Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire colture organotipiche tridimensionali degli organi sensoriali murini, vestibolari e uditivi. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della ricerca sull'orecchio interno, come ad esempio, quali sono i ruoli della forza meccanica e della rigidità dei tessuti durante lo sviluppo degli organi sensoriali dell'orecchio interno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che conserva in gran parte l'architettura innata della coclea vestibolare e ci permette di studiare sia la segnalazione molecolare che quella meccanica durante lo sviluppo dell'orecchio interno.

Il Dr. Hudspeth ed io abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che le colture tridimensionali possono fornire condizioni fisiologiche per studiare la crescita degli organi vestibolari in vitro. Innanzitutto, utilizzare il 70% di etanolo per pulire e disinfettare l'area di lavoro e tutti gli strumenti di dissezione necessari, tra cui una pinza numero cinque e un coltello per capelli. Quindi, usa una lama di bisturi sterile per eseguire un taglio longitudinale, dividi la testa del topo in due metà ed estrai le ossa temporali.

Trasferire in 15 millilitri di tampone HBSS in una capsula di Petri da 60 millimetri su ghiaccio. Quindi, usa due paia di pinze numero cinque per isolare le orecchie interne dalle ossa temporali. Quindi, trasferire tre o quattro spighe alla volta in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente un tampone HBSS ghiacciato.

Quindi, orienta le orecchie con il lato mediale rivolto verso l'alto per individuare l'utricolo. Usa le due paia di pinze numero cinque per rimuovere la cartilagine che circonda gli organi vestibolari. Quindi, tagliare il nervo vestibolare, la connessione tra l'utricolo e il sacculo e i canali semicircolari per liberare l'utricolo e le ampolle attaccate dalle orecchie.

Se necessario, tagliare i canali semicircolari in eccesso. In alternativa, utilizzare le due paia di pinze numero cinque per rimuovere il tessuto cartilagineo che circonda l'organo uditivo. Quindi, isolare la coclea.

Quindi, utilizzare una pipetta da 200 microlitri dotata di un'ampia punta antiaderente per trasferire la coclea e gli utricoli in una piastra di Petri da 30 millimetri riempita con il terreno di crescita a base di DMEM/F12. Quindi, trasferire le preparazioni cocleare e utricolare in un incubatore per colture tissutali, gasato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Questo per ottenere colture di organi con lumi chiusi.

Preparare 100 microlitri di una soluzione di polimerizzazione del collagene in un tubo sterile da 1,5 millilitri. Quindi, lasciare il tubo sul ghiaccio. Quindi, rimuovere le preparazioni cocleare e utricolare dall'incubatore per colture tissutali.

Preparare la soluzione di collagene neutralizzato. Per fare ciò, aggiungere 400 microlitri di collagene uno a una provetta raffreddata da 1,5 millilitri con 100 microlitri di soluzione di polimerizzazione pipettando più volte sul ghiaccio. Trasferire 500 microlitri di una soluzione di collagene neutralizzato in una capsula di Petri fredda da 30 millimetri con un inserto inferiore in vetro da 10 millimetri.

Trasferire immediatamente la coclea o gli otricoli nella soluzione di collagene neutralizzato utilizzando una pipetta da 200 microlitri dotata di un'ampia punta antiaderente. Utilizzare un coltello per capelli sterile o un paio di pinze sottili per regolare gli organi nelle posizioni desiderate sotto un microscopio binoculare da dissezione. Per garantire la completa polimerizzazione, incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, aggiungere tre millilitri di terreno di coltura, integrato con lo 0,5% di siero fetale bovino in ciascuna capsula di Petri. Dopo aver aggiunto il terreno di coltura, incubare la coltura a 37 gradi Celsius. Innanzitutto, scongelare il virus con ghiaccio.

Quindi, mescolare la sospensione virale con la soluzione di blu di Trypan in un tubo conico da 0,5 millilitri per regolare la concentrazione finale del colorante dello 0,05%Dopo aver miscelato la soluzione di blu di Trypan, lasciare le particelle virali sul ghiaccio. Quindi, utilizzare un microscopio binoculare da dissezione per osservare la rottura della punta dell'ago di vetro, preparato su un estrattore per micropipette con una pinza pulita e fine. Innanzitutto, rimuovi la coltura dell'organo sensoriale dall'incubatrice.

Collegare l'ago al microiniettore. Riempi l'ago con due o tre microlitri di colorante e miscela virale. Guarda attraverso il microscopio binoculare da dissezione mentre inserisci l'ago nell'organo sensoriale.

Continuate a far avanzare la punta dell'ago attraverso gli strati mesenchimali ed epiteliali del tetto di una coltura utricolare tridimensionale. Continuare a iniettare la miscela virale fino a quando le cavità dell'utricolo e delle fiale si riempiono con il colorante blu. Quindi, incubare la coltura dell'organo in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius gasato con il 5% di anidride carbonica.

Queste sono le immagini al microscopio ottico dell'utricolo e della coltura cocleare incorporate nel gel tridimensionale di collagene uno. L'utricolo e la coclea sono ottenuti da embrioni di 17,5 e 14,5 giorni, rispettivamente, e coltivati per 48 ore. Queste immagini microscopiche confocali mostrano l'utricolo embrionale di 18,5 giorni appena prima e dopo l'espianto nel gel di collagene 40PA.

Dopo tre giorni di coltura, quasi l'80% delle cellule ciliate positive per Myo7A rimane intatto. La densità cellulare di supporto diminuisce di oltre il 30% e la densità delle cellule ciliate diminuisce del 60% dopo tre giorni in colture utricolari. Queste immagini microscopiche confocali mostrano una coclea embrionale di 14,5 giorni appena prima e dopo l'espianto nel gel di collagene 40PA.

Dopo tre giorni di coltura, le cellule ciliate interne ed esterne positive per Myo7A e Sox2 sono morfologicamente distinguibili e sono organizzate in circa quattro o cinque file. Qui, le immagini mostrano l'infezione virale riuscita delle cellule di supporto alla base del cocleare e in tutte le colture tridimensionali utricolari ottenute rispettivamente da 15,5 e 17,5 giorni di embrioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare gli organi sensoriali intatti dell'orecchio interno, stabilire colture tridimensionali di utricolo e coclea e gel di collagene di tipo uno ed eseguire trasfezioni virali in quelle colture tridimensionali.

Ricorda che lavorare con particelle virali, a seconda del carico genetico, può essere pericoloso. Le precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento dei virus, dovrebbero essere sempre praticate.