Identificare i siti di fattore di trascrizione Olig2 associazione genomico in acutamente purificato PDGFRα + cellule di immunoprecipitazione della cromatina Low-cella ordinamento dell'analisi

L'obiettivo generale di questo esperimento è analizzare il legame a livello di genoma del fattore di trascrizione degli oligodendrociti due in cellule precursori di oligodendrociti cerebrali acutamente purificate eseguendo l'immunopanning, l'immunoprecipitazione della cromatina a bassa cellula, il sequenziamento ad alto rendimento e l'analisi dei dati bioinformatici. Questo metodo è un potente strumento per studiare la regolazione trascrizionale dell'intero genoma e i meccanismi epigenetici, che svolgono un ruolo importante nella differenziazione e nello sviluppo cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ampiamente applicabile in ChIP-seq di altri fattori di trascrizione con qualsiasi tipo di cellula in numero limitato, comprese le cellule primarie acutamente purificate senza proliferazione in vitro.

A dimostrare la procedura sarà Yanan You, un postdoc del mio laboratorio. È coautrice di questo articolo. Per selezionare le cellule PDGFR-alfa-positive, preparare una piastra per l'immunopanning.

Preparare altre due piastre per le cellule endoteliali e la deplezione della microglia. Quindi, rivestire una capsula di Petri da 10 centimetri con 30 microlitri di immunoglobulina anti-ratto di capra. Quindi, agitare la piastra per assicurarsi che l'intera superficie della piastra sia uniformemente coperta con la soluzione di rivestimento.

Lasciare la capsula di Petri per una notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, diluire 40 microlitri di anticorpo anti-PDGFR-alfa di ratto con 12 millilitri di DPBS contenente lo 0,2% di albumina sierica bovina. Quindi, lavare la piastra rivestita di immunoglobulina G con 10 millilitri di 1X DPBS per tre volte consecutive.

Quindi, incubare la piastra rivestita di immunoglobulina G con una soluzione di anticorpi PDGFR-alfa a temperatura ambiente per quattro ore. Dopo quattro ore, aggiungere con cura DPBS lungo la parete laterale della piastra per lavare tre volte la piastra rivestita di anticorpi anti-PDGFR-alfa di ratto. Non disturbare la superficie rivestita della piastra.

Successivamente, utilizzare 20 millilitri di DPBS con 2,3 microgrammi per millilitro di BSL-1 per rivestire due piastre di Petri da 15 centimetri per due ore. Dopo l'incubazione, aggiungere con cura 20 millilitri di DPBS lungo la parete laterale della piastra per lavare la piastra BSL-1 tre volte. Non disturbare la superficie rivestita.

Dopo il lavaggio, centrifugare la sospensione monocellulare a 300 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aggiungere 15 millilitri di tampone immunopanning al pellet cellulare. Quindi, incubare le sospensioni di una singola cellula da due cervelli di topo in sequenza su due piastre di Petri rivestite con BSL-1.

Quindi, lasciare le piastre per 15 minuti a temperatura ambiente. Agitare la piastra ogni cinque minuti durante l'incubazione. Quindi, agitare delicatamente la piastra per raccogliere tutte le cellule non aderenti dalla sospensione cellulare.

Quindi, seminare le cellule sulla piastra rivestita di anticorpi PDGFR-alfa di ratto. Incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente. Al termine dei 45 minuti, agitare nuovamente il piatto.

Quindi, scartare la sospensione della cella. Successivamente, sciacquare la piastra con DPBS per otto volte per rimuovere le cellule non aderenti. Esamina la lastra al microscopio.

Quindi, aggiungere la soluzione di distacco cellulare sulla piastra rivestita di anticorpi PDGFR-alfa di ratto. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Nel frattempo, agitare la piastra per rimuovere le cellule aderenti ed esaminarla al microscopio.

Quindi, centrifugare le celle a 300 volte g a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare con un millilitro di terreno di coltura cellulare OPC. Quindi, contare le cellule utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano in un emocitometro.

Dopo aver contato in un emocitometro, aggiungere 20.000 OPC purificati in un millilitro di terreno di coltura cellulare OPC per la reazione ChIP. Quindi, aggiungere 27 microlitri di formaldeide al 36,5% a temperatura ambiente per 10 minuti. Questo sistemerà le celle.

Dopo 10 minuti, aggiungere 50 microlitri di glicina molare da 2,5 sulle celle fisse per cinque minuti a temperatura ambiente. L'aggiunta della glicina fermerà la reticolazione DNA-proteina. Quindi, lavare le cellule reticolate con un millilitro di tampone HBSS con cocktail di inibitori della proteasi.

Quindi, centrifugare le celle in una centrifuga pre-raffreddata a 300 volte g a quattro gradi Celsius. Dopo aver reticolato gli OPC purificati, le cellule reticolate devono essere lavate con una soluzione HBSS ghiacciata e le restanti fasi di ChIP devono essere eseguite a quattro gradi, altrimenti l'anticorpo non può precipitare correttamente il DNA genomico. Quindi, aggiungere 25 microlitri di tampone di lisi completo al pellet cellulare e lasciare in ghiaccio per cinque minuti.

Successivamente, pipettare 75 microlitri di tampone HBSS ghiacciato con cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, tagliare la cromatina del lisato cellulare in un sistema di sonicazione pre-raffreddato con cinque cicli di 30 secondi on e 30 secondi off program. Una volta che la cromatina è stata tranciata, centrifugare il lisato cellulare a 14.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Al termine della centrifugazione, raccogliere il surnatante. Quindi, diluire 100 microlitri della cromatina tranciata con un volume uguale del tampone ChIP ghiacciato con inibitore della proteasi. Quindi, aggiungere un microlitro di anticorpo anti-Olig2 di coniglio a 180 microlitri di cromatina tranciata diluita.

Incubare i tubi su una ruota rotante per 16 ore a quattro gradi Celsius a 40 giri al minuto. Quindi, aggiungere 10 microlitri di perle rivestite di proteina A prelavate al tubo di reazione ChIP in una cella frigorifera. Ancora una volta, incubare le provette ChIP a quattro gradi Celsius per altre due ore sulla ruota rotante.

Dopo due ore, lasciare la provetta di reazione ChIP sulla rastrelliera magnetica per un minuto. Quindi, lavare il pellet di perline con 100 microlitri di quattro tamponi di lavaggio ciascuno per quattro minuti su una ruota rotante a quattro gradi Celsius. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione al pellet di perline.

Incubare la provetta di reazione a 65 gradi Celsius per quattro ore. Una volta che il DNA a doppio filamento è denaturato, defosforilare l'estremità a tre primi del DNA a filamento singolo aggiungendo fosfatasi alcalina di gamberetti. Quindi, aggiungere la coda poly-T al DNA a filamento singolo utilizzando la deossinucleotidiltransferasi terminale.

Quindi, ricuocere il primer di DNA poli-dA sul modello di DNA a filamento singolo. Quindi, amplifica la libreria di sequenze ChIP utilizzando primer diretti e inversi per l'indicizzazione. Il numero di cicli di PCR per la preparazione della libreria dipende dalla quantità di DNA iniziale.

Una buona preparazione della libreria richiede una quantificazione accurata della quantità di DNA in ingresso. Troppi o troppo pochi cicli di PCR possono influenzare la concentrazione della libreria, così come la complessità, portando ad artefatti PCR. Utilizzare le perle paramagnetiche per selezionare i frammenti che vanno da 250 a 500 coppie di basi dalla libreria di sequenze ChIP amplificate con PCR.

Utilizzare un dispositivo di elettroforesi capillare a chip microfluidico per esaminare la qualità della libreria di sequenze ChIP selezionata. Per valutare la purezza degli OPC immunopannati, vengono eseguiti studi di immunocolorazione. Utilizzando l'anticorpo NG2, marcatore di lignaggio OPC, si dimostra che la maggior parte delle cellule immunopannate con anticorpi PDGFR-alfa sono NG2 positive.

Successivamente, viene eseguita la PCR quantitativa per verificare l'arricchimento di PDGFR-alfa. Il grafico ottenuto mostra una scarsa espressione di Tuj1, un marcatore neuronale che indica un significativo arricchimento di PDGFR-alfa rispetto alle cellule cerebrali dissociate. Risultati simili sono stati ottenuti mostrando una scarsa espressione per tutti gli altri marcatori, come GFAP, Mog e Mbp, indicando un arricchimento di PDGFR-alfa.

Quindi, viene analizzata la qualità della libreria di sequenze ChIP. L'elettroferogramma rappresenta un chiaro picco per il fattore di trascrizione Olig2 che varia da 250 a 500 coppie di basi dopo la selezione della dimensione del prodotto PCR della libreria. Qui, l'istogramma mostra la clonalità del tag, per verificare le metriche di controllo qualità ottenute prima del peak calling.

La barra indica che oltre il 90% delle letture è mappato a una sola posizione genomica. Quindi, si ottiene un grafico di correlazione dei filamenti, che raffigura un picco arricchito corrispondente alla lunghezza del frammento predominante. Nel grafico, le linee rosse rappresentano rispettivamente la lunghezza di lettura a 50 coppie di basi e la lunghezza del frammento a 130 coppie di basi, indicando così dati di alta qualità.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare il sito di legame del DNA a livello di genoma dei fattori di trascrizione e di altre proteine nelle cellule primarie o nelle cellule rare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare le OPC primarie dal cervello di topo mediante immunopanning e come eseguire l'esperimento ChIP-seq utilizzando un basso numero di cellule.