Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare mutazioni puntiformi genomiche in C.Elegans utilizzando modelli di riparazione diretti per omologia di oligonucleotidi a singolo filamento e ribonucleoproteine CRISPR/Cas9. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come determinare le conseguenze patologiche della varianza genetica associata alle malattie neurodegenerative. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le mutazioni puntiformi genomiche possono essere generate rapidamente, consentendo lo studio funzionale della varianza genetica nel contesto del controllo regolatorio endoginoso, evitando i caveat della sovraespressione proteica.

Per effettuare la selezione del bersaglio dell'sgRNA, apri la pagina web mostrata qui. Inserire circa 60 coppie di basi di sequenza che fiancheggiano la modifica desiderata di interesse. Dopo aver selezionato il genoma di C.Elegans e il motivo adiacente del protospaziatore in base al protocollo di testo, fare clic su Invia.

Nella pagina dei risultati, scegli la sequenza di destinazione più vicina alla modifica di interesse. Al ricevimento, centrifugare la provetta contenente sgRNA liofilizzato a temperatura ambiente e almeno 12.000 g per un minuto. Aggiungere 60 microlitri di TE privo di nucleasi alla provetta e utilizzare una pipetta p200 per risospendere delicatamente pipettando su e giù da 15 a 20 volte.

La concentrazione finale è di 50 micromolari. Progettare un modello HDR ssODN contenente la mutazione di interesse, un sito endonucleasico unico nel suo genere, una mutazione silente di uno o entrambi i G all'interno della sequenza NGG PAM e 50 coppie di basi, cinque bracci di omologia primi e tre primi che fiancheggiano la prima e l'ultima mutazione. Al ricevimento, centrifugare la provetta liofilizzata contenente ssODN come appena dimostrato, quindi utilizzare DD H20 privo di nucleasi per risospendere delicatamente l'ssODN a una concentrazione finale di 100 micromolari.

Per preparare una miscela per iniezione, centrifugare i reagenti qui mostrati alla massima velocità e quattro gradi Celsius per due minuti. Nell'ordine indicato, aggiungere i reagenti a una provetta PCR priva di nucleasi. Quindi utilizzare una pipetta p20 per miscelare delicatamente e accuratamente il contenuto.

Incubare la provetta a temperatura ambiente per dieci minuti. Dopo aver iniettato gli animali P0 secondo il protocollo di testo, lasciarli recuperare a temperatura ambiente per una o due ore su una piastra NGM da 35 millimetri seminata OP50. Successivamente, utilizzando un plettro a vite senza fine a filo di platino, trasferire singoli animali P0 iniettati in singole piastre NGM da 35 millimetri seminate in OP50.

Due giorni dopo l'iniezione, utilizzare un microscopio a fluorescenza per identificare le piastre P0 contenenti progenie F1, che esprime mCherry nella faringe. Scegli tre piastre P0 che contengono il maggior numero di animali F1 positivi mCherry. Da ciascuna delle tre piastre P0 selezionate, utilizzare un verme per isolare da otto a 12 mCherry F1 animali per un totale da 24 a 36 mCherry F1 positivi.

Lasciare che i singoli F1 si autofecondino e depongano le uova a temperatura ambiente per uno o due giorni. Dopo uno o due giorni di deposizione delle uova, utilizzare un plettro a vite senza fine per trasferire gli F1 in singoli tappi di provette per PCR contenenti sette microlitri di tampone per la lisi dei vermi. Centrifugare le provette per PCR alla massima velocità e temperatura ambiente per un minuto per portare gli animali sul fondo della provetta.

Quindi congelare i tubi a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, lisare i vermi congelati in un termociclatore utilizzando il seguente programma. Quindi impostare una miscela master PCR come mostrato in questa tabella.

Aggiungere 21 microlitri di miscela master PCR in provette PCR pulite, quindi aggiungere quattro microlitri della provetta per lisi a vite senza fine e mescolare bene pipettando. Quindi eseguire il programma PCR seguendo le linee guida del produttore. Purificare le reazioni della PCR utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi diluire il DNA aggiungendo 10 microlitri di acqua alla colonna di centrifuga. Dopo aver impostato la miscela master dell'enzima di restrizione, aggiungere 10 microlitri a ciascuna reazione PCR pulita e incubare le provette a 37 gradi Celsius per una o due ore. Quindi separare i prodotti PCR digeriti su un gel di agarosio all'1,5% utilizzando 1x tampone TAE a 120 volt.

Esaminare i campioni digeriti con enzimi per la presenza di bande che indicano potenziali animali modificati. Dopo aver identificato i potenziali animali modificati, utilizzare i restanti tre microlitri di lisi dei vermi e ripetere la PCR. Quindi caricare immediatamente le reazioni completate su un gel di agarosio all'1% prima di separare ed estrarre la banda utilizzando un kit di estrazione del gel.

Utilizzando il primer F1, eseguire il sequenziamento Sanger per identificare gli animali correttamente modificati. Infine per ottenere animali omozigoti da animali modificati eterozigoti verificati, singoli da otto a 12 animali F2 ed eseguire la genotipizzazione e la verifica della sequenza secondo il protocollo di testo. Per dimostrare la semplicità, la fattibilità e l'efficienza dell'approccio basato su RNP CRISPR/Cas9, il gene C.Elegans sod-1 è stato mirato a introdurre la variante umana G93a associata alla malattia nel genoma del verme.

Questa immagine su gel mostra i risultati della genotipizzazione di 24 animali F1 positivi per mCherry. 10 contenevano modificazioni monoalliliche o bialliliche, 10 erano wild type, tre erano potenziali indels e uno era un fallimento della PCR. Per dimostrare che il marcatore fluorescente mCherry arricchisce per la modifica del genoma, sono stati scelti otto animali mCherry negativi da ciascuna delle tre piastre P0.

Solo un animale è stato modificato correttamente, mentre 23 erano di tipo selvatico. Questa figura mostra il cromatogramma del prodotto PCR estratto su gel a lunghezza intera, dimostrando che le precise modifiche nucleotidiche progettate nel modello ssODN HDR sono state fedelmente incorporate nel genoma di questo animale F1 omozigote. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per generare e identificare mutazioni puntiformi genomiche in C.Elegans in quattro o cinque giorni, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare reagenti e tecniche prive di nuclei, tra cui acqua priva di RNasi, puntali per pipette con filtro e guanti. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti saggi cellulari, molecolari e comportamentali al fine di studiare i fenotipi che possono associarsi alla mutazione di interesse. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come generare con precisione mutazioni puntiformi genomiche in C.Elegans utilizzando RNasi chimerica a guida singola e proteine ribonucleari CRISPR/Cas9.