Förster Time-resolved omogeneo risonanza energia basati su trasferimento test per la determinazione della secrezione dell'insulina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre e quantificare accuratamente i livelli di insulina secreta dalle cellule secernenti insulina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del diabete, come i principali meccanismi alla base della secrezione di insulina stimolata dal glucosio nelle cellule beta pancreatiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può quantificare in modo accurato e rapido la secrezione di insulina in risposta alla stimolazione del glucosio e rilevare potenziali effetti del farmaco sulla secrezione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla scoperta di farmaci per il trattamento del diabete di tipo 2, perché ci permetterà di comprendere meglio i meccanismi della disfunzione metabolica indotta dai farmaci. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla secrezione di insulina da linee cellulari beta immortalizzate, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le isole pancreatiche intatte. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, a causa di molteplici fasi di manipolazione delle cellule e preparazioni di farmaci.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo elaborare un test rapido per studiare le azioni dei farmaci dopaminergici sulla secrezione di insulina. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di manipolazione delle cellule sono difficili da apprendere a causa della natura delicata delle cellule e dell'importanza della precisione per garantire la coerenza del test tra gli esperimenti. Innanzitutto, fai crescere le cellule INS-1E come indicato nel protocollo di testo.

Una volta che le cellule raggiungono la confluenza desiderata, aspirare il terreno. Lavare le cellule con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di tripsina allo 025% alle cellule, quindi lasciare le cellule nell'incubatore per tre o quattro minuti a 37 gradi Celsius.

Disattivare la tripsina aggiungendo nove millilitri di terreno completo. Quindi, trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi centrifugare le celle per formare un pellet.

Dopo la centrifugazione, sciogliere il pellet in cinque millilitri di terreno fresco. Pipettare 10 microlitri di cellule risospese dalla provetta e mescolare con 10 microlitri di colorante vitale blu di tripano per valutarne la vitalità. Successivamente, usa un emocitometro per contare il numero di cellule vive e morte e assicurarti che il 90% delle cellule sia vivo.

Dopo il conteggio, aggiungere un milione di cellule per millilitro in terreno RPMI 1640 fresco, quindi seminare 0,5 millilitri di 500.000 cellule INS-1E in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rivestita di poli-L-lisina. Lasciare la piastra nell'incubatrice per un giorno intero. Il giorno successivo, rimuovere il terreno e aggiungere 500 microlitri di terreno RPMI 1640 fresco in ciascuno dei pozzetti.

Incubare la piastra per altre 24 ore in modo che le cellule si diffondano sulle superfici del pozzetto. Per eseguire il test, preparare prima il tampone KRB, quindi aspirare il terreno da ciascuno dei pozzetti e lavare con soluzione salina tamponata con fosfato preriscaldato, due volte. Successivamente, aggiungere 450 microlitri di tampone KRB, integrato con albumina sierica bovina, ma senza glucosio, in ogni pozzetto.

Lasciare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora. Preparare diluizioni seriali dei farmaci in tampone KRB, integrato con una concentrazione finale 10X di glucosio 200 millimolare. Dopo la fase di carenza di glucosio, pipettare 50 microlitri di farmaci diluiti in serie in ciascuno dei pozzetti corrispondenti.

Per la stimolazione del glucosio, aggiungere i rispettivi farmaci diluiti in serie in presenza di glucosio 20 millimolare. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Una volta terminata la stimolazione, raccogliere i surnatanti e trasferirli in provette da centrifuga da 1,5 millilitri etichettate.

Trasferire 10 microlitri di ciascun surnatante raccolto in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 90 microlitri di KRB a ciascun pozzetto per ottenere un rapporto di diluizione da uno a 10. Mescolare le diluizioni per garantire l'omogeneità.

Quindi, ottenere la curva standard dell'insulina per il test dell'insulina HTRF. Quindi, aggiungere 10 microlitri ciascuno dei campioni di insulina standard e i surnatanti diluiti del test in una piastra a 96 pozzetti. Preparare la miscela di anticorpi in un donatore uno a due per accettare un rapporto nel tampone di rilevamento.

Dopo aver preparato la miscela di anticorpi, aggiungerne 30 microlitri a ciascuno dei pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente. Dopo due ore di incubazione, leggere la piastra con la miscela di anticorpi sul lettore di piastre.

Utilizzare l'apposito modulo ottico HTRF a 665 e 620 nanometri per la lettura e utilizzare 200 flash per ogni pozzetto. In primo luogo, viene tracciata una curva standard dell'insulina per estrapolare i valori effettivi dell'insulina dai campioni del test. La curva standard mostra che la lettura raziometrica della fluorescenza ottenuta aumenta significativamente in funzione delle concentrazioni standard di insulina umana predefinite.

Successivamente, viene studiato il livello basale di secrezione di insulina dalle cellule INS-1E in presenza o assenza di glucosio 20 millimolare. Dal grafico, si evince che le cellule secernono circa 100 nanogrammi per millilitro di insulina in presenza di glucosio. È interessante notare che il livello di insulina è quasi la metà a circa 15 nanogrammi per millilitro in assenza di glucosio.

Successivamente, le cellule vengono incubate in presenza di concentrazioni crescenti di dopamina con glucosio 20 millimolare. L'insulina secreta viene normalizzata al valore medio della percentuale massima di insulina da ciascun pozzetto. Il grafico mostra che la dopamina inibisce la GSIS, indicando così l'importanza funzionale dei recettori dopaminergici nella GSIS.

Questo grafico mostra che la bromocriptina, un farmaco per il diabete di tipo 2, è più potente nell'indurre la GSIS rispetto alla dopamina. Questo grafico mostra che con l'aumentare della concentrazione di quinpirolo, un agonista D2, sebbene meno efficiente della bromocriptina, mostra una potenza simile alla dopamina nello stimolare la GSIS. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di pipettare con cura e costanza. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri saggi funzionali come il test AMP HDRF ciclico per rispondere a ulteriori domande, come gli effetti dei farmaci dopaminergici sulla segnalazione a valle. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo per esplorare altre vie secretorie endocrine sia nelle linee cellulari immortalizzate che nelle isole pancreatiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare con precisione la secrezione di insulina dalle cellule utilizzando l'HDRF.