Un modello di ciclo intestinale legati nei polli gratis anestetizzati patogeno specifico per studiare la virulenza di Clostridium Perfringens

Qui presentiamo un protocollo per creare chirurgicamente 'anse intestinali legati' in intestini di pollo. Questa procedura consente il confronto di virulenza in situ in un singolo host di più ceppi Clostridium perfringens . Questo metodo notevolmente riduce il numero di polli solitamente necessari per simili esperimenti in vivo .

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'enterite necrotica di pollo. Come confrontare la virulenza di specifici ceppi di Clostridium perfringens che causano questa malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce notevolmente il numero di polli solitamente necessari per simili esperimenti di ambivore.

Mentre questo metodo può fornire informazioni sul potenziale di virulenza dei ceppi di Clostridium perfringens, può anche essere applicato ad altri agenti patogeni intestinali come Clostridium difficile o Salmonella enterica. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché le procedure chirurgiche hanno bisogno di un allenamento specifico e devono essere eseguite solo da coloro che hanno acquisito abilità come la sutura, una tecnica prima dell'esperimento. Dopo aver anestetico un pollo livorno specifico privo di agenti patogeni di 10 settimane, impostare i monitor per le misurazioni vitali e iniziare a rimuovere manualmente le piume dall'addome con una leggera trazione.

Quindi, strofinare il sito chirurgico utilizzando gluconato di clorexidina con un pennello a setole morbide. Strofinare delicatamente la pelle dal centro alla periferia per cinque minuti senza invertire il percorso. Quindi, eseguire tre passaggi alternati sul sito chirurgico con soluzione di gluconato di clorexidina e alcol isopropile usando garze sterili.

Ancora una volta, vai dal centro alla periferia, quindi, drappeggi il pollo. Inizia aprendo il drappo sopra il sito chirurgico, quindi fai un'incisione della pelle della linea mediana bassa a forma di L con un bisturi numero tre, iniziando una coccola di un centimetro allo sterno e terminando a un centimetro cranica alla cloicha. Successivamente, continuare l'incisione a forma di L perpendicolare alla prima facendo una seconda incisione a partire dall'estremità coccola della prima incisione e continuare di cinque centimetri sul lato sinistro dell'addome seguendo la linea del bacino.

Questa apertura consentirà una facile estrazione dell'intestino. Successivamente, aprire il peritoneo e i muscoli addominali utilizzando lo stesso modello a forma di L per accedere alla cavità addominale. Le sacche d'aria saranno ora esposte e devono essere mantenute umidi usando garza imbevuta salina.

Successivamente, inserire un gancio spay Snook nella cavità addominale seguendo la parete addominale sinistra e lavorando il gancio intorno alle sacche d'aria addominali per estrarre l'intestino. Quindi, usando una garza secca, continuare ad esternalizzare delicatamente l'intestino per esporre il Jejunum. Stendere l'intestino e mantenerli umidi con frequenti irrorazione con saline e coprendoli con garza imbevuta di salina.

È importante essere molto delicati mentre si esempa l'intestino perché una tensione eccessiva può rompersi i vasi mesenterici che possono portare a lesioni ischemiche intestinali e compromettere notevolmente l'esito della procedura. Dopo aver esteriore l'intestino, fai una serie di anelli nell'intestino a partire dal Jejunum. Ogni ciclo può essere utilizzato per un trattamento diverso.

Nel Jejunum prossimale, posizionare una legatura semplice con un materiale assorbibile sintetico multifilamento poliglutamina evitando la legatura dei principali vasi mesenterici. Quindi, posizionare una legatura distale a due centimetri di distanza dalla legatura prossimale per completare il primo ciclo. Tutte le legature prossimali e distali devono essere distanziate di circa due centimetri.

Ogni coppia di legature crea un anello, che è un segmento ermetico. Quindi, creare un interloop o un segmento di intestino tra i loop. Posizionare una legatura semplice mezzo centimetro aborely alla legatura distale del primo anello.

Questa legatura è al centro dell'interlopo e diminuirà la possibile contaminazione incrociata tra i loop. Ora, continua il modello di creare un altro anello aborely mezzo centimetro dalla legatura interloop. Qui, vengono creati nove anelli e otto interloopi che coprono 26 centimetri di intestino.

Il numero di loop può essere regolato in base alle esigenze. Quindi, procedere con il ceppo di iniezione di Clostridium perfringens nei loop. Nel lato anti-mesenterico dell'anello, utilizzare un ago calibro 26 con un angolo di 45 gradi per iniettare 0,2 millilitri di soluzione BHI, contenente un milione di unità di colonia che formano unità di batteri nella fase di crescita del midlog.

In questa situazione, con nove anelli, cinque diversi ceppi vengono iniettati in anelli alternati con i loop intermedi iniettati con il solo veicolo come controlli negativi. Dopo aver iniettato gli agenti patogeni, sostituire delicatamente il tratto intestinale nell'area dorsale della cavità addominale sotto le sacche d'aria. Quindi, chiudere la cavità addominale.

Suturare i muscoli peritoneo e addominale lungo il bacino con un semplice modello di sutura continua utilizzando un materiale sintetico assorbibile multifilamento in poliglutamina. Continuare suturando il peritoneo e i muscoli addominali dallo sterno al cloiche usando semplici suture continue. Successivamente, suturare la pelle chiudere utilizzando un materiale sintetico poliglutamina multifilamento e un semplice modello continuo.

In primo luogo, sutura lungo il bacino, quindi sutura dallo sterno al cloiche. Dopo aver chiuso le incisioni, tenere il pollo in anestesia generale con un uso corretto degli analgesici per ridurre al minimo il dolore animale durante il tempo di infezione. Continuare il monitoraggio anestetico per garantire un livello adeguato di anestesia.

Dopo la quantità desiderata di tempo di infezione, come sette ore nel presente esperimento, eutanasiare l'uccello e raccogliere i tessuti intestinali. Usando un bisturi numero tre, ritaglia una sezione ad anello da mezzo a un centimetro. Quindi, trasferire la sezione al 10%Formalin per la fissazione notturna e ulteriori analisi istopatologiche.

Quindi, utilizzare la stessa lama bisturi sullo stesso anello per tagliare il resto del ciclo e trasferire quel tessuto in un tubo microfuso per l'isolamento dei batteri. Ripetere questa procedura per ogni ciclo utilizzando ogni volta una nuova lama bisturi. Sette ore dopo l'iniezione, un anello intestinale iniettato con un mezzo sterile di controllo ha un bordo intatto della spazzola della mucosa senza necrosi.

Una lieve congestione negli strati intestinali dei segmenti non è rara. Sette ore dopo l'iniezione con l'agente patogeno, Clostridium perfringens, le punte di villi vengono erose con siti di ingresso necrotici che circondano le punte. E poi materiale necrotico che circonda i villi, ci sono ammassi di grandi batteri a forma di asta.

A volte la necrosi è dovuta a una cattiva esecuzione procedurale e può essere fraintesa come lesioni prodotte dai batteri. Un segno rivelatore è l'assenza di batteri nella sezione istologica. Inoltre, i vasi sanguigni nello strato muscolare sono gravemente dilatati dall'accumulo di molti eriociti degenerati indicativi della congestione vascolare.

Ciò è stato causato da vasi sanguigni mesenterici legati che probabilmente sono stati legati per fare un eccessivo sforzo fisico sull'intestino. I loop ischemici possono essere facilmente identificati microscopicamente durante le procedure chirurgiche. A seguito di una grave congestione vascolare pochi minuti dopo la legatura, la serosa sarà blu scuro invece della sua normale colorazione rossastra rosa.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare più anelli intestinali in un modello di pollo posizionando le legature sull'intestino. Una volta padroneggiate le procedure chirurgiche, escluso il tempo di infezione, possono essere eseguite in meno di tre ore, se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere il pollo in anestesia profonda per controllare il dolore e monitorare i segni vitali durante tutte le procedure, inclusa la parte chirurgica e dopo il tempo di infezione.

Seguendo questa procedura o i loro metodi come l'isolamento batterico, e l'identificazione diretta come il rilevamento genico da parte della PCR può essere eseguita al fine di rispondere a domande esterne come il recupero e l'identificazione dell'agente patogeno iniettato iniziale. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della patogenesi di Clostridium perfringens per esplorare l'enterite necrotica nei polli. Non dimenticare che lavorare con animali vivi può essere estremamente variabile.

E precauzioni come il monitoraggio anestetico continuo del pollo dovrebbero sempre essere fatte durante l'esecuzione di questa procedura.