Name: Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Impara a somministrare nanoparticelle polimeriche alla ghiandola sottomandibolare murina tramite iniezione retroductale. Questa tecnica consente il rilascio mirato di farmaci bypassando la circolazione sistemica per studiare la biologia delle ghiandole salivari.

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Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental e Craniofacial Research (NIDCR) e il National Cancer Institute (NCI) dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R56 DE025098, UG3 DE027695 e F30 CA206296. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Quest'opera fu appoggiata anche dalla NSF DMR 1206219 e l'innovazione di IADR in Oral Care Award (2016).
Vorremmo ringraziare Jayne Gavrity per la sua assistenza nell'esecuzione di esperimenti IVIS. Vorremmo ringraziare Karen Bentley per il suo ingresso e assistenza nell'esecuzione di EM. Vorremmo ringraziare Weng Pei-Lun per la sua assistenza con IHC. Vorremmo ringraziare Matthew Ingalls per la sua assistenza nella preparazione di figura. Vorremmo ringraziare Dr. Elaine Smolock ed Emily Wu per la lettura critica di questo manoscritto.

Tutte le procedure in vivo descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Università sulle risorse animali presso l'Università di Rochester, Rochester, NY.
1. preparazione
<ol><li>Utilizzando tubi di 32G catetere intracranico con inserto in filo, tagliare 3 cm del tubo per formare un'estremità smussata, circa 45° rispetto all'asse maggiore. Confermare che il filo sia almeno 1 cm più lungo rispetto al tubo.</li>
	<li>Caricare 50 µ l di soluzione di nanoparticelle PSMA (Figura 1), o altro materiale di iniezione, in una siringa di Hamilton. Per ridurre la probabilità del barotrauma durante l'iniezione, collegare il tubo del catetere, con il mandrino rimosso, alla siringa ed espellere il volume morto.</li>
	<li>Ispezionare la soluzione di iniezione per assicurarsi che la nanoparticella è completamente solvatati per evitare l'ostruzione duttale dopo la somministrazione.</li>
	<li>Preparare la soluzione di atropina a 0,1 mg/mL. Nota: Poiché l'atropina è sensibile alla luce e si degrada nel tempo, questa soluzione dovrebbe essere fatta il giorno dell'iniezione e al riparo dalla luce fino a quando somministrato.</li>
</ol>2. accesso e visualizzazione Ductal punto di ingresso
<ol><li>Pesare topi C57/BL6 utilizzando una bilancia analitica.</li>
	<li>Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", anestetizzare i topi con una soluzione salina sterile intraperitonealmente iniettato di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Procedere con il passaggio seguente quando il mouse non risponde agli stimoli, che generalmente si verifica entro 5-10 min dopo l'iniezione. Nota: Questa procedura può essere eseguita anche sotto isoflurano, ma richiederà un cono di naso personalizzato che consente l'accesso alla cavità orale.</li>
	<li>Per prevenire la secchezza durante la procedura, applicare il lubrificante per gli occhi e posizionare il mouse in posizione prona su un palco personalizzato. Nota: Per mantenere condizioni adeguate per fase intra-orale, strumenti dovrebbero essere disinfettati o sterilizzati prima di ogni utilizzo.</li>
	<li>Aprire la cavità orale proteggendo gli incisivi maxillary sopra una trave metallica e utilizzare una fascia elastica per tendere verso il basso dietro gli incisivi mandibolari (Figura 2A).</li>
	<li>Allineare il mouse sotto il microscopio per dissezione in modo tale che la base della mascella è visualizzata.</li>
	<li>Utilizzare un retrattore in acciaio personalizzato, curvo per applicare tensione bilateralmente al mucosa orale per allargare la bocca.</li>
	<li>Per visualizzare i papillae sottomandibolari, afferrare e sollevare delicatamente la linguetta dal pavimento della bocca usando il forcipe smussato. Nota: Le papille verranno visualizzato come due sporgenze pallidi sotto la lingua (Figura 2B).</li>
	<li>Per facilitare la visualizzazione e l'ulteriore manipolazione all'interno della cavità orale, posizionare il cotone tra la lingua e la mucosa buccale.</li>
</ol>3. inserimento di una canula ductal e posizionamento della linea
<ol><li>Usando bene, pinzetta, afferrare tubo catetere con l'inserto di filo. Per un controllo manuale ottimale durante l'inserimento di una canula, allineare il tubo con la curvatura delle pinze (Figura 3A).</li>
	<li>Uso del microscopio per dissezione, spostare il forcipe e filo nel campo di vista. Nota: Il cavo deve essere sporgenti dal tubo.</li>
	<li>Applicare una leggera pressione nella base di una papilla sottomandibolare con il filo da incasso per produrre una piccola, superficiale, mucosa puntura (0,076 mm di diametro) che faciliterà il successivo ingresso del tubo del catetere (0,25 mm di diametro). Se si incontra resistenza, taglio smussati freschi suggerimenti su entrambi i tubi e inserto in filo con le forbici per dissezione tagliente.</li>
	<li>A seguito dell'entrata, ritirare il mandrino e, utilizzando il microscopio per dissezione, confermano la presenza di saliva al sito di puntura. Evitare movimenti improvvisi o forti (ritiro o inserimento) del mandrino che può causare sanguinamento o compromettere l'integrità ductal.</li>
	<li>Retrarre il mandrino all'interno della tubazione (Figura 3B).</li>
	<li>Per garantire che i tubi di iniezione rientrerà nel dotto di Wharton di apertura, inserire tubi contenenti il mandrino come una guida rigida nella puntura fatta in precedenza (Figura 2 C). Nota: Se non eseguite rapidamente, gonfiore locale può impedire il re-inserimento.</li>
	<li>Per evitare la contropressione da prolungata ostruzione duttale, ritirare il tubo. Ispezionare per verificare che un'apertura, visibile al microscopio, può essere visto nel papilla sottomandibolare. Caso di sanguinamento visibile, rimuovere il mandrino e tentare di nuovo a partire da punto 3.2 papillae sottomandibolari avversari.</li>
	<li>Senza spostare il mouse, somministrare l'iniezione intraperitoneale di soluzione di atropina 1 mg/kg, per ridurre la salivazione durante la procedura. Attendere 5-10 min.</li>
	<li>Afferrare l'estremità del tubo siringa e inserire l'orifizio utilizzando il microscopio per dissezione (Figura 3). Se si incontra resistenza, tagliare un'estremità smussata fresca alla tubazione e tentare nuovamente.</li>
	<li>Una volta che il tubo è posto all'interno della papilla sottomandibolare, far avanzare lentamente 3-5 mm nel condotto. Rilasciare il tubo dal forcipe.</li>
	<li>Per migliorare la tenuta tra il tubo e la papilla sottomandibolare, asciugare l'interfaccia tamponando delicatamente con una garza per 1 min.</li>
	<li>Verificare che la posizione del tubo non è spostata durante l'asciugatura.</li>
</ol>4. iniezione
<ol><li>Iniettare il materiale ad un tasso di 10 µ l/min Inspect per confermare che il mouse rimane sedato e non mostra segni di afflizione (Figura 2D). Nota: Le iniezioni di 15-50 µ l sono ben tollerate. Iniezione di grandi volumi può causare barotrauma.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, mantenere la pressione di siringa per 5 min migliorare la ritenzione del materiale all'interno del dotto di Wharton e SMG (Figura 4). Ispezionare la papilla sottomandibolare periodicamente per assicurarsi che la tubazione non uscire l'orifizio ductal.</li>
	<li>Utilizzando una pinzetta, afferrare ed estrarre delicatamente il tubo da papillae sottomandibolari. Nota: È normale osservare qualche uscita fluido dalle papille.</li>
	<li>Rimuovere il riavvolgitore e cotone dalla cavità orale prima di spostare il mouse dal palco. Nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Inoltre, assicurarsi che il mouse non si trova con altri topi fino a completamente recuperato.</li>
</ol>5. Verifica e analisi
Nota: Un in vivo Imaging System (IVIS) può essere utilizzato per valutare il mantenimento delle nanoparticelle fluorescente identificate dopo l'iniezione (come mostrato in 1h e 24 h dopo l'iniezione nella Figura 5).
<ol><li>Per visualizzare meglio il segnale fluorescente all'interno del SMG attraverso la pelle, rimuovere il pelo ventrale che ricopre il SMGs rasatura o utilizzando un depilatori chimico. Nota: A seguito di eutanasia, SMG tessuto può anche essere raccolto, fisso (pernottamento in 4% paraformaldeide) e macchiato usando immunohistochemistry per confermare la persistenza di NP fluorescente contrassegnati un giorno dopo l'iniezione (Figura 6).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Retroductal iniezione è fondamentale per la consegna di droga localizzata alla ghiandola salivare. Questa tecnica ha applicazioni nella selezione di agenti terapeutici per condizioni tra cui la sindrome di Sjogren e RIH9,10,28. Consegna della droga diretta in SMG mediante iniezione di retroductal fornisce un vantaggio chiave rispetto alla somministrazione sistemica nelle sue potenzialità per ridurre gli effetti di fuori bersagli...

Disfunzione della ghiandola salivaria ha molte eziologie, compreso la sindrome di Sjögren, una perdita mediata autoimmune del tessuto secretivo funzionale e indotta da radiazioni hyposalivation (RIH), un comune sequella di testa e collo cancro radioterapia1. Perdita di funzione salivaria a causa di una delle due condizioni predispone gli individui ad infezione orale e sistemica, carie dentaria, disfunzione digestiva e della deglutizione, danno di discorso e depressione maggiore1,2,3. Di conseguenza, qualità della vita significativamente soffre, con interventi limitati alla palliazione dei sintomi piuttosto che curare4. Per studiare nuove terapie in vivo, è di interesse per l'amministrazione di composti bioattivi direttamente alla ghiandola salivare.
Iniezione di Retroductal è un metodo importante per fornire composti bioattivi direttamente per le ghiandole salivari e verificare l'efficacia nella malattia, ferita, o sotto l'omeostasi normale del tessuto. Sono tre ghiandole salivari maggiori parotide (PG), la sottomandibolare (SMG) e sublingual (SLG), tutti di cui vuoto nella cavità orale attraverso dotti escretori. L'anatomia della murino SMG consente accesso diretto attraverso l'incannulamento del dotto di Wharton, situato nel pavimento della bocca sotto la lingua5. Seguito all'inserimento di una canula, solvatato farmaci può essere somministrato direttamente al SMG. A seguito della consegna retroductal, diffusione extra-ghiandolare è limitato alla capsula di tessuto circostante che regola lo scambio di materiale con le circostanti strutture6. il SMG e le relative condutture sono strutturati allo stesso modo negli esseri umani e abitualmente si accede durante il SMG chirurgia e sialoendoscopy7. Negli esseri umani e topi, il PG è similarmente raggiungibile tramite dotto di Stensen nella mucosa orale8.
In modelli murini di RIH, SMG retroductal iniezione è stata usata per fornire terapie anche fattori di crescita, cellule primarie, vettori adenovirali, citochine e composti antiossidanti di modulare la risposta cellulare al danno e ridurre il risultante tessuto danno5,9,10,11,12,13,14,15,16. Il più notevole successo clinico dell'iniezione di retroductal è la somministrazione di vettore adenovirale alla diretta espressione di un canale di acqua (Acquaporina 1; AQP1) in pazienti dopo la radiazione per testa e collo cancro17.
In precedenza, abbiamo sviluppato e dimostrato l'efficacia di un sistema di nanoparticelle polimeriche-siRNA retroductally iniettato per proteggere la funzione della ghiandola salivaria da RIH11,18,19,20. Come un'estensione del nostro lavoro passato, qui, dimostriamo il nostro protocollo per l'iniezione di SMG retroductal utilizzando una nanoparticella fluorescente contrassegnata (NP) in grado di caricamento e di trasporto altrimenti scarsamente solubili farmaci21,22, 23.
Abbiamo sintetizzato il NP da un copolimero diblock composto da poli (stirolo-alt-idrazide anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) attraverso polimerizzazione per addizione reversibile catena frammentazione (zattera), come descritto in precedenza21. Attraverso cambio solvente, questi polimeri spontaneamente auto-assemblarsi in strutture NP micella con un idrofobo interni e idrofilo esterno21. La NPs sono etichettati con Texas-Red fluoroforo per consentire la verifica della consegna NP nelle ghiandole senza sacrificare l'animale. Animali immagini dal vivo e immunohistochemistry SMG è mostrato a 1 h e 1 giorno dopo l'iniezione.
Questo aggiornamento e protocollo di inserimento di una canula riproducibile dovrebbe consentire ad altri di raggiungere retroductal iniezione. Ci aspettiamo che questa raffinata tecnica diventerà fondamentale per gli studi in vivo e sviluppo terapeutico24,25.

<table><tbody><tr><td>Pilocarpina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpina</td></tr><tr><td>Studente Vannas Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Forbici a molla per tracheostomia</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Soluzione salina</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze</td> Strumenti per <td>le scienze fini</td><td>11274-20</td><td>Pinze curve</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Pinze dritte</td></tr><tr><td>Pinze standard Fine</td><td>Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forcipe smussata</td></tr><tr><td>Forbici fini - Carburo di tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Forbici da dissezione</td></tr><tr><td>Microematocrito Tubi capillari eparinizzati</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Tubi capillari</td></tr><tr><td>Lubrificante Unguento</td> <td>per gli occhiRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat policlonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Anticorpo</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Software statistico</td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Applicatore per unguento oculare</td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 0,5 cc, 29G x 1/2"</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Siringa per iniezione intraperitoneale</td></tr></tbody></table>

iniezione delle nanoparticelle retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Due obiettivi comuni di terapeutica della ghiandola salivaria sono la prevenzione e la cura di disfunzione del tessuto seguendo uno autoimmuni o ferita di radiazione. Formulando localmente i composti bioattivi per le ghiandole salivari, le maggiori concentrazioni di tessuto possono essere raggiunto in modo sicuro contro l'amministrazione sistemica. Inoltre, fuori tessuto bersaglio effetti da extra-ghiandolare accumulo di materiale possono essere drasticamente ridotto. A questo proposito, iniezione di retroductal è un metodo ampiamente usato per lo studio sia della ghiandola salivaria biologia e fisiopatologia. Retroductal la somministrazione di fattori di crescita, cellule primarie, vettori adenovirali e farmaci piccola molecola ha dimostrata di sostenere la funzione della ghiandola nella regolazione della ferita. Precedentemente abbiamo indicato l'efficacia di una strategia di nanoparticelle-siRNA retroductally iniettato per mantenere la funzione della ghiandola dopo l'irradiazione. Qui, un metodo altamente efficace e riproducibile per amministrare i nanomateriali alla ghiandola sottomandibolare murina attraverso il dotto di Wharton è dettagliato (Figura 1). Descriviamo l'accesso alla cavità orale e delineare i passaggi necessari per dotto di Wharton cannulate, con ulteriori osservazioni che funge da controllo di qualità durante tutta la procedura.

Iniezione di Retroductal può essere utilizzato per amministrare NPs per il SMG murino (Figura 1). Qui, noi consegniamo 50 µ g PSMA NPs etichettato con Texas Red fluorophore.
Corretto posizionamento del mouse permette facile accesso e la visualizzazione del pavimento della bocca (Figura 2A-B). I papillae sottomandibolari sono identificati come due sporge...

Consegna di droga locale a ghiandole sottomandibolari è di interesse nella biologia della ghiandola salivaria comprensione e per lo sviluppo di nuove terapie. Vi presentiamo un protocollo di iniezione retroductal aggiornate e dettagliate, progettato per migliorare la precisione nella consegna e riproducibilità sperimentale. L'applicazione presentata qui è la consegna di nanoparticelle polimeriche.

Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare nanomateriali direttamente alla ghiandola sottomandibolare murina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di ottenere la consegna diretta di composti alla ghiandola sottomandibolare bypassando la circolazione sistemica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della disfunzione delle ghiandole salivari dopo il trattamento con radiazioni per i tumori maligni della testa e del collo.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono essere sfidati localizzando e incannulando il dotto sottomandibolare mentre l'animale è sedato. Per iniziare questa procedura, tagliare tre centimetri di un tubo per catetere intracranico calibro 32 con inserto di filo per formare un'estremità smussata a circa 45 gradi rispetto all'asse lungo. Verificare che il filo sia almeno un centimetro più lungo del tubo.La creazione di un bordo smussato del tubo faciliterà l'incannulamento duttale. Se il tubo si piega durante la procedura, è necessario tagliare un bordo smussato fresco. Quindi, caricare 50 microlitri di soluzione di nanoparticelle di PSMA o altro materiale per iniezione in una siri

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Un protocollo per l'incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton è descritto. Per questo esperimento, la soluzione trypan blu è usato come un tintore per dimostrare quanto questa tecnica offre efficacemente infusi nella ghiandola mirati, e di suggerire l'affidabilità di questo nuovo approccio clinico come un potenziale farmaco / terapia cellulare per la rigenerazione delle ghiandole salivari.

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

Questo video descrive una tecnica di iniezione intraduttale in cui forniamo una miscela per iniezione nei dotti delle ghiandole mammarie di topo.

Iniezione intraduttale: erogazione di una miscela per iniezione nei dotti della ghiandola mammaria del topo

Il video mostra una tecnica di iniezione guidata da ultrasuoni per la somministrazione di farmaci terapeutici nelle ghiandole salivari di un paziente umano.

Un'iniezione ecoguidata di farmaci terapeutici nelle ghiandole salivari umane

La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l'imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l'imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Un protocollo per la consegna intraduttale non invasiva di reagenti acquosi alla ghiandola mammaria topo è descritto. Il metodo si avvale di iniezione localizzato nei capezzoli delle ghiandole mammarie destinati dotti mammari in particolare. Questa tecnica è adattabile per una varietà di composti compresi siRNA, agenti chemioterapici e piccole molecole.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

I linfonodi sono i tessuti immunologici che orchestrano la risposta immunitaria e sono un obiettivo critico per i vaccini. I biomateriali sono stati impiegati per colpire meglio i linfonodi e per controllare la consegna di antigeni o coadiuvanti. Questo articolo descrive una tecnica che combina queste idee per iniettare particelle polimeriche biocompatibili nei linfonodi.

Iniezione intra-linfonodo di particelle polimeriche biodegradabili

Ipofunzione delle ghiandole salivari, un importante effetto avverso della radioterapia della testa e del collo diminuisce la qualità della vita di un paziente. La dimostrazione dell'efficacia di nuove terapie in modelli animali è un prerequisito prima della transizione clinica. Questo protocollo descrive la somministrazione retroduttale e l'irradiazione locale delle ghiandole sottomandibolari di ratto.

Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione

Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

Le ghiandole salivari sono state proposte come sito bersaglio tissutale per la terapia genica, specialmente nell'area della vaccinazione mediante trasferimento genico. Dimostriamo la consegna genica in un modello di primate non umano utilizzando l'infusione retrograda di parotidi.

Infusione retrograda della ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen in un primate non umano per la consegna di geni vettoriali

Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

L'imaging immunofluorescente è limitato dalla capacità di osservare processi biologici complessi e dipendenti dal tempo in una singola istantanea nel tempo. Questo studio delinea un approccio di imaging dal vivo condotto su fette di ghiandola sottomandibolare di topo tagliate con precisione. Questo approccio consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellula-cellula durante l'omeostasi e i processi di rigenerazione e riparazione.

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Impara a somministrare nanoparticelle polimeriche alla ghiandola sottomandibolare murina tramite iniezione retroductale. Questa tecnica consente il rilascio mirato di farmaci bypassando la circolazione sistemica per studiare la biologia delle ghiandole salivari.

Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

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