Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare nanomateriali direttamente alla ghiandola sottomandibolare murina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di ottenere la consegna diretta di composti alla ghiandola sottomandibolare bypassando la circolazione sistemica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della disfunzione delle ghiandole salivari dopo il trattamento con radiazioni per i tumori maligni della testa e del collo.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono essere sfidati localizzando e incannulando il dotto sottomandibolare mentre l'animale è sedato. Per iniziare questa procedura, tagliare tre centimetri di un tubo per catetere intracranico calibro 32 con inserto di filo per formare un'estremità smussata a circa 45 gradi rispetto all'asse lungo. Verificare che il filo sia almeno un centimetro più lungo del tubo.

La creazione di un bordo smussato del tubo faciliterà l'incannulamento duttale. Se il tubo si piega durante la procedura, è necessario tagliare un bordo smussato fresco. Quindi, caricare 50 microlitri di soluzione di nanoparticelle di PSMA o altro materiale per iniezione in una siringa Hamilton.

Per ridurre la probabilità di trauma da tana durante l'iniezione, collegare il tubo del catetere alla siringa ed espellere il volume morto. Ispezionare la soluzione di iniezione per assicurarsi che la nanoparticella sia completamente solvatata per prevenire l'ostruzione duttale. Quindi preparare la soluzione di atropina a 0,1 milligrammi per millilitro.

Per visualizzare il punto di ingresso duttale, posizionare un topo anestetizzato in posizione prona su un tavolino personalizzato. Quindi applicare un unguento sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura. Successivamente, fissare gli incisivi mascellari su una trave metallica e utilizzare un elastico per applicare una tensione verso il basso dietro gli incisivi mandibolari.

Allineare il mouse sotto il microscopio da dissezione per visualizzare la base della mascella. Per allargare la bocca, utilizzare un divaricatore in acciaio curvo personalizzato per applicare tensione bilateralmente alla mucosa buccale. Per visualizzare la papilla sottomandibolare, afferrare e sollevare delicatamente la lingua dal pavimento della bocca utilizzando una pinza smussata.

Posizionare un pezzo di cotone tra la lingua e la mucosa buccale per consentire un'ulteriore manipolazione all'interno della cavità orale. Per eseguire l'incannulamento duttale e il posizionamento della linea, afferrare il tubo del catetere con un inserto metallico. Per un controllo manuale ottimale durante l'incannulamento, allineare il tubo con la curvatura della pinza.

Utilizzando il microscopio da dissezione, spostare la pinza e il filo nel campo visivo. Utilizzando l'inserto del filo, applicare delicatamente una pressione alla base di una papilla sottomandibolare per produrre una piccola puntura superficiale della mucosa che faciliterà l'ingresso successivo del tubo del catetere. Se si incontra resistenza, tagliare le punte smussate fresche sia sul tubo che sull'inserto del filo con forbici da dissezione affilate.

Dopo l'ingresso, prelevare lo stiletto, quindi, utilizzando il microscopio da dissezione, confermare la presenza di saliva nel sito di puntura. Successivamente, ritrarre ulteriormente lo stiletto all'interno del tubo. Evitare movimenti bruschi o bruschi dello stiletto che potrebbero causare sanguinamento o compromettere l'integrità duttale.

Per garantire che il tubo di iniezione si inserisca nell'apertura del condotto di Wharton, inserire il tubo contenente lo stiletto come guida rigida nella puntura precedentemente effettuata. Per evitare che la contropressione si protragga fino all'ostruzione duttale, estrarre il tubo. Al microscopio, assicurarsi che si possa vedere un'apertura nella papilla sottomandibolare.

Se si verifica un'emorragia visibile, rimuovere lo stiletto e ritentare le procedure sulla papilla sottomandibolare opposta. Successivamente, senza muovere il topo, somministrare un milligrammo per chilogrammo di soluzione di atropina per via intraperitoneale per ridurre l'elevazione durante la procedura. Quindi, attendi da cinque a 10 minuti.

Sotto il microscopio da dissezione, inserire il tubo della siringa nell'orifizio. Se si incontra resistenza, tagliare una nuova estremità smussata sul tubo e riprovare. Una volta che il tubo è in posizione all'interno della papilla sottomandibolare, avanzare lentamente da tre a cinque millimetri nel condotto.

Quindi, rilasciare il tubo dalla pinza. Per migliorare la tenuta tra il tubo e la papilla sottomandibolare, asciugare l'interfaccia tamponando delicatamente con una garza per un minuto. Ispezionare per confermare che la posizione del tubo non si sia spostata durante l'asciugatura.

In questa procedura, iniettare il materiale a una velocità di 10 microlitri al minuto. Assicurarsi che il mouse rimanga sedato e non mostri segni di angoscia. Dopo l'iniezione, mantenere la pressione della siringa per cinque minuti per migliorare la ritenzione del materiale all'interno del dotto di Wharton e della ghiandola sottomandibolare.

Ispezionare periodicamente la papilla sottomandibolare per assicurarsi che il tubo non esca dall'orifizio duttale. Il mantenimento della pressione di iniezione migliorerà l'efficacia dell'erogazione retroduttale. Usando una pinza fine, afferrare e delicatamente ed estrarre il tubo dalla papilla sottomandibolare.

Rimuovere il divaricatore e il cotone dalla cavità orale prima di allontanare il mouse dal tavolino. Per verificare la somministrazione di nanoparticelle, il sistema di imaging in vivo mostra la lateralizzazione del segnale fluorescente rosso sul lato trattato del topo un'ora dopo l'iniezione. E questa immagine mostra che il segnale delle nanoparticelle è diminuito significativamente 24 ore dopo l'iniezione.

Per confermare la persistenza delle nanoparticelle nelle ghiandole sottomandibolari 24 ore dopo l'iniezione, sono state sezionate e visualizzate mediante imaging fluorescente. Qui sono mostrate le ghiandole sottomandibolari di controllo non iniettate colorate per l'acquaporina 5 e la chirina cinque che marcano rispettivamente gli acini secretori e le cellule duttali. Nelle ghiandole sottomandibolari iniettate con nanoparticelle retroduttali, le colorazioni di acquaporina cinque e cheritina cinque mostrano una morfologia normale delle ghiandole e nanoparticelle assorbite sia negli acini che nei dotti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare movimenti estranei che potrebbero spostare la cannula o interrompere la tenuta praticata tra il tubo e la papilla sottomandibolare. Dopo la procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunocolorazione, l'estrazione dell'RNA o la citometria a flusso per valutare l'espressione genica o la localizzazione dei nanomateriali nella ghiandola sottomandibolare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori delle ghiandole salivari per lo screening e il test di composti per la prevenzione della xerostomia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come somministrare nanomateriali direttamente alla ghiandola sottomandibolare murina tramite incannulamento del dotto di Wharton.