Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi
10 maggio 2018
Toeprinting mira a misurare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi di inizio di traduzione con i ribosomi in una varietà di condizioni. Questo protocollo descrive un metodo per toeprinting RNA dei mammiferi e può essere usato per studiare traduzione cap-dipendente sia IRES-driven.
L'obiettivo generale di questa analisi dell'impronta delle dita dei piedi è osservare la formazione del complesso di inizio della traduzione sugli mRNA dei mammiferi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della traduzione dell'mRNA, come l'inizio della traduzione mediata da IRES. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può eseguire un'analisi dettagliata della formazione del complesso di inizio della traduzione su uno specifico mRNA.
Assemblare le reazioni di trascrizione per trascrivere l'RNA dai modelli di DNA amplificato con PCR, codificando l'RNA di XIAP IRES o i suoi mutanti. Quindi, aggiungi due unità di DNasi priva di RNasi per rimuovere il modello di DNA a ciascuna reazione di 20 microlitri di RNA. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, diluire l'RNA trattato con DNasi con acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 110 microlitri. Quindi, aggiungi 110 microlitri di fenolo acido per iniziare la purificazione dell'RNA. Agitare i campioni per cinque secondi e centrifugare a 20.000 x g per tre minuti a temperatura ambiente.
È fondamentale diluire l'RNA o il CDNA prima dell'estrazione del fenolo. Se il volume è troppo basso, sarà difficile recuperare fisicamente la fase acquosa e la resa finale sarà bassa. Quindi, trasferire con cura 100 microlitri di fase acquosa contenente RNA in una nuova provetta da microcentrifuga.
Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio 3 M, pH 5,5, e mescolare i campioni. Quindi, aggiungere tre volumi di etanolo al 100% per far precipitare l'RNA e far vorticare i campioni per cinque secondi. Incubare per una notte a 20 gradi Celsius.
Il giorno successivo, centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Quindi, lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e ripetere la centrifugazione. Aspirare con cura quanto più surnatante possibile senza rimuovere il pellet.
Quindi, asciugare il pellet all'aria per cinque-10 minuti. Risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Per iniziare il test di impronta delle dita, aggiungere 15 microlitri di lisato di reticolociti di coniglio non trattato con nucleasi a ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, che rappresentano l'RNA XIAP IRES wild-type e i suoi mutanti.
Aggiungere l'inibitore della RNasi, l'ATP e il GMP-PNP a ciascuna provetta. Incubare a 30 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aggiungere un microlitro del rispettivo RNA a ciascuna delle provette e incubare a 30 gradi Celsius per altri cinque minuti.
Durante il periodo di incubazione, aggiungere DTT e spermidina al tampone per l'impronta delle dita dei piedi. Quindi, aggiungere 22 microlitri di tampone per l'impronta delle dita dei piedi a ciascuna delle provette e incubare a 30 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di primer per la stampa delle dita dei piedi etichettato con colorante IR e incubare la reazione su ghiaccio per 10 minuti.
Successivamente, aggiungere due microlitri di dNTP, due microlitri di acetato di magnesio e un microlitro di trascrittasi inversa del virus della mieoloblastosi aviaria. Portare il volume finale a 50 microlitri con il tampone per l'impronta delle dita. Quindi, lasciare che l'estensione del primer avvenga per 45 minuti a 30 gradi Celsius.
È anche fondamentale aggiungere acetato di magnesio alla reazione di impronta delle dita, senza il quale la trascrittasi inversa non funzionerà in modo ottimale. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 250 microlitri di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico 25:24:1, pH 8,0, per iniziare la purificazione del cDNA.
Dopo aver agitato i campioni per cinque secondi, centrifugare i campioni a 20.000 x g a temperatura ambiente per tre minuti. Quindi, trasferire con cura la fase acquosa contenente il DNA in una nuova provetta da microcentrifuga. Quindi, aggiungi tre volumi di etanolo al 100% per far precipitare il DNA e vorticare per cinque secondi.
Incubare per una notte a 20 gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare le provette a 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Quindi, lavare il pellet di DNA con 500 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare quanto più surnatante possibile, facendo attenzione a non rimuovere il pellet. Quindi, asciugare il pellet all'aria per cinque-10 minuti. Sciogliere il pellet di DNA in sei microlitri di acqua priva di nucleasi.
Quindi, aggiungi tre microlitri di colorante per il caricamento della formammide. Utilizzare un kit di sequenziamento per preparare una scala di sequenziamento nucleotidico dideossidico con il primer per l'impronta delle dita dei piedi e il costrutto di DNA che codifica l'RNA XIAP IRES. Quindi, mescolare sei microlitri di ciascuna reazione di sequenziamento con tre microlitri del colorante di caricamento della formammide.
Dopo aver pulito e assemblato le piastre, versare il gel e inserire il pettine. Dopo la polimerizzazione del gel, assemblare l'apparato di sequenziamento e riempire i serbatoi con 1x TBE. Quindi, eseguire in anticipo a 1500 volt per 15 minuti fino a raggiungere una temperatura di 55 gradi Celsius.
Riscaldare tutti i campioni con colorante formamidico a 85 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, caricare un microlitro di ciascun campione su un gel di sequenziamento di poliacrilammide al 6% e far funzionare il gel a 1500 volt per otto ore. Infine, leggi le bande in tempo reale con un imager a fluorescenza.
Questo metodo dimostra che la conferma dell'RNA è fondamentale per la formazione del complesso di inizio della traduzione. La trascrizione inversa del complesso ribosomiale dell'mRNA di XIAP produce tipiche impronte di dita da 17 a 19 nucleotidi a valle di AUG. Il mutante 5'PPT mostra un'alterata formazione dell'impronta delle dita.
Tuttavia, quando trascritto con il 5'cappuccio, si verifica la formazione del complesso di iniziazione. Allo stesso modo, anche il mutante 3'PPT mostra una ridotta formazione dell'impronta delle dita. Tuttavia, la trascrizione con il 5'cap porta alla formazione del complesso di iniziazione.
Il doppio mutante PPT che ospita entrambe le mutazioni 5'PPT e 3'PPT è in grado di formare il complesso di iniziazione senza il 5'cap. La formazione dell'impronta delle dita è fortemente compromessa per il mutante del codone iniziale in assenza di RRL e GMP-PNP e di una coda Poly A. I prodotti CDNA sono confrontati con una scala di sequenziamento diossinucleotidico.
La beta globina umana, o mRNA HBB, non mostra alcuna impronta del piede in assenza del 5'cappuccio. Tuttavia, il complesso di iniziazione si forma sul 5'UTR incappucciato di HBB, producendo impronte di 16-18 nucleotidi a valle di AUG. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni, compresa la preparazione di modelli di trascrizione in vitro e RNA, se eseguita correttamente.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sondaggio strutturale per rispondere a ulteriori domande come la struttura secondaria delle varianti wild-type o mutanti dell'IRES. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della traduzione dell'mRNA per esplorare la traduzione mediata da IRES in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'impronta delle dita dei piedi dell'mRNA dei mammiferi e analizzare la formazione di complessi di inizio della traduzione.
Non dimenticare che acido-fenolo, fenolo:cloroformio:alcol isoamilico e acrilammide possono essere estremamente pericolosi. Durante l'utilizzo di questi reagenti devono essere indossati dispositivi di protezione individuale adeguati.
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Panoramica
Questa analisi di toeprinting mira a misurare la formazione di complessi di inizio traduzione su mRNA di mammiferi. Fornisce informazioni su meccanismi di traduzione sia cap-dipendenti che guidati da IRES.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biochimica
- Biologia Molecolare
Contesto
- Il toeprinting è una tecnica utilizzata per studiare l'inizio della traduzione.
- Permette l'analisi di interazioni specifiche tra mRNA e ribosomi.
- Il metodo può essere applicato per investigare l'inizio della traduzione mediato da IRES.
- Comprendere questi processi è cruciale per ottenere informazioni sulla regolazione dell'espressione genica.
Obiettivo dello studio
- Osservare la formazione di complessi di inizio traduzione su mRNA di mammiferi.
- Esplorare i meccanismi di inizio traduzione mediato da IRES.
- Fornire un'analisi dettagliata dell'inizio della traduzione su mRNA specifici.
Metodi utilizzati
- Le reazioni di trascrizione sono assemblate per trascrive l'RNA da modelli di DNA amplificati con PCR.
- Viene aggiunta DNasi priva di RNase per rimuovere il modello di DNA dalle reazioni di RNA.
- L'incubazione viene eseguita a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
- L'analisi di toeprinting viene condotta per valutare la formazione del complesso.
Risultati principali
- Il metodo dimostra con successo la formazione di complessi di inizio traduzione.
- Si ottengono informazioni sull'inizio della traduzione mediato da IRES.
- Le interazioni specifiche tra mRNA e ribosomi possono essere analizzate in dettaglio.
- La tecnica fornisce un quadro robusto per studiare l'inizio della traduzione.
Conclusioni
- Il toeprinting è un metodo efficace per studiare l'inizio della traduzione.
- La tecnica migliora la comprensione dei meccanismi di traduzione dell'mRNA.
- Può essere applicata a vari mRNA per esplorare le loro dinamiche di traduzione.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Toeprinting analysis enables precise interrogation of translation initiation mechanisms, a critical control point in protein synthesis regulation. This method provides actionable insights into cap-dependent and IRES-mediated translation, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Its ability to dissect regulatory elements and ribosome interactions supports predictive confidence for portfolio triage in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of ribosome binding to specific mRNA sequences and structures.
- Clarifies the functional impact of regulatory elements such as IRES on translation initiation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing cap-dependent from cap-independent initiation pathways.
- Facilitates hypothesis-driven validation of translational control points relevant to disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantifying translation initiation complex formation under defined conditions.
- Enables reproducible measurement of mutant and wild-type mRNA interactions with ribosomes.
- Supports assay standardization for downstream screening of translation modulators.
- Delivers quantitative outputs that inform compound evaluation and mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by interrogating stress-response translation mechanisms.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation of translational regulation.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying the translational impact of RNA regulatory elements.
- Provides mechanistic data to inform biomarker development for translation-based interventions.
Pipeline & Workflow Integration
Toeprinting positions within the early discovery to lead identification continuum, bridging molecular mechanism elucidation and assay development for translation-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of translation initiation mechanisms and regulatory element function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for translation initiation complex formation.
- Analytics: Enables direct comparison of wild-type and mutant mRNA translation initiation efficiency.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant translation control and stress-response pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse mRNA and regulatory element interrogation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in translation control.
- Operational Value: Standardizes translation initiation assays for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying translational regulation and supporting capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms based on translational control data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, in vitro transcription, and ribosome complex assembly.
- Demands access to specialized reagents, fluorescent imaging, and sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible toeprint quantification.
- Adaptation may be needed for different mRNA templates or regulatory element contexts.
- Careful handling of hazardous reagents and optimization of reaction conditions are essential for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Preparation of mRNA
2:59
Toeprinting Assay
6:32
Sequencing Reactions and Gel Electrophoresis
7:53
Results: Importance of IRES Secondary Structure in the Formation of Translation Initiation Complexes on an Uncapped XIAP IRES RNA
9:35
Conclusion
