Name: Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Scopri la valutazione della funzione salivare murina attraverso la stimolazione con pilocarpina. Questo metodo include tracheostomia, raccolta di saliva e dissezione delle ghiandole per studiare la disfunzione salivare.

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Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental e Craniofacial Research (NIDCR) e il National Cancer Institute (NCI) dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R56 DE025098, UG3 DE027695 e F30 CA206296. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Quest'opera fu appoggiata anche dalla NSF DMR 1206219 e l'innovazione di IADR in Oral Care Award (2016).
Vorremmo ringraziare il Dr. Eri Maruyama e Andrew Hollomon per la loro assistenza con raccolta di saliva. Vorremmo ringraziare Weng Pei-Lun per la sua assistenza con la dissezione della ghiandola. Vorremmo ringraziare Matthew Ingalls per la sua assistenza nella preparazione di figura. Vorremmo ringraziare Dr. Elaine Smolock ed Emily Wu per la lettura critica di questo manoscritto.

Tutte le procedure in vivo descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Università sulle risorse animali presso l'Università di Rochester, Rochester. NY.
1. preparazione
<ol><li>Utilizzando una bilancia analitica, pesano 20 mg di pilocarpina. Scioglierli in 2 mL di soluzione fisiologica sterile in una microcentrifuga. Nota: Poiché Pilocarpina è sensibile alla luce e perde l'attività nel corso del tempo, questa soluzione dovrebbe essere preparata il giorno dell'iniezione e al riparo dalla luce fino a quando somministrato.</li>
	<li>Utilizzando una bilancia analitica, pesare e identificare tutte le provette per il prelievo e tubi capillari in vetro. Il numero di provette per la raccolta e tubi capillari in vetro deve corrispondere al numero di topi.</li>
</ol>2. tracheostomia
<ol><li>Pesare topi C57/BL6 utilizzando una bilancia analitica.</li>
	<li>Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", anestetizzare i topi con una soluzione salina sterile intraperitonealmente iniettato di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Procedere con il passaggio seguente quando il mouse non risponde agli stimoli (cioè assenza del riflesso del pedale ritiro), che generalmente si verifica entro 5-10 min dopo l'iniezione.</li>
	<li>Dopo l'erogazione di lubrificante su un applicatore con punta di cotone, applicare agli occhi delicatamente e posizionare il mouse in una posizione supina sul palco. L'animale anestetizzato deve essere mantenuto sulla superficie calda. Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Fissare il naso, gli arti e la coda alla fase utilizzando nastro chirurgico.</li>
	<li>Pulire e bagnare il collo con un batuffolo imbevuto di alcool. Nota: Questo vi aiuterà a impedire l'ingresso di incisioni successive di pelliccia.</li>
	<li>Sollevare la pelle del collo del midline ventrale con il forcipe, fare un piccolo taglio superficiale usando le forbici per dissezione. Guida le forbici nell'apertura e aprire lentamente le lame per via sottocutanea per separare aerei del tessuto.</li>
	<li>Mantenendo la pelle sollevata, accuratamente tagliato a 1 cm sotto la bocca.</li>
	<li>Fare due incisioni laterali inferiori e superiori gli aspetti del primo taglio. Usando il forcipe, delicatamente riflettere via la pelle per consentire l'accesso alle strutture del collo e della testa.</li>
	<li>Uso del microscopio per dissezione a ingrandimento X 8, visualizzare le ghiandole sottomandibolari (linea mediana: Figura 1).</li>
	<li>Utilizzando una pinzetta, sollevare delicatamente le ghiandole per esporre quattro muscoli sottoioidei (cinghia) che ricopre la trachea. Evitare strappi o danneggiarne il vasculature circostante o dotti escretori.</li>
	<li>Se raccolta saliva da più di un mouse, ripetere i passaggi 2.1-2.10 con ogni mouse prima di continuare. Nota: Questa procedura può essere effettuata sicuro su fino a 5 topi simultaneamente.</li>
	<li>Con piccole forbici per dissezione, rimuovere la parte mediale dei muscoli della cinghia durante il vostro soggiorno più vicino alla linea mediana come possibile. Tagliare solo quanto necessario visualizzare trachea e muscoli della cinghia di mezzo durante la procedura. Evitare di intaccare le navi nelle vicinanze perché se c'è secondaria all'emorragia significativa deplezione di volume, Pilocarpina non sarà efficace a indurre la secrezione.</li>
	<li>Riflettere i muscoli della cinghia dalla trachea.</li>
	<li>Visualizzare la laringe, la trachea e la ghiandola tiroide. Assicurarsi che la trachea sia chiara del tessuto sovrastante.</li>
	<li>Fare un'incisione orizzontale nella trachea inferiore/posteriore alla tiroide utilizzando piccole forbici per dissezione. Assicurarsi che le vie respiratorie siano brevetto e chiaro del fluido.</li>
</ol>3. saliva Collection
<ol><li>Rimuovere il nastro vicino a bocca e l'angolo verso il basso la fase di dissezione (45°, cranialmente) per assistere con flusso della saliva.</li>
	<li>Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", eseguire l'iniezione intraperitoneale di Pilocarpina peso di 10 µ l/g corpo per una dose totale di 100 mg/kg.</li>
	<li>Avviare un timer. Se il dosaggio più mouse, riduzione del lead time spostando rapidamente e di avere un assistente iniettare contemporaneamente i topi restanti.</li>
	<li>Utilizzando standard forcipe, aprire la bocca per l'accesso a tubo capillare.</li>
	<li>Una volta una perlina di saliva è osservata in bocca, è possibile inserire l'estremità prossimale del tubo capillare nel fluido, con l'estremità distale inserito in un tubo di raccolta posizionato sotto il palcoscenico per dissezione (entrambi i tubi pre-pesati). Nota: Nei topi femmina C57/BL6 6-10 settimane di età, salivazione lordo si verifica entro 2 minuti di iniezione di pilocarpina.</li>
	<li>Se la saliva è costruzione in bocca, ma non che scorre attraverso il tubo, tentare nuovamente il passaggio precedente. Assicurarsi che il tubo non è posizionato direttamente contro una superficie mucosa, che possa ostruire l'ingresso.</li>
	<li>Raccogliere saliva per un totale di 12 min dopo stimolazione con pilocarpina. Assicurarsi che lo stoma rimane chiaro. Nota: Aumento del volume tidal e secrezioni (salivari, urinarie e fecale) sono normali in questo periodo.</li>
	<li>Se i topi hanno depresso la funzione della saliva (ad es., a causa di infortunio o intervento), trasferire il liquido rimanente dalla bocca al tubo di raccolta mediante una micropipetta P200. Se raccogliendo da più mouse, assicurarsi che suggerimenti sono modificati.</li>
	<li>Registrare il peso della saliva raccolta più tubi 12 min dopo l'iniezione di pilocarpina.</li>
</ol>4. ghiandola dissezione
<ol><li>Eutanasia di topi di CO2 eutanasia (come descritto nelle linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali: edizione 2013) seguita dal thoracotomy, avendo cura di preservare le strutture della testa e del collo. Per questo motivo, evitare di dislocazione cervicale come metodo di eutanasia.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una posizione supina sul palco. Riposizionare le ghiandole nel sito originale sulla trachea (Figura 1).</li>
	<li>Usando un microscopio per dissezione sotto ingrandimento 8x, visualizzare le principali ghiandole: il PG e la SMG SLG. Per distinguere le ghiandole durante la dissezione, identificare che il PG è diffuso, che si trova laterale alla SMG e SLG. Nota: Se il PG di dissezione, questo dovrebbe essere fatto prima perché è il meno definito e più probabilità di essere strappato.</li>
	<li>Afferrare la coda del PG con la pinzetta, distanziando strutture sottostanti e applicare una leggera tensione prima di tagliare la testa del PG con forbici di dissezione.</li>
	<li>Violazione la capsula che circonda il SMGs usando il forcipe. Separare delicatamente la SMG destro e sinistro.</li>
	<li>Gratis la funzione dorsale del SMG dal tessuto nonglandular aderito usando il forcipe.</li>
	<li>Rimuovere la SMG dal collo disegno dotto di Wharton teso con il forcipe e tagliando il condotto con forbici di dissezione.</li>
	<li>Separare delicatamente la SLG da SMG usando il forcipe. Nota: La SLG è nella funzione superolateral del SMG.</li>
	<li>Con una bilancia analitica, registrare pesi SMG.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Presentiamo un metodo multistep per valutare la funzione della ghiandola salivaria, che può essere applicata a studiare terapeutica e lesioni della ghiandola. La nostra procedura prevede tracheostomia, raccolta di saliva e la dissezione della ghiandola, ognuno dei quali ha applicazioni sperimentali che possono supportare uno studio integrato di biologia della ghiandola salivaria. Ad esempio, tracheostomy murino è stato utilizzato per la gestione generale delle vie aeree durante le procedure che ostruisce la cavità orale....

Ghiandola salivare disturbi includono le sindromi di dysregulated o secrezione alterata che conduce alla sovrapproduzione (scialorrea) o sottoproduzione (xerostomia e hyposalivation) di saliva1. In entrambi i casi, c'è un interesse nel migliorare la nostra comprensione della biologia della ghiandola salivaria verso l'obiettivo finale di sviluppo terapeutico2.
Le ghiandole salivari sono organi altamente radiosensibili e spesso sono danneggiate durante la radioterapia cancro testa e del collo, che porta a permanente secchezza delle fauci (xerostomia)3,4. A differenza di altri tessuti radiosensibili, tuttavia, il tasso di turnover della ghiandola salivaria è relativamente basso e il meccanismo di perdita secretiva è capita male5,6. In questa cornice unica ferita, strategie di rigenerazione e protezione dalle radiazioni del tessuto richiedono valutazione funzionale salivare. Sperimentalmente, raccolta di saliva murino è uno strumento particolarmente valido nel valutare la risposta della ghiandola alla radiazione sia agenti terapeutici.
Qui, presentiamo un metodo per l'esecuzione e quantificare la secrezione di saliva stimolata utilizzando pilocarpina, un potente agonista muscarinico7. Pilocarpina stimola il sistema nervoso autonomo per indurre la secrezione della ghiandola8,9. Per completare questo test in modo appropriato, un tracheostomy è necessario per garantire che il mouse mantiene pervietà durante tutta la procedura e di ridurre i rischi di soffocamento e di aspirazione dalle secrezioni riunite nella cavità orale10.
Si tratta di una procedura di terminale, che si conclude con la rimozione delle ghiandole salivarie principali tre: parotide (PG), la sottomandibolare (SMG) e sublingual (SLG). Per gli studi funzionali, ghiandola pesi vengono registrati e sono spesso utilizzati per normalizzare saliva misura11,12,13. Questi dati sono particolarmente importanti negli studi di radiazione, in cui l'atrofia della ghiandola è un risultato atteso14,15
Non c'è variabilità nella letteratura per quanto riguarda la secrezione di saliva come stimolata viene eseguita e segnalato16. Ad esempio, dosi di Pilocarpina all'interno della letteratura span almeno tre ordini di grandezza17,18,19,20,21,22,23. Qui, presentiamo un protocollo di Pilocarpina ottimizzato ad alte dosi con l'intento di una migliore riproducibilità in esecuzione del metodo, come pure fornendo una piattaforma modulare di tecniche (tracheostomia, raccolta di saliva e la dissezione della ghiandola) che può essere adattato come necessari.
Oltre alla dimostrazione di protocollo, includiamo dati rappresentativi funzionali del flusso della saliva a 2 settimane che seguono radioterapia frazionata (4 dosi di 6.85 Gy) nella regione di SMG.

<table><tbody><tr><td>Pilocarpina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpina</td></tr><tr><td>Studente Vannas Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Forbici a molla per tracheostomia</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Soluzione salina</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze</td> Strumenti per <td>le scienze fini</td><td>11274-20</td><td>Pinze curve</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Pinze dritte</td></tr><tr><td>Pinze standard Fine</td><td>Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forcipe smussata</td></tr><tr><td>Forbici fini - Carburo di tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Forbici da dissezione</td></tr><tr><td>Microematocrito Tubi capillari eparinizzati</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Tubi capillari</td></tr><tr><td>Lubrificante Unguento</td> <td>per gli occhiRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat policlonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Anticorpo</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Software statistico</td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Applicatore per unguento oculare</td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 0,5 cc, 29G x 1/2"</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Siringa per iniezione intraperitoneale</td></tr></tbody></table>

valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione pilocarpina frazionato radiazione

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation è osservata comunemente nella reazione autoimmune di sindrome di Sjögren o seguente lesione da radiazioni alla ghiandole salivarie principali. In questi casi, domande rimangono per quanto riguarda la patogenesi della malattia e interventi efficaci. Una tecnica ottimizzata che consente la valutazione funzionale delle ghiandole salivari è preziosa per indagare terapeutica, la disfunzione e la biologia della ghiandola exocrine. Qui, presentiamo un approccio passo per passo all'esecuzione di Pilocarpina ha stimolato la secrezione di saliva, compreso il tracheostomy ed la dissezione delle tre principali ghiandole salivari murine. Dettagliamo anche l'appropriato anatomia di testa e collo di murino letta durante queste tecniche. Questo approccio è scalabile, che consente più topi da elaborare simultaneamente, migliorando così l'efficienza del flusso di lavoro. Puntiamo a migliorare la riproducibilità di questi metodi, ognuno dei quali ha ulteriori applicazioni all'interno del campo. Oltre alla raccolta della saliva, discutiamo metriche per quantificare e normalizzare la capacità funzionale di questi tessuti. Dati rappresentativi sono inclusi da ghiandole sottomandibolari con funzione della ghiandola salivaria depresso 2 settimane che seguono la radiazione frazionata (4 dosi di 6.85 Gy).

Quando eseguire Pilocarpina dose elevata stimolato raccolta della saliva, è importante mantenere le vie respiratorie per impedire l'aspirazione o soffocamento dalle secrezioni nella cavità orale. Lo schema del tracheostomy è fornito (Figura 1). A seguito di incisione tracheale, lo stoma deve rimanere chiaro dei tessuti e dei fluidi.
Per migliorare l'azione capillare durante la raccolta della saliva,...

Vi presentiamo un approccio dettagliato dell'esecuzione di raccolta della saliva, compreso il tracheostomy murino ed all'isolamento di tre ghiandole salivari maggiori.

Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione salivare murina mediante stimolazione con pilocarpina. Questo metodo può essere applicato sia per comprendere la storia naturale della disfunzione delle ghiandole salivari, sia per testare l'efficacia di eventuali interventi. Il nostro protocollo fornisce una piattaforma modulare di tecniche, tra cui la tracheotomia murina, la raccolta della saliva e la dissezione delle ghiandole.Clinicamente, questa tecnica ha implicazioni per gli studi che valutano la secchezza delle fauci o la sovrapproduzione di saliva. E può anche essere applicato ad altre procedure intraorali che richiedono la gestione delle vie aeree. Coloro che imparano per la prima volta questo protocollo possono trovare la tracheostomia e la dissezione della ghiandola impegnative.Speriamo che questo video ti aiuti ad apprendere la corretta tecnica di isolamento delle ghiandole, nonché l'anatomia pertinente. Utilizzando una bilancia analitica, pesare 20 milligrammi di pilocarpina, quindi scioglierla in 2 millilitri di soluzione fisiologica sterile. Le soluzioni di pilocarpina devono essere preparate fresche il giorno dell'uso.Quindi, pesare tutti i recipienti

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Un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l'isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Un protocollo per l'incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton è descritto. Per questo esperimento, la soluzione trypan blu è usato come un tintore per dimostrare quanto questa tecnica offre efficacemente infusi nella ghiandola mirati, e di suggerire l'affidabilità di questo nuovo approccio clinico come un potenziale farmaco / terapia cellulare per la rigenerazione delle ghiandole salivari.

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un'area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

Ipofunzione delle ghiandole salivari, un importante effetto avverso della radioterapia della testa e del collo diminuisce la qualità della vita di un paziente. La dimostrazione dell'efficacia di nuove terapie in modelli animali è un prerequisito prima della transizione clinica. Questo protocollo descrive la somministrazione retroduttale e l'irradiazione locale delle ghiandole sottomandibolari di ratto.

Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione

Descriviamo un metodo che utilizza irraggiamento periferico mirati per indurre comportamento a fatica, come nei topi. La dose di irradiazione non letale selezionati porta ad una riduzione di una settimana in attività di ruote in esecuzione volontaria.

Un modello murino di fatica indotta da irradiazione Peripheral

Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Consegna di droga locale a ghiandole sottomandibolari è di interesse nella biologia della ghiandola salivaria comprensione e per lo sviluppo di nuove terapie. Vi presentiamo un protocollo di iniezione retroductal aggiornate e dettagliate, progettato per migliorare la precisione nella consegna e riproducibilità sperimentale. L'applicazione presentata qui è la consegna di nanoparticelle polimeriche.

Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

L'uso di colture organotipiche tridimensionali per visualizzare la morfologia e i marcatori funzionali delle ghiandole salivari può fornire nuove intuizioni sui meccanismi del danno tissutale dopo la radiazione. Qui di seguito è riportato un protocollo per sezioni, colture, irraggiamento, macchia e immagini di 50 – 90 μm di spessore di sezione della ghiandola salivare prima e dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

Trattamento radiante delle colture organotipiche da ghiandole salivari Sottomandibulari e parotidi modelli chiave in vivo caratteristiche

L'imaging immunofluorescente è limitato dalla capacità di osservare processi biologici complessi e dipendenti dal tempo in una singola istantanea nel tempo. Questo studio delinea un approccio di imaging dal vivo condotto su fette di ghiandola sottomandibolare di topo tagliate con precisione. Questo approccio consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellula-cellula durante l'omeostasi e i processi di rigenerazione e riparazione.

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Qui presentiamo un protocollo per applicare il needling al fuoco sotto guida ecografica agli strati ghiandolari o muscolari per il trattamento della sialorrea nei pazienti tracheotomatizzati post-ictus.

Agopuntura con ago di fuoco guidata da ultrasuoni per il trattamento della silorirea in pazienti tracheotomatizzati

Scopri la valutazione della funzione salivare murina attraverso la stimolazione con pilocarpina. Questo metodo include tracheostomia, raccolta di saliva e dissezione delle ghiandole per studiare la disfunzione salivare.

Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

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