nel genoma ospite attraverso integrazione casuale. Insieme, questi attributi probabili forniscono una breve raffica di on target CRISPR editing riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio.
Descriviamo un protocollo semplice ed efficace per introdurre cambiamenti genomici site-specific in c. elegans. Questo protocollo include destinazione sgRNA e disegno del modello HDR singolo incagliato oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione per l'identificazione inequivocabile degli animali correttamente modificati. Utilizzando questa strategia, non solo possono essere recuperate le modifiche desiderate e site-specifiche, ma altre mutazioni indel non specifici possono anche essere recuperati. Così, la nostra strategia consente la generazione di una serie allelica usando una strategia unica, dove entrambi allelica mono, bi-allelica e indel mutanti possono essere generati nella generazione1 F.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>chimerico sgRNA</td></tr><tr><td>Nucleasi-free TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>fornito con il kit sgRNA Kit EZ Acqua</td><td></td></tr><tr><td>senza nucleasi</td><td>Synthego Inc.</td><td>fornito con il kit sgRNA Kit EZ</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9 proteina</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmide</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Pulito & Concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Kit di recupero del DNA su gel</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start 2X Master Mix ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette in vetro borosilicato di vetro</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1,0 mm. ID: 0,78 mm</td></tr><tr><td>Trizma cloridrato</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione RNaseZap</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

un veloce e facile pipeline per generazione di mutanti di punto genomic in c. elegans utilizzando crispr/cas9 ribonucleoproteine

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Si ripete regolarmente sparpagliata palindromica cluster (CRISPR) - CRISPR - associati proteina 9 (Cas9) sistema di difesa immunitario adattivo prokaryotic ha stato cooptato come un potente strumento per l'ingegneria precisa del genoma eucariotico. Qui, presentiamo un metodo rapido e semplice utilizzando RNA chimerico guida singola (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) per la generazione efficiente e precisa di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. Descriviamo una pipeline per selezione target sgRNA, disegno del modello di omologia-regia di riparazione (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione che consente l'identificazione robusto e rapido degli animali correttamente modificati. Il nostro approccio non solo consente la facile generazione e l'identificazione del punto desiderato genomico animali mutanti, ma facilita anche la rilevazione di altri alleli complessi indel in circa 4-5 giorni con alta efficienza e un carico di lavoro ridotto lo screening.

Mutazioni in umano superossido dismutasi 1 (SOD1) rappresentano ~ 10-20% di sclerosi laterale amiotrofica familiare, una devastante malattia neurodegenerativa che conduce invariabilmente a paralisi e morte17. SOD-1 umana è una proteina evolutivamente conservata condivisione di somiglianza di identità e il 70% di 55% con la proteina SOD-1 c. elegans (Figura 1B). Per dimostrare la semplicità, la fattibilità e l'efficaci...

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare mutazioni puntiformi genomiche in C.Elegans utilizzando modelli di riparazione diretti per omologia di oligonucleotidi a singolo filamento e ribonucleoproteine CRISPR/Cas9. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come determinare le conseguenze patologiche della varianza genetica associata alle malattie neurodegenerative. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le mutazioni puntiformi genomiche possono essere generate rapidamente, consentendo lo studio funzionale della varianza genetica nel contesto del controllo regolatorio endoginoso, evitando i caveat della sovraespressione proteica.Per effettuare la selezione del bersaglio dell'sgRNA, apri la pagina web mostrata qui. Inserire circa 60 coppie di basi di sequenza che fiancheggiano la modifica desiderata di interesse. Dopo aver selezionato il genoma di C.Elegans e il motivo adiacente del protospaziatore in base al protocollo di testo, fare clic su Invia.Nella pagina dei risultati, scegli la sequenza di destinazione più vicina alla modifica di interesse. Al ricevimento, centrifugare la provetta contenente sgRNA liofilizzato a temperatura ambiente e almeno 12.000 g per un minuto. Aggiungere 60 microlitri di TE privo di nucleasi alla provetta e utilizzare una pipetta p200 per risospendere delicatamente pipettando su e giù da 15 a 20 volte.La concentrazione finale è di 50 micromolari. Progettare un modello HDR ssODN contenente la mutazione di interesse, un sito endonucleasico unico nel suo genere, una mutazione silente di uno o entrambi i G all'interno della sequenza NGG PAM e 50 coppie di basi, cinque bracci di omologia primi e tre primi che fiancheggiano la prima e l'ultima mutazione. Al ricevimento, centrifugare la provetta liofilizzata contenente ssODN come appena dimostrato, quindi utilizzare DD H20 privo di nucleasi per risospendere delicatamente l'ssODN a una concentrazione finale di 100 micromolari.Per preparare una miscela per iniezione, centrifugare i reagenti qui mostrati alla massima velocità e quattro gradi Celsius per due minuti. Nell'ordine indicato, aggiungere i reagenti a una provetta PCR priva di nucleasi. Quindi utilizzare una pipetta p20 per miscelare delicatamente e accuratamente il contenuto.Incubare la provetta a temperatura ambiente per dieci minuti. Dopo aver iniettato gli animali P0 secondo il protocollo di testo, lasciarli recuperare a temperatura ambiente per una o due ore su una piastra NGM da 35 millimetri seminata OP50. Successivamente, utilizzando un plettro a vite senza fine a filo di platino, trasferire singoli animali P0 iniettati in singole piastre NGM da 35 millimetri seminate in OP50.Due giorni dopo l'iniezione, utilizzare un microscopio a fluorescenza per identificare le piastre P0 contenenti progenie F1, che esprime mCherry nella faringe. Scegli tre piastre P0 che contengono il maggior numero di animali F1 positivi mCherry. Da ciascuna delle tre piastre P0 selezionate, utilizzare un verme per isolare da otto a 12 mCherry F1 animali per un totale da 24 a 36 mCherry F1 positivi.Lasciare che i singoli F1 si autofecondino e depongano le uova a temperatura ambiente per uno o due giorni. Dopo uno o due giorni di deposizione delle uova, utilizzare un plettro a vite senza fine per trasferire gli F1 in singoli tappi di provette per PCR contenenti sette microlitri di tampone per la lisi dei vermi. Centrifugare le provette per PCR alla massima velocità e temperatura ambiente per un minuto per portare gli animali sul fondo della provetta.Quindi congelare i tubi a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, lisare i vermi congelati in un termociclatore utilizzando il seguente programma. Quindi impostare una miscela master PCR come mostrato in questa tabella.Aggiungere 21 microlitri di miscela master PCR in provette PCR pulite, quindi aggiungere quattro microlitri della provetta per lisi a vite senza fine e mescolare bene pipettando. Quindi eseguire il programma PCR seguendo le linee guida del produttore. Purificare le reazioni della PCR utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore.Quindi diluire il DNA aggiungendo 10 microlitri di acqua alla colonna di centrifuga. Dopo aver impostato la miscela master dell'enzima di restrizione, aggiungere 10 microlitri a ciascuna reazione PCR pulita e incubare le provette a 37 gradi Celsius per una o due ore. Quindi separare i prodotti PCR digeriti su un gel di agarosio all'1,5% utilizzando 1x tampone TAE a 120 volt.Esaminare i campioni digeriti con enzimi per la presenza di bande che indicano potenziali animali modificati. Dopo aver identificato i potenziali animali modificati, utilizzare i restanti tre microlitri di lisi dei vermi e ripetere la PCR. Quindi caricare immediatamente le reazioni completate su un gel di agarosio all'1% prima di separare ed estrarre la banda utilizzando un kit di estrazione del gel.Utilizzando il primer F1, eseguire il sequenziamento Sanger per identificare gli animali correttamente modificati. Infine per ottenere animali omozigoti da animali modificati eterozigoti verificati, singoli da otto a 12 animali F2 ed eseguire la genotipizzazione e la verifica della sequenza secondo il protocollo di testo. Per dimostrare la semplicità, la fattibilità e l'efficienza dell'approccio basato su RNP CRISPR/Cas9, il gene C.Elegans sod-1 è stato mirato a introdurre la variante umana G93a associata alla malattia nel genoma del verme.Questa immagine su gel mostra i risultati della genotipizzazione di 24 animali F1 positivi per mCherry. 10 contenevano modificazioni monoalliliche o bialliliche, 10 erano wild type, tre erano potenziali indels e uno era un fallimento della PCR. Per dimostrare che il marcatore fluorescente mCherry arricchisce per la modifica del genoma, sono stati scelti otto animali mCherry negativi da ciascuna delle tre piastre P0.Solo un animale è stato modificato correttamente, mentre 23 erano di tipo selvatico. Questa figura mostra il cromatogramma del prodotto PCR estratto su gel a lunghezza intera, dimostrando che le precise modifiche nucleotidiche progettate nel modello ssODN HDR sono state fedelmente incorporate nel genoma di questo animale F1 omozigote. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per generare e identificare mutazioni puntiformi genomiche in C.Elegans in quattro o cinque giorni, se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare reagenti e tecniche prive di nuclei, tra cui acqua priva di RNasi, puntali per pipette con filtro e guanti. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti saggi cellulari, molecolari e comportamentali al fine di studiare i fenotipi che possono associarsi alla mutazione di interesse. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come generare con precisione mutazioni puntiformi genomiche in C.Elegans utilizzando RNasi chimerica a guida singola e proteine ribonucleari CRISPR/Cas9.

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