Name: Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Scopri come stabilire colture organotipiche tridimensionali degli organi sensoriali vestibolari e uditivi murini. Questo metodo preserva l'architettura tissutale innata e consente la stimolazione meccanica e il trasferimento genico virale per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno.

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Ringraziamo il dottor A. Jacobo, Dr. J. Salvi e r. Petelski per i loro contributi alla ricerca originale su cui si basa questo protocollo. Ringraziamo anche i lama J. e W. Makmura per assistenza tecnica e la zootecnia. Riconosciamo la sovvenzione NIDCD formazione DC009975 T32, NIDCD concedere R01DC015530, fondo di sviluppo terapeutico Robertson e il fondamento della famiglia Caruso per il finanziamento. Infine, riconosciamo supporto da Howard Hughes Medical Institute, di cui il Dr. Hudspeth è un investigatore.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso comitati della Rockefeller University e della University of Southern California.
1. (opzionale) preparazione di collagene soluzione da tendini di vista
Nota: Collagene sono soluzioni sono disponibili in commercio. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione del gel.
<ol><li>Eutanasia: 5-10 topi di giovane adulto (3-5 settimane) di qualsiasi ceppo di tipo selvaggio con anidride carbonica in conformità del protocollo approvato dai pertinenti istituzionale Animal Care e uso Comitato16. Raccogliere le code e disinfettarle immergendo in etanolo al 70% per un minimo di 4 ore a temperatura ambiente. Nota: Incubazione per oltre 48 h dovrebbe essere evitato, in quanto provoca disidratazione del tessuto in eccesso e ostacola il processo di estrazione del tendine.</li>
	<li>Togliere la pelle da ogni coda introducendo un taglio longitudinale con un bisturi e ritraendo tutta la pelle con il forcipe. Trasferire le code dalla pelle in una capsula Petri 100 mm riempito con etanolo al 70% pulito e tagliarli in segmenti di 10 mm. Nota: Gettare le parti più sottili delle code, che sono difficili da manipolare.</li>
	<li>Usando il forcipe, fissare ogni segmento della coda fino in fondo la capsula di Petri e utilizzare un secondo paio di una pinzetta per estrarre i tendini dalla coda uno alla volta. Fibre tendinee individuali dovrebbero emergere con una resistenza minima. Nota: Vecchio, noioso forcipe #5 funzionano bene per questo passaggio.</li>
	<li>Preparare 100 mL di soluzione di acido acetico in acqua sterile di grado molecolare 0,1% (in volume) e aggiungere 10 mL della soluzione a una capsula di Petri sterile 100 mm. Trasferire i tendini per la capsula di Petri e lasciare per 1 h a temperatura ambiente per denaturare il collagene I.</li>
	<li>Utilizzare un paio di forbici bisturi o iridectomy sterile con punte smussate, curve per tritare il tendine in frammenti di 1-2 mm. Trasferire i tendini macinati in una provetta sterile da 50 mL e aggiungere acido acetico 0,1% per portare il volume a 50 mL. Nota: Utilizzare quattro o cinque con code per ogni 50 mL di acido di raggiungere un collagene concentrazione di 2.0-2.5 mg/mL.</li>
	<li>Refrigerare il collagene soluzione a 4 ° C per un minimo di 48 h per facilitare la denaturazione di proteine complete. Vortice Vortex da tavolo impostato alla massima velocità per 1 minuto due volte al giorno.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina della soluzione usando il dosaggio di acido bicinconinico, regolare il collagene ho concentrazione a 2.0-2.5 mg/mL aggiungendo 0,1% soluzione di acido acetico e archivio a 4 ° C. Nota: Collagene soluzione può essere conservata per uno o due anni.</li>
	<li>(Opzionale) Centrifugare il collagene soluzione a 2.000 x g per 1 h a 4 ° C e uso la frazione superiore traslucida (circa la metà del volume), per raggiungere otticamente chiaro collagene gel nella sezione 4.</li>
</ol>2. dissezione degli organi vestibolari e uditivi
<ol><li>Eutanasia topi incinti di qualsiasi ceppo con anidride carbonica in conformità del protocollo approvato dai pertinenti istituzionale Animal Care e uso Comitato16. Estrarre e decapitare gli embrioni. Nota: LFNG-CreERT2/tdTomato topi possono essere utilizzati per consentire l'etichettatura permanente di sostegno le cellule su esposizione a 4-hydroxytamoxifen17.</li>
	<li>Sterilizzare tutte le superfici di lavoro e strumenti per la dissezione, tra cui due paia di pinze #5 e un coltello di capelli18, di pulirli con etanolo al 70%.</li>
	<li>Dividere ogni testa in due metà con l'introduzione di un taglio longitudinale con un bisturi sterile o utilizzando due paia di pinze #5. Estrarre le ossa temporali, che contengono le orecchie interne19e inserirli in 15 mL di soluzione salina bilanciata di Hank ghiacciata (HBSS) in una capsula di Petri 60mm. Tenere il piatto sul ghiaccio. Nota: Embrioni in una gamma di livelli da E13.5 a E18.5 sono stati utilizzati con successo.</li>
	<li>(Opzionale) Lavare le orecchie interne agitando delicatamente in una provetta conica da 50 mL contenente 30 mL HBSS ghiacciata e sostituendo l'HBSS tre o quattro volte. Tenere il tubo sul ghiaccio. Nota: Questo passaggio limita la possibile contaminazione della coltura del tessuto e porta rapidamente la temperatura a 4 ° C, che impedisce la morte delle cellule e di degradazione del tessuto.</li>
	<li>Utilizzando due coppie di una pinzetta #5, separare le orecchie interne dall'osso temporale e trasferire le orecchie, tre o quattro alla volta, in una capsula di Petri 60 mm riempito con HBSS ghiacciata.</li>
	<li>Sezionare gli organi sensoriali vestibolari.<ol>
<li>Orientare il lato mediale di orecchie fino e individuare il utricle. Con due paia di pinze #5, rimuovere la cartilagine che circonda gli organi vestibolari. Delicatamente recidere il nervo vestibolare, la connessione tra l'utricolo e sacculo, canali semicircolari, come mostrato nella Figura 1. Tirare delicatamente il utricle e l'annesso Ampolle dei canali semicircolari superiori e orizzontali dall'orecchio. Nota: Questo metodo può essere utilizzato su orecchie interne delle fasi E16.5 - E18.5. Conservare i frammenti di cartilagine per sezione 3 riportata di seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sezionare la coclea.<ol>
<li>Rimuovere il tessuto cartilaginoso che circonda l'organo dell'udito con due paia di pinze #5. Come mostrato nella Figura 1, delicatamente di interrompere la connessione tra la base coclea e il saccule. Nota: Per fasi E13.5 - e 14.5, ammorbidiscono la cartilagine prima della dissezione trattando l'interno orecchie con 0,25% collagenosi in soluzione tampone fosfato salino (PBS) per 5 min a temperatura ambiente. Conservare i frammenti di cartilagine per sezione 3 riportata di seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 200-µ l munito di una punta larga antiaderente, trasferire la utricles e coclee ad una capsula di Petri 30 mm riempito con terreno di coltura costituito da DMEM/F12 completati con 33 mM DGlucosio, bicarbonato di sodio di 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic acido (HEPES), glutamina di 1 mM, 1mm nicotinammide, 20 mg/L fattore di crescita epidermico, fattore di crescita dei fibroblasti di 20 mg/L, 10 mg/L insulina, transferrina 5,5 mg/L e selenito di sodio 5 µ g/L.</li>
	<li>Mantenere i preparativi utricolo per fino a 3 h a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica per permettere la guarigione dei tagli nell'epitelio introdotto durante la dissezione. Preparazioni di coclea devono essere trasferiti direttamente sul gel di collagene 10 min dopo la dissezione. Nota: Poiché la dissezione viene eseguita in HBSS ghiacciata, non c'è nessuna necessità di pre-riscaldare il mezzo di crescita a 37 ° C.</li>
</ol>3. (facoltativo) regolare collagene mi Gel rigidità con l'aggiunta di concentrazioni variabili di condrociti
Nota: Il metodo per l'isolamento dei condrociti è stato modificato da Gosset et al. 20
<ol><li>Preparare una soluzione di 1% di collagenasi I a sterile 1X PBS e archivio aliquote di 100-200 µ l a-80 ° C. Scongelare il ghiaccio quando necessario, evitando più cicli di gelo-disgelo.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per raccogliere i pezzi di cartilagine lasciati dalla dissezione dell'apparato uditivo e vestibolare dalle orecchie di 10-12. Tessuti connettivi e orecchio interno separati dalla cartilagine. Trasferire la cartilagine a una capsula di Petri 30mm e aggiungere 300 µ l di terreno di coltura sterile.</li>
	<li>Usare le forbici di lama o iridectomy un bisturi sterile con punte curve smussate per tritare il tessuto per realizzare pezzi di cartilagine circa 0,5 mm di lunghezza.</li>
	<li>Aggiungere collagenosi io al medium con cartilagine per ottenere una concentrazione di enzima finale dello 0,25%. Trasferire il piatto in un'incubatrice di tessuto-coltura a 37 ° C, gasati con 5% di anidride carbonica. Pipettare vigorosamente utilizzando una pipetta da 1.000 µ l ogni 20 min fino a pezzi di cartilagine dissociano e non sono più distinguibili nella soluzione, quindi incubare per altri 20 minuti. Nota: In caso di preparazioni il utricle, condrociti isolamento può essere eseguita durante passaggio 2,9; si impiegano circa 2 ore (3-4 giri di pipettaggio).</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e regolare il volume a 10 mL con PBS 1X sterile. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS 1X sterile. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Nota: È fondamentale per lavare le cellule due volte; qualsiasi collagenosi rimanente saranno a digerire il collagene che mi gel.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 200-µ l, aggiungere 100 µ l di terreno di coltura per il pellet cellulare e pipettare delicatamente per risospendere. Contare le celle utilizzando un emocitometro e mantenerli il priore di ghiaccio da utilizzare.</li>
	<li>Per aumentare la rigidità del gel, aggiungere condrociti al collagene neutralizzato I gel soluzione (sezione 1) e mescolare velocemente per distribuire le cellule in tutto il gel prima della solidificazione. Nota: Il modulo elastico del collagene mi gel (una misura della rigidità), aumenta linearmente con il numero dei chondrocytes aggiunto11. La relazione è descritta dalla funzione lineare determinata sperimentalmente E = 206· NC + 15, in cui E è il modulo elastico in Pascal e Nc è il numero di condrociti in milioni. Per un protocollo dettagliato per gel misure di rigidezza consultare l'originale articolo11.</li>
</ol>4. Posizionare l'organo sensoriale uditiva o vestibolare in un collagene che mi Gel
<ol><li>In una provetta sterile di 1,5 mL, preparare collagene sono soluzione di polimerizzazione mescolando 160 µ l di PBS 1x 10 con indicatore di pH rosso fenolo, 133 µ l di idrossido di sodio M 0,34, 70 µ l di bicarbonato di sodio 0,9 M e 40 µ l di 1 M HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio. Nota: Questa ricetta fornisce la soluzione di polimerizzazione dovuta preparare 2 mL di collagene gel, ma possono essere scalato in base alle esigenze.</li>
	<li>Mix 100 µ l di soluzione di polimerizzazione e 400 µ l di collagene soluzione su ghiaccio pipettando delicatamente su e giù in una provetta da 1,5 mL refrigerata. Per aumentare la rigidità del gel, aggiungere 50 µ l di terreno di coltura contenente condrociti e mescolare delicatamente, come descritto nella sezione 3.</li>
	<li>Trasferire 500 µ l del collagene neutralizzato ho soluzione in una capsula di Petri 30mm refrigerati con un inserto di 10 mm con fondo di vetro o in un pozzetto di una piastra a 4 pozzetti. Nota: È fondamentale per conservare tutti i reagenti sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione rapida e irregolare del collagene I.</li>
	<li>Trasferire rapidamente le coclee o utricles al collagene neutralizzato ho soluzione e regolare gli organi alle loro posizioni desiderati con una coppia di una pinzetta o sterile capelli coltello18 . Nota: Collagene polimerizzazione diventa evidente dopo 1-2 min come la soluzione diventa torbida.</li>
	<li>Dopo la soluzione intorno al tessuto ha polimerizzato, inserire la capsula di Petri o quattro pozzetti per 20 min a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica per garantire la completa polimerizzazione.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di medium di crescita supplementato con 0.5% siero bovino fetale (FBS) per ogni scatola di Petri o 500 µ l dello stesso mezzo per pozzetto di una piastra a 4 pozzetti. Mantenere la coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica. Se lo si desidera, è possibile integrare il medium di crescita con 10 µM 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) per marcare le cellule proliferanti. Nota: Più alte concentrazioni di FBS possono essere utilizzate se lo si desidera.</li>
</ol>5. virale iniezioni nelle culture tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari
<ol><li>Sbrinare il virus desiderato sul ghiaccio e mescolare con soluzione di trypan blu in una provetta conica da 0,5 mL per ottenere una concentrazione di tintura finale dello 0,05%. Utilizzare tintura x 10-20 per evitare sostanziale diluizione del virus. Tenere il ghiaccio. Nota: L'adenovirus sierotipo 5 opere migliori per infettare cellule di supporto nell'utricolo19, considerando che virus adeno-associato Anc80 può infettare sia cellule ciliate e cellule di supporto il utricle e la coclea21.</li>
	<li>Rompere la punta di un ago di vetro preparato su un estrattore micropipetta con forcipe fine pulito mentre osservando al massimo ingrandimento di un microscopio per dissezione di binocolo. Nota: È importante ottimizzare le impostazioni sulla levetta di regolazione dell'ago. Aghi con 9 - 12mm ancore e 20 - 30 µm aperture funzionano meglio.</li>
	<li>Rimuovere una cultura di organo sensoriale dall'incubatrice. Inserire l'ago per il microinjector e riempirlo con 2-3 µ l di miscela colorante e virus. Fare avanzare l'ago nell'organo sensoriale, mentre l'osservazione sotto il microscopio per dissezione di binocolo.</li>
	<li>Guidare delicatamente la punta dell'ago attraverso gli strati epiteliali e mesenchimali del tetto di una cultura utricular tridimensionale. Iniettare la miscela virale fino a riempire la cavità del utricle e ampolle con il colorante blu. Nota: Perché permette un facile accesso agli organi sensoriali, una capsula di Petri con fondo di vetro 10 mm è ottimale per le iniezioni.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica. Nota: Quando la proteina fluorescente verde o rossa viene utilizzata il costrutto virale, la fluorescenza è apparente 24 h dopo la trasduzione virale.</li>
</ol>

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<li>Tada, M., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%3A+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I segnali molecolari che mediano crescita e differenziazione dell'orecchio interno durante lo sviluppo sono stati studiati estesamente5,6,7,8,9,10. Tuttavia, le prove ottenute dal sistema utricular modello suggeriscono che meccanici spunti, percepiti attraverso giunzioni delle cellule e l'attivazione di segnalazione Hippo, an...

Lo studio della maggior parte degli aspetti dello sviluppo dei mammiferi dell'organo è stato facilitato dai sistemi in vitro . Due metodi principali sono ora utilizzati per la coltura di organi sensoriali vestibolari: digalleggiante1 e aderente2 preparazioni. Entrambi i metodi consentono l'indagine della cellula ciliata vulnerabilità3 e rigenerazione1,4 in vitro. Inoltre, hanno i ruoli inerenti allo sviluppo della tacca5,6, Wnt7,8e fattore di crescita epidermico del recettore (EGFR)9,10 segnalazione cascades nell'orecchio interno stata stabilita, in parte, attraverso l'uso di colture in vitro di epiteli sensoriali. Tuttavia, la differenziazione e la crescita delle cellule sono controllati, non solo attraverso la segnalazione di morfogeni, ma anche attraverso segnali fisici e meccanici, ad esempio Contatti intercellulari, la rigidità della matrice extracellulare e stretching meccanico o costrizione. Il ruolo di tali stimoli meccanici è difficile da indagare nel orecchio interno in via di sviluppo in vivo. Inoltre, metodi esistenti di cultura digalleggiante ed aderente non sono adatti per questo tipo di studi in vitro. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale in collagene gel di rigidità variabile. Questo metodo in gran parte conserva l'architettura in vivo degli organi sensoriali cocleari e vestibolari e consente l'indagine sugli effetti della forza meccanica su crescita e differenziazione11.
Perché stimoli meccanici sono conosciuti per attivare eventi molecolari a valle, come l'ippopotamo signaling pathway12,13,14,15, è importante essere in grado di coniugare lo stimolo meccanico con manipolazioni genetiche e biochimiche. Il metodo di cultura qui descritto consente la consegna virus-mediata del gene e pertanto può essere utilizzato per studiare sia meccaniche che molecolare segnalazione durante lo sviluppo di orecchio interno11.

<table><tbody><tr><td>#10 Lame chirurgiche</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL punte per pipette con orifizio grande</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri con fondo in vetro da 30 mm</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 pozzetti piastra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Idrossitamoxifene</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Piastra di Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, frazione IgY di pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Sox2 (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Saggio dell'acido bicinconnico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit di imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Strumento Sutter P-97</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Emocitometro 14025092</td><td></td>HBSS <td>Gibco</td></tr><tr><td></td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iridectomia&nbsp;</td><td>Strumenti medici Zepf</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Indicatore di pH rosso fenolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo puro, 200 prove Decon</td><td>Labs&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP anticorpo</td><td>ChromoTek</td><td> 5F8</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Vortice da tavolo.</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Gli organi sensoriali dell'orecchio interno sono difficili da studiare nei mammiferi a causa della loro inaccessibilità di manipolazione sperimentale e osservazione ottica. Inoltre, anche se le tecniche di cultura esistenti consentano perturbazioni biochimiche, questi metodi non forniscono un mezzo per studiare gli effetti della forza meccanica e rigidità dei tessuti durante lo sviluppo degli organi sensoriali dell'orecchio interno. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale dell'utricolo murino intatto e coclea che supera queste limitazioni. La tecnica per la regolazione di una rigidità di matrice tridimensionale qui descritto consente la manipolazione della forza elastica opposte la crescita del tessuto. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per studiare il ruolo delle forze meccaniche durante lo sviluppo dell'orecchio interno. Inoltre, le culture consentono il recapito della virus-mediata del gene, che può essere utilizzato per esperimenti di guadagno e perdita di funzione. Questo metodo di cultura conserva le cellule ciliate innate e sostenere le cellule e serve come alternativa potenzialmente superiore alla tradizionale cultura bidimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari.

Organi sensoriali uditivi e vestibolari dalle orecchie embrionale, coltivate in 40-Pa collagene I gel che imita bassa rigidità condizioni embrionali11, mantenere relativamente normali strutture tridimensionali (Figura 1) e mantenere le cellule ciliate e sostenere le cellule (Figura 2 e Figura 3). Anche se sostenere la densità delle cellule diminuisce di oltre il 30% (test ...

Colture organotipiche tridimensionale dell'utricolo murino e coclea in otticamente deselezionare collagene gel morfologia del tessuto innata di riserva, consentono per stimolazione meccanica attraverso la regolazione della rigidità di matrice e consentono il recapito della virus-mediata del gene.

Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire colture organotipiche tridimensionali degli organi sensoriali murini, vestibolari e uditivi. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della ricerca sull'orecchio interno, come ad esempio, quali sono i ruoli della forza meccanica e della rigidità dei tessuti durante lo sviluppo degli organi sensoriali dell'orecchio interno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che conserva in gran parte l'architettura innata della coclea vestibolare e ci permette di studiare sia la segnalazione molecolare che quella meccanica durante lo sviluppo dell'orecchio interno.Il Dr. Hudspeth ed io abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che le colture tridimensionali possono fornire condizioni fisiologiche per studiare la crescita degli organi vestibolari in vitro. Innanzitutto, utilizzare il 70% di etanolo per pulire e disinfettare l'area di lavoro e tutti gli strumenti di dissezione necessari, tra cui una pinza numero cinque e un coltello per capelli. Quindi, usa una lama di bisturi sterile per eseguire un taglio longitudinale, dividi la testa del topo in due metà ed estrai le ossa temporali.Trasferire in 15 millilitri di tampone HBSS in una capsula di Petri da 60 millimetri su ghiaccio. Quindi, usa due paia di pinze numero cinque per isolare le orecchie interne dalle ossa temporali. Quindi, trasferire tre o quattro spighe alla volta in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente un tampone HBSS ghiacciato.Quindi, orienta le orecchie con il lato mediale rivolto verso l'alto per individuare l'utricolo. Usa le due paia di pinze numero cinque per rimuovere la cartilagine che circonda gli organi vestibolari. Quindi, tagliare il nervo vestibolare, la connessione tra l'utricolo e il sacculo e i canali semicircolari per liberare l'utricolo e le ampolle attaccate dalle orecchie.Se necessario, tagliare i canali semicircolari in eccesso. In alternativa, utilizzare le due paia di pinze numero cinque per rimuovere il tessuto cartilagineo che circonda l'organo uditivo. Quindi, isolare la coclea.Quindi, utilizzare una pipetta da 200 microlitri dotata di un'ampia punta antiaderente per trasferire la coclea e gli utricoli in una piastra di Petri da 30 millimetri riempita con il terreno di crescita a base di DMEM/F12. Quindi, trasferire le preparazioni cocleare e utricolare in un incubatore per colture tissutali, gasato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Questo per ottenere colture di organi con lumi chiusi.Preparare 100 microlitri di una soluzione di polimerizzazione del collagene in un tubo sterile da 1,5 millilitri. Quindi, lasciare il tubo sul ghiaccio. Quindi, rimuovere le preparazioni cocleare e utricolare dall'incubatore per colture tissutali.Preparare la soluzione di collagene neutralizzato. Per fare ciò, aggiungere 400 microlitri di collagene uno a una provetta raffreddata da 1,5 millilitri con 100 microlitri di soluzione di polimerizzazione pipettando più volte sul ghiaccio. Trasferire 500 microlitri di una soluzione di collagene neutralizzato in una capsula di Petri fredda da 30 millimetri con un inserto inferiore in vetro da 10 millimetri.Trasferire immediatamente la coclea o gli otricoli nella soluzione di collagene neutralizzato utilizzando una pipetta da 200 microlitri dotata di un'ampia punta antiaderente. Utilizzare un coltello per capelli sterile o un paio di pinze sottili per regolare gli organi nelle posizioni desiderate sotto un microscopio binoculare da dissezione. Per garantire la completa polimerizzazione, incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Dopo 20 minuti, aggiungere tre millilitri di terreno di coltura, integrato con lo 0,5% di siero fetale bovino in ciascuna capsula di Petri. Dopo aver aggiunto il terreno di coltura, incubare la coltura a 37 gradi Celsius. Innanzitutto, scongelare il virus con ghiaccio.Quindi, mescolare la sospensione virale con la soluzione di blu di Trypan in un tubo conico da 0,5 millilitri per regolare la concentrazione finale del colorante dello 0,05%Dopo aver miscelato la soluzione di blu di Trypan, lasciare le particelle virali sul ghiaccio. Quindi, utilizzare un microscopio binoculare da dissezione per osservare la rottura della punta dell'ago di vetro, preparato su un estrattore per micropipette con una pinza pulita e fine. Innanzitutto, rimuovi la coltura dell'organo sensoriale dall'incubatrice.Collegare l'ago al microiniettore. Riempi l'ago con due o tre microlitri di colorante e miscela virale. Guarda attraverso il microscopio binoculare da dissezione mentre inserisci l'ago nell'organo sensoriale.Continuate a far avanzare la punta dell'ago attraverso gli strati mesenchimali ed epiteliali del tetto di una coltura utricolare tridimensionale. Continuare a iniettare la miscela virale fino a quando le cavità dell'utricolo e delle fiale si riempiono con il colorante blu. Quindi, incubare la coltura dell'organo in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius gasato con il 5% di anidride carbonica.Queste sono le immagini al microscopio ottico dell'utricolo e della coltura cocleare incorporate nel gel tridimensionale di collagene uno. L'utricolo e la coclea sono ottenuti da embrioni di 17,5 e 14,5 giorni, rispettivamente, e coltivati per 48 ore. Queste immagini microscopiche confocali mostrano l'utricolo embrionale di 18,5 giorni appena prima e dopo l'espianto nel gel di collagene 40PA.Dopo tre giorni di coltura, quasi l'80% delle cellule ciliate positive per Myo7A rimane intatto. La densità cellulare di supporto diminuisce di oltre il 30% e la densità delle cellule ciliate diminuisce del 60% dopo tre giorni in colture utricolari. Queste immagini microscopiche confocali mostrano una coclea embrionale di 14,5 giorni appena prima e dopo l'espianto nel gel di collagene 40PA.Dopo tre giorni di coltura, le cellule ciliate interne ed esterne positive per Myo7A e Sox2 sono morfologicamente distinguibili e sono organizzate in circa quattro o cinque file. Qui, le immagini mostrano l'infezione virale riuscita delle cellule di supporto alla base del cocleare e in tutte le colture tridimensionali utricolari ottenute rispettivamente da 15,5 e 17,5 giorni di embrioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare gli organi sensoriali intatti dell'orecchio interno, stabilire colture tridimensionali di utricolo e coclea e gel di collagene di tipo uno ed eseguire trasfezioni virali in quelle colture tridimensionali.Ricorda che lavorare con particelle virali, a seconda del carico genetico, può essere pericoloso. Le precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento dei virus, dovrebbero essere sempre praticate.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

Una semplice procedura di vibratome sezionamento dell'organo del Corti, seguito da immunoistochimica e microscopia confocale è descritto. Questa procedura consente una migliore conservazione del bene citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, e permette di conseguenza per la quantificazione precisa dei tipi di cellule.

Vibratome sezionamento per la Conservazione avanzata del citoarchitettura dell&#39;organo di Corti dei mammiferi

Questo video mostra il processo per isolare gli espianti di ganglio spirale dall'orecchio interno e co-coltivarli con l'organo di Corti su un array multielettrodo. I gangli spirale vengono accuratamente estratti e sezionati in sezioni di tessuto più piccole o espianti. Questi espianti vengono coltivati sull'area attiva dell'array multielettrodo per promuovere la crescita del processo neuronale.

Coltura di espianti di neuroni gangliari a spirale murina su array multielettrodi

Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all'interno della parte più dura del cranio, l'osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

Presentiamo un protocollo per la coltura di espianti di neuroni gangliari murini a spirale primaria su array multi-elettrodi per studiare i profili di risposta neuronale e ottimizzare i parametri di stimolazione. Tali studi mirano a migliorare l'interfaccia neurone-elettrodo degli impianti cocleari a vantaggio dell'udito nei pazienti e del consumo energetico del dispositivo.

Ganglio spirale Neuron Espianto cultura e Elettrofisiologia su Multi Electrode Array

In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Di seguito sono presentati metodi che forniscono istruzioni dettagliate per la dissezione, la dissociazione, la coltura e la registrazione di patch-clamp dai neuroni gangliari vestibolari e gangliari a spirale dell'orecchio interno.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

Il protocollo attuale aggiorna i protocolli precedenti e incorpora approcci relativamente semplici per la coltura di espianti cocleari di alta qualità. Ciò fornisce un'acquisizione dati affidabile e immagini ad alta risoluzione in cellule vive e fisse. Questo protocollo supporta la tendenza in corso nello studio delle cellule dell'orecchio interno.

Espianti cocleari neonatali interi come modello in vitro

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.

Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

Qui, descriviamo una tecnica per il prelievo di organi terminali vestibolari umani in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia e la loro analisi mediante immunocolorazione.

Prelievo di organi terminali vestibolari in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia

Scopri come stabilire colture organotipiche tridimensionali degli organi sensoriali vestibolari e uditivi murini. Questo metodo preserva l'architettura tissutale innata e consente la stimolazione meccanica e il trasferimento genico virale per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno.

Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

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