Name: Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Impara a visualizzare e quantificare l'arborizzazione assonale dei neuroni motori negli embrioni di topo Hb9::GFP tramite microscopia a foglio di luce. Questo metodo consente l'analisi tridimensionale dettagliata dello sviluppo neuronale.

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LSFM esperimenti e analisi dei dati sono stati effettuati in parte utilizzando i microscopi ottici avanzati dei divisione di servizio di strumento in Academia Sinica e con l'assistenza di MS. Shu-Chen Shen. Ringraziamo la sig. ra Sue-Ping Lee da impianto di IMB Imaging Core per una notevole assistenza tecnica con analisi dell'immagine Imaris. Nucleo di Editing inglese scientifico di IMB rivisto il manoscritto. Questo lavoro è finanziato dalla Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), più (104-2311-B-001-030-MY3) e vi (vi-EX106-10315NC).

Tutti gli animali vivi sono stati mantenuti in un agente patogeno specifico gratuito (SPF) animale impianto, approvato e supervisionato da IACUC di Academia Sinica.
1. fissazione
<ol><li>Raccogliere gli embrioni di giorno embrionale 12.5 (12.5) poi decapitare ed eviscerate li.</li>
	<li>Difficoltà gli embrioni individualmente in piastre da 24 pozzetti con 1 mL/bene di preparati paraformaldeide al 4% in soluzione salina tampone fosfato (PBS): 1x durante la notte. Incubare a 4 ° C in un agitatore.</li>
	<li>Lavare gli embrioni fissi almeno 3 x, ciascuno per 5-10 min, con 1 mL di PBS 1X e incubare per una notte a 4 ° C in un agitatore per rimuovere il residuo paraformaldeide.</li>
</ol>2. intero-monta Immunostaining
<ol><li>Permeabilize ogni embrione in 1 mL di 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) durante la notte a 4 ° C in un agitatore.</li>
	<li>Bloccare ogni campione con 1 mL di 10% FBS preparato in PBS 1X durante la notte a 4 ° C in un agitatore.</li>
	<li>Incubare l'embrione con 1 mL di anticorpo primario anti-GFP (1:1, 000 diluizione nel 10% FBS) a 4 ° C per 72 ore con agitazione costante per intensificare il segnale GFP dei nervi motori.</li>
	<li>Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare con 1 mL di 0.5% PBST nell'arco di 1-2 giorni a 4 ° C in un agitatore, cambiando il 0,5% PBST almeno tre volte.</li>
	<li>Applicare 1 mL di anticorpo secondario (1:1, 000 diluizione nel 10% FBS) e incubare per una notte al buio a 4 ° C con agitazione costante.</li>
	<li>Lavare 3 volte con 1 mL di 0.5% PBST a 4 ° C in un agitatore nel corso di 2-3 giorni. Conservare i campioni in 1X PBS a 4 ° C fino al giorno prima di formazione immagine. Nota: Gli embrioni possono essere sezionati in segmenti più piccoli prima di schiarimento, a seconda di quale parte degli embrioni sarà essere imaged. Gli arti anteriori sono conservati in questo approccio sperimentale (Figura 1A).</li>
	<li>Incubare l'embrione in un reagente commerciale schiarimento con un indice di rifrazione di 1.49 nD in una provetta da 1,5 mL, al riparo dalla luce a temperatura ambiente durante la notte, per eseguire il rendering l'embrione trasparente per l'imaging. Nota: Il volume del reagente schiarimento è circa cinque volte che il volume del campione.</li>
</ol>3. LSFM (2 – 3 h)
<ol><li>
Set-up del campione
	<ol>
<li>Impostare 5 X / 0.1 ottica di illuminazione e 5 X / 0.16 ottica di rilevazione. Assemblare il supporto del campione e campione capillare (1,5 mm diametro interno, verde) e inserirli nel microscopio. Nota: Fare riferimento al manuale d'uso del microscopio per le procedure dettagliate di set-up.</li>
		<li>Montare l'embrione come segue:<ol>
<li>Preparare la punta della pipetta P200 tagliando via la parte superiore in modo che si adatta al diametro del capillare e rimuovere la parte appuntita (~ 3 mm) per il fissaggio del campione.</li>
			<li>Sciogliere la fine smussata della punta della pipetta utilizzando una piccola fiamma.</li>
			<li>Spegnere la fiamma e allegare rapidamente l'embrione verticalmente sull'estremità fuso.</li>
			<li>Montare la parte superiore della punta della pipetta con il campione capillare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Permettere al tampone di camera di equilibrare con l'embrione per 1 min sgombrare i detriti o bolle.</li>
		<li>Utilizzando il software di imaging, selezionare individuare capillare sotto la scheda di individuare e regolare la x, y, asse z per posizionare il capillare del campione.</li>
		<li>Selezionare Locate campione e zoom a 0,6 X mettere a fuoco sull'embrione. Ruotare l'embrione per assicurare che l'asse lungo dell'arto imaged sia allineato con il percorso della luce delle due sorgenti luminose (Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisizione di immagini
	<ol>
<li>Sotto la scheda di acquisizione , è necessario definire i parametri di percorso della luce come obiettivi di rilevamento, laser blocco filtro, divisore di fascio, telecamere e laser. Nota: Il canale GFP è utilizzato in questo esperimento (lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm; filtro di emissione: BP 505 a 545 nm, divisore di fascio: SPS LP 560).</li>
		<li>Seleziona la casella scansione pivot per riduzione di ombra.</li>
		<li>Definire le impostazioni di acquisizione: bit di profondità, a 16 bit; zoom, 0.36-0,7 X; illuminazione del singolo-lato (sinistra/destra) o dual side illuminazione.</li>
		<li>Fare clic su continua e impostare l'intensità del laser, tempo di esposizione, potenza laser e la posizione di foglio leggero per acquisire immagini più nitide. Nota: La potenza del laser è mantenuta più bassa possibile per ridurre al minimo photodamage.</li>
		<li>Premere STOP per acquisizione di immagini di fine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisizione multidimensionali
	<ol>
<li>Definire lo z-stack spostando la posizione Z per la prima e l'ultima immagine. Fare clic su Optimal per impostare il numero di slice.</li>
		<li>Fare clic su Avvia esperimento per acquisire z-pila selezionata.</li>
		<li>Quando è fatto, è possibile salvare l'immagine nel formato .czi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elaborazione di immagini (opzionale)
	<ol>
<li>Procedere con fusion Dual side sotto il canale di Lightsheet elaborazione se dual side illuminazione viene applicato. MultiView di elaborazione è necessario se Multi-viste vengono acquisiti per combinare immagini da diverse angolazioni.</li>
		<li>Creare un'immagine 2D utilizzando i dati dei pixel più alti intensità lungo l'asse di proiezione sotto il canale di Massima intensità di proiezione .</li>
		<li>In canale di copia , fare clic sul sottoinsieme per selezionare sottoinsiemi di immagini dal set originale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. quantificazione dell'assone Arborization (30 Min per ogni singolo nervo)
<ol><li>Aprire il file di immagine nel software di analisi di imaging (per impostazione predefinita, l'immagine contenente i dati XYZ è aperto in modalità Surpass e come una vista 3D-rendering).</li>
	<li>Regolare il colore dell'immagine, luminosità e il contrasto utilizzando la finestra di Regolazione del Display (Edit | Regolazione del Display Visualizza) per rilevare filamenti basati sul contrasto di intensità locale.</li>
	<li>Fare clic sull'icona Aggiungi nuovi filamenti e seleziona l'algoritmo Autopath (nessun ciclo) nel menu a discesa.</li>
	<li>Selezionare la regione di interesse (in questo caso, la segmentazione dell'assone di interesse). Fare clic su prossimo quando finito.</li>
	<li>Definiscono i punti di partenza e sementi assegnando le misurazioni di diametro più grande e più sottile, che possono essere misurate utilizzando la modalità Slice .</li>
	<li>Assegnare un punto di partenza al bordo della regione di interesse. Per ottenere il manuale aggiunta o la rimozione dei punti di partenza, prima modificare la modalità puntatore (Navigate | Selezionare) e quindi MAIUSC + pulsante destro del mouse presso i punti di interesse.</li>
	<li>Selezionare manuale soglie per punti di seme garantire che tutto il visibile arborization è contrassegnato. Modificare la modalità puntatore (Navigate | Selezionare) e quindi MAIUSC + click-sinistro presso i punti di interesse manualmente aggiungere o rimuovere punti seme. Nota: È importante rimuovere manualmente i rumori di fondo e segnali dai nervi vicini.</li>
	<li>La casella rimuovere punti seme intorno a punti di partenza.</li>
	<li>Verifica Rimuovi disconnesso segmenti per consentire l'esclusione di punti che sono troppo lontano e che può rappresentare il rumore di fondo. Indicare la Lunghezza massima di Gap nel passaggio successivo per definire il limite superiore per l'esclusione.</li>
	<li>Regolare la soglia per la sottrazione del fondo, che utilizza un filtro gaussiano per stimare l'intensità di sfondo di ogni voxel.</li>
	<li>Impostare la soglia automatica per diametro dendrite utilizzando l'algoritmo di zona cross-section approssimativo .</li>
	<li>Ignorare i passaggi per il calcolo della colonna vertebrale.</li>
	<li>Terminare il processo e scegliere lo stile desiderato e il colore.</li>
	<li>Deselezionare la casella di volume nelle Proprietà per visualizzare solo gli assoni ricostruiti.</li>
	<li>Selezionare la scheda statistiche , Detailed. Utilizzare filamento No. Dendrite terminale punti per quantificare i terminali del nervo motore come indicatore di arborization assone motore. Nota: Annotazione statistica può essere aggiunta se lo si desidera.</li>
	<li>Esportare l'immagine dell'assone ricostruito come un file con estensione TIF.</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
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<li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A%3AEphA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li>
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<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li>
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<li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li>
<li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685(2017).</li>
<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Diversi passaggi nel protocollo possono essere sottoposti a modifiche in determinate circostanze. Ad esempio, la durata della fissazione dipende dall'età degli embrioni, variabile da 2 h a 1 o più giorni utilizzando preparati paraformaldeide. Poiché la fissazione avviene prima dell'intero Monte immunostaining, per gli anticorpi che sono sensibili alla reticolazione della proteina, metanolo può essere usato come agente fissativo alternativo. Per un elevato rapporto segnale-rumore al momento di colorazione, è necessario ot...

MNs spinale sono la parte del sistema nervoso centrale ma innervano i muscoli periferici per controllare il movimento. Nel midollo spinale in via di sviluppo, progenitori MN (pMNs) sono stabiliti secondo i segnali provenienti dalla notocorda e metameri adiacenti. Tutto differenziato post-mitotici MNs sono poi generati da pMNs, alla fine dando vita a una serie di sottotipi di MN lungo l'asse rostrocaudal del midollo spinale1,2. MNs spinale sono topograficamente e anatomicamente ben organizzato. Loro disposizione morfologica correla con la posizione della loro rispettiva destinazione in periferia3. Dopo aver raggiunto i loro obiettivi di muscolo, assoni riceveranno fattori neurotrofici esogeni e cellulari che inducono ad estendere e ramo ulteriore nei muscoli. Innervazione e ramificazioni difetti possono contribuire al fallimento per formare giunzioni neuromuscolari (NMJ). Ad esempio, fattori di neurotrophic glial-derivato (GDNF)-Pea3 indotto è indispensabile per arborization assone in cutaneo maximus (CM) e dorsi di latissimus (LD) muscoli4,5. Inoltre, embrioni di topo knockout DINE Visualizza arborization difettoso di nervi frenici nel diaframma, causando mortalità ed il guasto respiratorio subito dopo nascita6,7. Pertanto, quest'ultimo passaggio di maturazione MN (cioè, proiezione assonale e ramificazione) è fondamentale per garantire la comunicazione tra neuroni e cellule bersaglio.
Per visualizzare i modelli di arborization, ricercatori conducono normalmente imaging confocale o microscopia di fluorescenza del due-fotone di campioni sezionati o intero-monta8,9,10. Entrambe le tecniche di microscopia generare accettabile risoluzione e profondità di penetrazione. Microscopia di fluorescenza del due-fotone comporta eccitazione di fluorofori dall'assorbimento simultaneo di due fotoni di bassa energia11. Poiché due-fotone eccitazione utilizza radiazioni del vicino infrarosso, la frequenza di eccitazione in diminuzione contribuisce alla dispersione ridotta e migliore penetrazione del tessuto fino a 1 mm di tessuto, permettendo così la formazione immagine con una profondità maggiore. Microscopia confocale rimuove dai filtri l'out-of-focus segnali e raccoglie solo luce all'interno del piano focale12. Con questo approccio, immagini di campioni da diversi piani focali possono essere combinati per produrre un'immagine tridimensionale (3D) tramite una funzione di Z-stack. Tuttavia, l'intensità del segnale è ridotta come la maggior parte della luce viene bloccato e alte aperture numeriche oscurano la profondità di campo. Ancora più importante, entrambe le tecniche contribuiscono alla photodamage severo e fototossicità, dal momento che l'esemplare intero riceve illuminazione anche quando un solo aereo è immaginato in un dato momento.
Per ovviare a tali carenze, LSFM è diventata un'alternativa favorita, con il vantaggio di essere veloce, luce-efficiente e meno fototossico13,14. Inoltre, LSFM permette imaging multi-view. Questo approccio è particolarmente adatto alla visualizzazione di motore assoni e loro dispersione terminali come si diffondono attraverso lo spazio 3D. LSFM supera le altre due opzioni, perché i campioni sono montati su un palco che permette la rotazione intorno a un asse verticale e movimenti lungo x, y e z assi. Questo set-up non solo permette una vista minimamente bloccata del campione, ma anche la scelta di un percorso di illuminazione desiderabile, una lacuna del due-fotone e confocale microscopia, entrambi i quali richiedono il montaggio di campioni su una slitta piana. Di conseguenza, LSFM è lo strumento più idoneo per l'imaging 3D di arborization assone e per la quantificazione dei terminali del nervo motore in embrioni di topo.

<table><tbody><tr><td>Hb9::GFP</td><td>Il laboratorio di Jackson</td><td>005029</td><td>Raccogliere embrioni del giorno embrionale 12,5 (E12,5)</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide (PFA)</td><td></td><td></td><td>Per 200ml: Aggiungere 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Regolare il pH a 7,4 con NaOH (10N). Filtrare, sterilizzare e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Per 1L: aggiungere 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4 e rabboccare con ddH2O. Autoclave e stoccaggio presso RT.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pecora policlonale anti-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-pecora</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 reagente schiarente</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml micro tubo</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA Pinzetta</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forbici striaght affilato/affilato</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi per microchirurgia, monouso</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 microscopio</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.0 software di analisi delle immagini</td><td>Bitplane, Zurigo, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP topi)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di navigazione motore axon e quantificazione di axon arborization negli embrioni del mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Motoneuroni spinali (MNs) estendere loro assoni di comunicare con i loro obiettivi innervating, controllando quindi il movimento e compiti complessi nei vertebrati. Quindi, è fondamentale per scoprire i meccanismi molecolari di quanto destinato a motore assoni spostarsi, Alzaia e innervano i muscoli periferici durante lo sviluppo e la degenerazione. Anche se linee transgeniche di mouse Hb9::GFP hanno servito a lungo per visualizzare traiettorie assone motore durante lo sviluppo embrionale, descrizioni dettagliate dello spettro completo di arborization terminale dell'assone rimangono incomplete a causa della complessità del modello e limitazioni di microscopia ottica attuale. Qui, descriviamo un protocollo migliorato che combina microscopia di fluorescenza foglio leggero (LSFM) e analisi di immagine robusta qualitativamente e quantitativamente visualizzare lo sviluppo di motore assoni. Questo sistema può essere facilmente adottato per attraversare mutanti genetici o modelli di malattia MN con linee Hb9::GFP , rivelando nuovi meccanismi molecolari che portano a difetti nella navigazione dell'assone motore e arborization.

LSFM fornisce la visualizzazione dettagliata 3D di arborization assone e traiettoria di MN nel topo embrioni. In campo chiaro, tessuti appaiono completamente trasparenti dopo essere stato immerso nel reagente commerciale schiarimento. Nessun ritiro e/o gonfiore del campione è stata notata dopo fino a una settimana di deposito in compensazione reagente prima di formazione immagine. In canale di fluorescenza, motoneuroni sono etichettati con GFP transgenically espressa (1 film</stro...

Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di consentire una valutazione qualitativa e quantitativa dei pattern di arborizzazione degli assoni dei motoneuroni utilizzando il microscopio a foglio luminoso e il software di analisi delle immagini su embrioni di topo. Questo metodo può aiutare a comprendere lo sviluppo dei motoneuroni in coordinazione con il movimento complesso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile osservare e visualizzare i modelli di arborizzazione degli assoni dei motoneuroni da varie angolazioni e analizzare quantitativamente ogni singolo nervo.A dimostrare la procedura saranno Ya-Ping Yen e Ee Shan Liau, due studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, fissare gli embrioni singolarmente in una piastra a 24 pozzetti con un millilitro di paraformaldeide al 4% appena preparata in PBS per pozzetto a quattro gradi Celsius su uno shaker durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni fissati almeno tre volte, ciascuna per 5-10 minuti, con un millilitro di PBS 1X e incubarli per una notte a quattro gradi Celsius.Successivamente, permeabilizzare ogni embrione in un millilitro di 0,5% PBST durante la notte

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Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Questo video dimostra un metodo per tracciare il trasporto assonale nei motoneuroni utilizzando un sistema di camere microfluidiche. Consiste nel coltivare tessuti embrionali del midollo spinale di topo in pozzetti rivestiti di polimero con mezzo nutritivo per indurre la crescita assonale. Il movimento degli organelli colorati con colorante fluorescente nell'imaging dal vivo, conferma il trasporto assonale bidirezionale.

Monitoraggio del trasporto assonale degli organelli nei motoneuroni utilizzando un dispositivo microfluidico

Fonte: &lt;a style='decorazione testo:nessuno;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Visualizzazione della navigazione degli assoni motori e quantificazione dell'arborizzazione degli assoni negli embrioni di topo utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio leggero. J. Vis. Exp. (2018). Questo video dimostra l'uso della microscopia...

Visualizzazione delle proiezioni dei motoneuroni e della ramificazione degli assoni mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Fonte: Boyer, N. P. et. al., Imaging e analisi del trasporto di neurofilamenti nel nervo tibiale di topo asportato. J. Vis. Exp. (2020) Questo video mostra il metodo di fotoattivazione della fluorescenza da analizzare Trasporto di neurofilamenti negli assoni mielinizzati dei nervi periferici. Tracciando i neurofilamenti verdi fotoattivati marcati con fluorofori, la tecnica fornisce informazioni sul trasporto assonale nelle malattie neurodegenerative.

Imaging di fotoattivazione a fluorescenza del trasporto di neurofilamenti negli assoni di topo mielinizzati 

Fonte: Jeong, S. Visualizzazione del modello di proiezione assonale dei motoneuroni embrionali in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra la visualizzazione delle proiezioni assonali negli embrioni  Drosophila. L'immunomarcatura dei motoneuroni, la dissezione precisa per esporre le strutture neuronali e la microscopia a contrasto interferenale-differenziale rivelano collettivamente un'architettura neuronale dettagliata, enfatizzando i modelli di proiezione assonale.

Visualizzazione dei modelli di proiezione assonale dei motoneuroni embrionali in Drosophila

Presentiamo qui un protocollo ottimizzato per genotipizzare, colorare e preparare topi fetali per l'imaging di proiezioni di assoni nocicettori periferici nell'intero animale, come metodo efficace per valutare i fenotipi di crescita degli assoni sensoriali nello sviluppo di topi geneticamente modificati.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

Le tecniche di microscopia ottica abbinate a saggi biochimici chiariscono il coinvolgimento dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni netrina-dipendente. Questa combinazione di tecniche consente l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano la ramificazione degli assoni e il cambiamento della forma cellulare.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Impara a visualizzare e quantificare l'arborizzazione assonale dei neuroni motori negli embrioni di topo Hb9::GFP tramite microscopia a foglio di luce. Questo metodo consente l'analisi tridimensionale dettagliata dello sviluppo neuronale.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

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