Valutazione dell'inclusione dell'esone indotta da impiombare commutazione oligonucleotidi antisenso in fibroblasti del paziente di SMA
11 maggio 2018
Vari oligonucleotidi antisenso (AON) sono stati indicati per indurre l'inclusione dell'esone (modulazione della giuntura) e salvataggio espressione SMN per l'atrofia muscolare spinale (SMA). Qui, descriviamo un protocollo per AON presenti per indurre l'inclusione dell'esone del gene SMN2 e i metodi di valutazione per determinare l'efficacia in fibroblasti di pazienti SMA.
L'obiettivo generale di questo protocollo di lipotrasfezione è quello di introdurre oligonucleotidi antisenso nelle cellule e valutare l'efficacia di questi farmaci sull'inclusione dell'esone nelle cellule SMA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia antisenso. Ad esempio, l'efficacia di nuovi oligo antisenso per fornire un trattamento ai pazienti.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è abbastanza veloce, facile e sensibile per il test di varie sostanze chimiche oligonucleotidiche antisenso. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per la trasfezione di oligo antisenso in fibroblasti, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, come i mioblasti primari e varie altre linee cellulari. A dimostrare la procedura sarà Aleks, un tecnico del mio laboratorio.
Innanzitutto, scongelare una soluzione da 10 micromolari di mix LNA/DNA su ghiaccio. Diluire la soluzione di miscelatore in terreno privo di siero alla concentrazione richiesta in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, diluire il reagente di trasfezione e aggiungere il reagente di trasfezione diluito al miscelatore in un rapporto di uno a uno.
È fondamentale che la confluenza cellulare sia compresa tra il 65 e l'80% durante la trasfezione. Se la confluenza è superiore all'80%, l'efficienza di trasfezione sarà ridotta. Quindi, incubare la miscela di reagenti di trasfezione a temperatura ambiente per 10 minuti.
Dopo 10 minuti, pipettare 900 microlitri di terreno privato di siero con il 5% di siero fetale bovino nel tubo. Non aggiungere l'FBS prima dell'incubazione con il reagente di trasfezione e i miscelatori LNA/DNA, poiché influisce anche sull'efficienza della trasfezione. Quindi, aspirare il vecchio terreno dalla piastra di coltura.
Ora, aggiungere un millilitro del terreno contenente il miscelatore LNA/DNA alla piastra di coltura. Quindi, lasciare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24-48 ore. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno dalla piastra di coltura.
Quindi, versare un millilitro di reagente GPC nelle cellule. Successivamente, lavare più volte i pozzetti con il reagente GPC. Dopo diversi lavaggi, raccogliere le cellule in una provetta da 1,5 millilitri e conservare i campioni in ghiaccio.
Quindi, agitare il tubo ad alta velocità per 30 secondi. Quindi, conservare il tubo a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Ora, scongelare il campione a temperatura ambiente e vorticarlo rapidamente.
Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio al campione e agitarlo energicamente per 15 secondi. Quindi, incubare la provetta a temperatura ambiente per tre minuti. Dopo tre minuti, centrifugare il campione a 12.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Una volta terminata la centrifugazione, raccogliere la fase acquosa dalla parte superiore della provetta da centrifuga. Quindi trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di isopropanolo e un microlitro di otto microgrammi per microlitro di glicogeno di grado RNA alla fase acquosa.
Agitare rapidamente il campione per 10 secondi e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante al termine della corsa.
Aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 75% e agitare brevemente per lavare il pellet ottenuto. Anche in questo caso, centrifugare il campione a 7500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, espellere tutto l'etanolo ed essiccare il pellet a temperatura ambiente.
Dopo che il pellet si è asciugato, scioglierlo in 30 microlitri di acqua priva di DNAsi/RNAsi. Quindi, incubare il campione a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, leggi la concentrazione dell'RNA a 260 nanometri nello spettrofotometro e regolala a 15 nanogrammi per microlitro.
Per costituire la miscela master RT-PCR, aggiungere i due tamponi di reazione X RT-PCR, la miscela di enzimi RT-PCR in una fase, i primer diretti e inversi e l'acqua distillata priva di RNAsi/DNAsi. Distribuire la miscela master in provette per PCR da 0,2 millimetri e aggiungere l'RNA totale per ciascun campione. Quindi avviare la reazione PCR.
Al termine della RT-PCR, aggiungere cinque microlitri di colorante di caricamento sei X al prodotto amplificato. Quindi, caricare cinque microlitri della miscela su un gel di agarosio al 2%. Avviare l'unità di elettroforesi a 100 volt per 40 minuti.
Innanzitutto, viene studiata l'efficienza dei diversi miscelatori. Per fare ciò, viene analizzata l'inclusione dei livelli dell'esone 7 e di GAPDH di SMN2 nei fibroblasti SMA trasfettati con i mixmer. L'immagine del gel mostra l'inclusione dell'esone 7 dove le bande superiore e inferiore rappresentano l'RNA SMN2 incluso ed escluso dell'esone 7.
Anche l'efficienza dell'inclusione è quantificata tra il 78 e il 98% quando viene trasfettato con i miscelatori da uno a cinque. D'altra parte, non si ottengono risultati significativi quando si utilizzano i mixmer da sei a otto per trasfettare i fibroblasti SMA del paziente rispetto al controllo. Nell'esperimento, GAPDH viene utilizzato come controllo.
Successivamente, viene eseguita la PCR quantitativa per analizzare l'espressione relativa dell'intera lunghezza di SMN2 rispetto a GAPDH. Si osserva un forte aumento della quantità del livello di trascrizione SMN2 quando trasfettato con i mixmer da uno a tre e numero cinque, rispetto al controllo. Viene studiato anche il livello di espressione della proteina SMN, che mostra un aumento del livello di espressione della proteina SMN nel paziente fibroblasto trasfettato con i mixmer da uno a cinque.
Si osserva un forte aumento da 1,5 a 1,9 volte del livello della proteina SMN. In questo caso, il controllo utilizzato è la cofilina. Al contrario, i mixmer da sei a otto non alterano il livello di espressione della proteina SMN.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare l'oligo antisenso in fibroblasti e valutarne l'efficacia in vitro.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo di lipotrasfezione per l'introduzione di oligonucleotidi antisenso (AONs) nelle cellule al fine di indurre l'inclusione di esoni nel gene SMN2, con l'obiettivo di trattare l'atrofia muscolare spinale (SMA). L'efficacia di questo metodo viene valutata in fibroblasti di pazienti affetti da SMA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia cellulare
Sfondo
- La atrofia muscolare spinale (SMA) è un disturbo genetico che colpisce i motoneuroni.
- Gli oligonucleotidi antisenso possono modulare lo splicing e ripristinare l'espressione di SMN.
- Metodi di somministrazione efficaci per gli oligonucleotidi antisenso sono fondamentali per le applicazioni terapeutiche.
- Questo protocollo consente di testare diverse chimiche di oligonucleotidi antisenso.
Scopo dello studio
- Introdurre efficacemente gli AON nelle cellule di SMA.
- Valutare l'efficacia degli AON nell'indurre l'inclusione degli esoni.
- Fornire un metodo rapido e sensibile per testare gli AON.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione lipidica di oligonucleotidi antisenso in fibroblasti.
- Valutazione dell'inclusione degli esoni nel gene SMN2.
- Applicazione del metodo a diversi tipi cellulari, inclusi i mioblasti primari.
- Dimostrazione della procedura da parte di un tecnico di laboratorio.
Risultati principali
- Il metodo di lipotrasfezione è efficace per il rilascio di AON.
- È stata indotta con successo l'inclusione dell'esone nel gene SMN2.
- Il protocollo è adattabile a diversi tipi cellulari.
- I risultati supportano il potenziale degli AON come trattamento per la SMA.
Conclusioni
- Questo protocollo di lipotrasfezione è uno strumento prezioso per la ricerca sulla terapia antisense.
- Permette di testare rapidamente l'efficacia degli AON nelle cellule SMA.
- Studi futuri potranno ampliare questo metodo per esplorare nuovi AON.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per gli Esperti
Questo protocollo consente una valutazione rapida e sensibile dell'efficacia di oligonucleotidi antisenso (AON) nell'indurre l'inclusione dell'esone SMN2 in fibroblasti derivati da pazienti, supportando la validazione precoce del bersaglio e l'identificazione di candidati promettenti per terapie modulatrici dello splicing. Quantificando l'inclusione dell'esone e il ripristino della proteina a basse concentrazioni di AON, fornisce un'elevata affidabilità predittiva per la selezione di candidati con potenza migliorata e profili di tossicità ridotta. L'adattabilità del metodo a diversi tipi cellulari e chimiche facilita la riduzione dei rischi preclinici e la continuità traslazionale nei percorsi di sviluppo farmacologico per la SMA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando l'efficienza dell'inclusione dell'esone 7 di SMN2 come lettura funzionale dell'interazione con il bersaglio.
- Valore operativo: Utilizza RT-PCR e qPCR per quantificare l'inclusione dell'esone e i livelli di trascritto, fornendo risultati quantitativi e riproducibili per la validazione del bersaglio.
- Valore predittivo: Mostra il ripristino della proteina SMN in modo dose-dipendente mediante Western blot, supportando la riduzione del rischio meccanicistico e la selezione di candidati AON nel portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Stabilisce un flusso di lavoro basato sulla lipotrasfezione, compatibile con test ad alto rendimento di diverse chimiche di AON, inclusi mixmer LNA/DNA.
- Riproducibilità: Standardizza le condizioni di trasfezione (confluenza del 65–80%, rapporti tra reagenti) e la normalizzazione rispetto ai controlli GAPDH e cofilina, garantendo coerenza tra esperimenti.
- Scalabilità: Compatibile con mioblasti primari e altre linee cellulari, consentendo il riutilizzo della piattaforma in modelli pertinenti per le malattie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la Malattia: Utilizza fibroblasti di pazienti affetti da SMA per mantenere la fedeltà genetica e fenotipica, migliorando la validità traslazionale dei dati di screening degli AON.
- Continuità Preclinica: Collega l'inclusione degli esoni all'espressione della proteina SMN, fornendo un collegamento meccanicistico dalla modulazione del bersaglio molecolare al ripristino fenotipico funzionale.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate sull'efficienza di inclusione degli esoni (78–98%) e sul fold-change della proteina (1,5–1,9), riducendo il rischio biologico in fase avanzata.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, consentendo una valutazione iterativa dell'efficacia degli AON prima degli studi in vivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di splicing alternativo quantificando l'inclusione degli esoni ed escludendo effetti fuori bersaglio mediante normalizzazione rispetto a GAPDH.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e risultati quantitativi (percentuale di inclusione dell'esone, variazione del trascritto rispetto al controllo) per una valutazione affidabile di composti attraverso diverse chimiche di oligonucleotidi antisenso (AON).
- Analisi: Genera letture quantitative (quantificazione delle bande da RT-PCR, espressione relativa da qPCR, livelli proteici da Western blot) che permettono l'analisi comparativa tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega l'efficacia molecolare al ripristino proteico in cellule derivate da pazienti, favorendo l'allineamento con biomarcatori e la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato di lipotrasfezione applicabile a diversi tipi di AON e sistemi cellulari, riducendo lo sviluppo ridondante di metodi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile della validazione dell'obiettivo attraverso la misurazione diretta dell'inclusione degli esoni e del ripristino della proteina SMN.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e sensibilità per il test di diverse chimiche di AON a basse concentrazioni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto collegando l'efficienza di inclusione degli esoni all'espressione proteica, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati AON adeguata al rischio, basata su soglie quantitative di efficacia.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione degli acidi nucleici, nell'ottimizzazione della trasfezione e nell'analisi di RNA e proteine.
- Dipende dalla compatibilità del reagente di trasfezione, dallo spettrofotometro per la quantificazione dell'RNA e da strumentazione per elettroforesi su gel, qPCR o Western blot.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro delle condizioni di trasfezione (confluenza, rapporti tra reagenti) e della normalizzazione dei controlli (GAPDH, cofilina) per ottenere risultati riproducibili.
- L'adattamento a mioblasti primari o ad altre linee cellulari potrebbe richiedere un'ottimizzazione dell'efficienza di trasfezione e della valutazione della citotossicità.
- I limiti pratici includono la variabilità nel numero di passaggi dei fibroblasti provenienti da pazienti e la necessità di preservare l'integrità dell'RNA durante l'estrazione.
