Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero
May 11th, 2018
Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di consentire una valutazione qualitativa e quantitativa dei pattern di arborizzazione degli assoni dei motoneuroni utilizzando il microscopio a foglio luminoso e il software di analisi delle immagini su embrioni di topo. Questo metodo può aiutare a comprendere lo sviluppo dei motoneuroni in coordinazione con il movimento complesso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile osservare e visualizzare i modelli di arborizzazione degli assoni dei motoneuroni da varie angolazioni e analizzare quantitativamente ogni singolo nervo.
A dimostrare la procedura saranno Ya-Ping Yen e Ee Shan Liau, due studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, fissare gli embrioni singolarmente in una piastra a 24 pozzetti con un millilitro di paraformaldeide al 4% appena preparata in PBS per pozzetto a quattro gradi Celsius su uno shaker durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni fissati almeno tre volte, ciascuna per 5-10 minuti, con un millilitro di PBS 1X e incubarli per una notte a quattro gradi Celsius.
Successivamente, permeabilizzare ogni embrione in un millilitro di 0,5% PBST durante la notte a quattro gradi Celsius su uno shaker. Bloccare ogni campione con un millilitro di FBS al 10% preparato in 1X PBS per una notte a 4 gradi Celsius su un agitatore. Successivamente, incubare ogni embrione con un millilitro di anticorpo primario anti-GFP a 4 gradi Celsius per 72 ore agitando costantemente.
Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare ogni embrione con un millilitro di PBST allo 0,5% nel corso di uno o due giorni a quattro gradi Celsius su uno shaker. Successivamente, applicare un millilitro di anticorpo secondario e incubare per una notte al buio a quattro gradi Celsius agitando costantemente. Il giorno seguente, lavare ogni embrione con un millilitro di PBST allo 0,5% almeno tre volte a quattro gradi Celsius su uno shaker nel corso di due o tre giorni.
Quindi, incubare ogni embrione in un reagente di chiarificazione commerciale con un indice di rifrazione di 1,49 nd in una provetta da 1,5 millilitri protetta dalla luce a temperatura ambiente per una notte. Imposta ottiche di illuminazione 5X/0,1 e ottiche di rilevamento 5X/0,16. Assemblare il portacampioni e il capillare del campione.
Preparare la camera del campione riempiendola con una soluzione chiarificante. Per montare l'embrione, preparare una punta per pipetta P200 tagliando la parte superiore in modo che si adatti al diametro del capillare e rimuovere la parte appuntita per l'attacco del campione. Quindi, sciogliere l'estremità smussata del puntale della pipetta usando una piccola fiamma.
Spegni la fiamma e attacca rapidamente l'embrione verticalmente all'estremità fusa. Inserire la parte superiore della punta della pipetta con il capillare del campione e inserire la camera del campione preparata nel microscopio. Utilizzando il software di imaging, selezionare Individua capillare nella scheda Individua e regolare gli assi X, Y e Z.
Quindi, seleziona Individua campione e ingrandisci su 0,6X per mettere a fuoco l'embrione. Lasciare che il tampone della camera si equilibri con l'embrione per un po' di tempo per eliminare eventuali detriti o bolle. Per l'acquisizione di immagini nella scheda Acquisizione, definire i parametri del percorso luminoso come Obiettivi di rilevamento, Filtro di blocco laser, Beam Splitter, Telecamere e Laser.
Selezionare la casella di controllo Scansione pivot per la riduzione delle ombre. Quindi, definire le impostazioni di acquisizione, Bit Bepth a 16 bit, Zoom nell'intervallo tra 0,36 e 0,7X, illuminazione a sito singolo o a doppio sito. Fare clic su Continuo e impostare l'intensità del laser, il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione del foglio luminoso.
Successivamente, premere Stop per terminare l'acquisizione dell'immagine. È importante assicurarsi che il campione trasparente sia posizionato all'interno del percorso luminoso più breve per consentire l'acquisizione dettagliata di immagini di strutture arborizzate fini sui singoli nervi motori. Per l'acquisizione multidimensionale, definire lo stack Z spostando la posizione z per la prima e l'ultima immagine.
Fare clic su Ottimale per impostare il numero della sezione. Quindi, fai clic su Avvia esperimento per acquisire lo Z-stack selezionato. Al termine, salva l'immagine in formato czi.
Per quantificare l'arborizzazione degli assoni, aprire il file immagine nel software di analisi dell'immaginazione. Regolare il colore, la luminosità e il contrasto dell'immagine utilizzando la finestra Regolazione schermo per rilevare i filamenti in base al contrasto dell'intensità locale. Quindi, fai clic sull'icona Aggiungi nuovi filamenti e seleziona l'algoritmo Autopath nel menu a discesa.
Seleziona la regione di interesse, quindi definisci i punti di partenza e di partenza assegnando le misure di diametro più grandi e sottili che possono essere misurate utilizzando la modalità Fetta. Assegna un punto iniziale al bordo della regione di interesse. Per ottenere l'aggiunta o la rimozione manuale dei punti iniziali, modificare prima la modalità del puntatore, navigare nella selezione, quindi tenere premuto il tasto Maiusc e fare clic con il pulsante destro del mouse sui punti di interesse.
Quindi, selezionare le soglie manuali per i punti di partenza per assicurarsi che tutta l'arborizzazione visibile sia contrassegnata. Quindi, aggiungi o rimuovi manualmente i punti di partenza. Seleziona la casella Rimuovi segmenti disconnessi e rimuovi i punti di partenza attorno ai punti iniziali.
Successivamente, regolare la soglia per la sottrazione dello sfondo e terminare il processo. È necessario rimuovere gli artefatti di fondo e confermare che il percorso del rivelatore rifletta la vera arborizzazione degli assoni per una quantificazione accurata. Alla fine, scegli lo stile e il colore desiderati.
Nella scheda Statistiche, selezionare Dettagliato e utilizzare il numero del filamento, i punti terminali dei dendriti per quantificare i terminali nervosi motori come indicatore dell'arborizzazione dell'assone motore. Quindi, esporta l'immagine dell'assone ricostruito come file tiff. LSFM fornisce una visualizzazione 3D dettagliata dell'arborizzazione dell'assone motorio negli embrioni di topo.
I motoneuroni sono sottoposti al protocollo sopra descritto e marcati con GFP espressa transgenicamente. Per visualizzare l'arborizzazione degli assoni in modo più dettagliato ed eseguire la quantificazione, l'ingrandimento può essere regolato in modo da poter rivelare ogni struttura finemente arborizzata. Infine, il modello di arborizzazione degli assoni dei singoli nervi degli arti anteriori può essere ricostruito utilizzando un software di analisi delle immagini.
L'algoritmo autopath nel software traccia il filamento e quantifica il numero totale di terminali assoni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni e immagini degli assoni dei motoneuroni di embrioni di topo utilizzando il microscopio a fluorescense a foglio luminoso. Inoltre, saprai come valutare quantitativamente il modello di arborizzazione di ogni singolo nervo motore mediante MRS.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per visualizzare la proiezione dei motoneuroni e l'arborizzazione degli assoni negli embrioni di topi transgenici Hb9::GFP. Utilizzando la microscopia a foglio di luce fluorescente, il metodo consente valutazioni qualitative e quantitative dei modelli degli assoni, migliorando la comprensione dello sviluppo dei motoneuroni.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Neurosviluppo
- Tecniche di imaging
Contesto
- Il protocollo si concentra sui motoneuroni, vitali per coordinare movimenti complessi.
- L'arborizzazione degli assoni dei motoneuroni è fondamentale per i circuiti neurali funzionali.
- Comprendere questi modelli può rivelare intuizioni sui processi di neurosviluppo.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare e analizzare quantitativamente l'arborizzazione degli assoni dei motoneuroni.
- Stabilire un metodo che possa essere adattato per altri processi di navigazione dei neuroni.
- Migliorare la nostra comprensione dello sviluppo dei motoneuroni negli embrioni di topo.
Metodi utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è la microscopia a foglio di luce fluorescente.
- Gli embrioni di topo che esprimono GFP sotto il promotore Hb9 servono come modello biologico.
- Gli embrioni vengono preparati attraverso tecniche di immunocolorazione e clearing prima dell'imaging.
- I passaggi critici coinvolgono la fissazione, la permeabilizzazione e l'incubazione con anticorpi dei campioni.
Risultati principali
- I risultati confermano la capacità di visualizzare dettagli fini dell'arborizzazione degli assoni in 3D.
- L'analisi quantitativa facilita la valutazione dei modelli di arborizzazione dei singoli nervi motori.
- Questo metodo consente di regolare l'ingrandimento per rivelare strutture intricate.
Conclude
- Lo studio dimostra un protocollo robusto per analizzare lo sviluppo dei motoneuroni.
- Il metodo migliora le intuizioni sul comportamento dei neuroni e la potenziale applicazione in altri studi.
- I risultati contribuiscono a una più ampia comprensione dei meccanismi neurali alla base del movimento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
