Name: Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri come registrare e modulare l'attività epilettiforme indotta da 4-aminopiridina in fettine di cervello di roditore usando microelettrodi a matrice. Questo metodo elettrofisiologico ottimizza i protocolli di stimolazione per la ricerca sull'epilessia.

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G.P. è Marie Skłodowska-Curie Fellow finanziato dal progetto Unione europea MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, nell'ambito del programma quadro H2020. La mapMEA GUI è liberamente disponibile su richiesta all'autore ilaria.colombi@iit.it.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

MEAs sono uno strumento prezioso per le indagini di neurofisiologia e hanno raggiunto la maturità negli ultimi anni grazie a decenni di esplorazione e sviluppo. Rispetto alla registrazione di potenziali di campo convenzionale, MEAs offrono il grande vantaggio di un maggior numero di punti di osservazione e la distanza inter-elettrodo nota, che sono cruciali per individuare con precisione interazioni di rete neuronale.
La tecnica di registrazione MEA può essere accoppiata anche ad altri approcci di elettrofisiologia, quali registrazione toppa-morsetto15, per indagare il rapporto tra singolo neurone e attività di rete di un neurone. Inoltre, la possibilità di visualizzare contemporaneamente potenziali di campo e attività multi-unità può fornire preziose intuizioni la correlazione tra l'attività di un neurone piccoli ensemble e collettive reti neuronali. La combinazione con coloranti di tensione-sensibili, calcio imaging e optogenetica29 permette la deduzione di fenomeni di neurofisiologia utilizzando approcci poliedrici. Oltre a studi farmacologici, la possibilità di eseguire la registrazione e la stimolazione con lo stesso sistema rende la tecnica di registrazione MEA molto potente e versatile: ad esempio, è possibile studiare i fenomeni di plasticità sinaptica presso il nucleo di memoria formazione30, utilizzando i protocolli di neuromodulazione qui presentati, che sono rilevanti per DBS per trattare l'epilessia e un'ampia varietà di disordini del cervello. La prova recente che la tecnica di registrazione di MEA possa essere applicata correttamente al cervello epilettico umano tessuto16 dimostra suo inestimabile utilità nella ricerca di epilessia, sia per capire i meccanismi di base alla base di questa malattia devastante e per ottimizzare gli algoritmi DBS per migliorare esso.
Tuttavia, MEAs forzare la ricerca di esperimenti di elettrofisiologia in condizioni di «limite» per fette del cervello, dovuto il requisito di una camera di registrazione sommerso e la necessità di lasciare il cervello fetta resto su substrato solido dove i micro-elettrodi sono integrati. Così, tessuto cerebrale non riceva adeguata di ossigeno, che a sua volta può influenzare la qualità delle registrazioni.
Il protocollo descritto qui permette di registrare in modo affidabile e studiare ictogenesi in roditore reti limbiche accoppiate a MEAs utilizzando il modello di acuta 4AP in vitro e di perseguire prolungate epoche di stimolazione elettrica, che forniscono informazioni rilevanti per la valutazione delle politiche DBS.
Gli studi precedenti sulla neuromodulazione elettrica delle reti limbiche epilettici basato sull'uso di registrazione potenziale campo convenzionale hanno usato fettine di cervello di topo o ratto con simili risultati24,25; ma l'uso del tessuto di cervello di ratto si è rivelato più impegnativo, ragionevolmente a causa della connettività più debole rispetto al tessuto cerebrale ottenuti da topi7. Per quanto riguarda la tecnica MEA, fettine di cervello di topo sono più adatti in virtù della loro dimensione più piccola. Inoltre, dato il più alto tasso di occorrenza degli scarichi ictal-come nel topo contro il tessuto del cervello del ratto, è possibile testare significativamente più fette del cervello in tutto un giorno sperimentale, che a sua volta rende la raccolta di dati più veloce ed efficiente, e può ridurre il numero di animali utilizzati.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:
Gli scarichi ictal registrati usando la camera personalizzata descritta qui sembrano essere simili in durata e tasso di incidenza a quelli osservati con la camera di cottura convenzionale di MEA e dello stesso tipo MEA (micro-elettrodi planari, cf. 17). Tuttavia, deve essere dato risalto a che spessore della fetta di cervello deve essere ridotta significativamente quando la registrazione circolare convenzionale nella camera insieme con una tariffa bassa perfusione (1 mL/min), che può ostacolare il riuscito inseguimento di neuromodulazione esperimenti causa di scarsa connettività.
In questo protocollo, una camera di registrazione personalizzato basso volume ispirata patch clamp registrazione camera design fornisce stabile e affidabile flusso laminare che è cruciale per il riuscito inseguimento di registrazioni MEA; permette inoltre di aumentare lo spessore della fetta di cervello fino a 400 µm al fine di raggiungere un giusto compromesso tra vitalità del tessuto e connettività intrinseca. È infatti riconosciuto quel flusso laminare della soluzione di registrazione all'interno della camera è altamente desiderabile per elettrofisiologia del cervello fetta, poiché non è influenzato dalla temperatura, ossigeno, e gradienti di pH che si osservano nella circolare-flusso rotondo registrazione Colombo19,20,31 (come quelli forniti con MEA disponibile in commercio). Tali pendenze introducono sperimentale polarizzazione e sono anche dannose per la fetta di cervello. Alloggiamenti di registrazione di un volume relativamente piccolo (~1.5 mL) insieme a una perfusione ad alta velocità (5-6 mL/min)16,31 consentano adeguato scambio del mezzo aspersione (≥ 3 volte / min). La camera di personalizzato può essere facilmente ottenute da fonti commerciali ad un prezzo accessibile o prodotte internamente utilizzando tecnologia di stampa 3D. Altri studi hanno riferito le registrazioni MEA da 400 fette di cervello umano µm di spessore16 utilizzando la camera di cottura convenzionale MEA, mantenendo il volume ACSF a 1 mL e l'applicazione di un tasso elevato di aspersione (5-6 mL/min) con l'aiuto di una pompa peristaltica di basso rumore. Tuttavia, gli autori hanno utilizzato un diverso modello di ictogenesi, cioè, il basso Mg2 +, che è probabilmente che meno influenzata rispetto al modello 4AP ephaptic meccanismi che comportano un aumento significativo nella concentrazione extracellulare di K+ 11 , 22. abbiamo trovato che un tasso elevato di aspersione non è desiderabile nel modello 4AP, possibilmente dovuto il lavaggio veloce fuori di K extracellulare accumulato+, che potrebbe essere necessario essere aumentato significativamente nella registrazione ACSF16. Infatti, eventi ictal è sembrato più 'blocchi' quando ASCF aspersione velocità è stata aumentata a 2-3 mL/min e la fetta di cervello è stata sommersa da uno spesso strato ACSF, mentre scarichi conclamati espositrici robusti componenti tonico-clonic potrebbero essere ripristinati dopo il ritorno a un basso tasso di aspersione (1 mL/min) e una più sottile ACSF strato destra a livello superficiale del tessuto (dati non mostrati). La camera di registrazione personalizzato descritta in questo protocollo consente lo scambio il medium di perfusione 3 - 5 volte / min ad una portata di 1 mL/min. Così, il rifornimento di ossigeno complessiva per le fette di cervello è fortemente migliorato anche a tassi relativamente bassa perfusione, pur garantendo una stabile registrazione temperatura e alto rapporto segnale-rumore. La cosa più importante, è possibile mantenere la concentrazione extracellulare di K+ per un valore fisiologico.
Il modello 4AP di ictogenesi non richiede alcuna modifica significativa della composizione ionica ACSF, come abbassamento Mg2 + o crescente K+e offre un vantaggio unico di mantenere intatte le trasmissioni sia eccitatori che inibitori 12, un aspetto che è molto rilevante nella ricerca di epilessia alla luce del ruolo cruciale delle reti di neuroni GABAergici in sincronizzazione epileptiform (cfr. 7) e glutamatergic. Il 4AP-ACSF utilizzata nel presente protocollo contiene una concentrazione fisiologica di K+ (3,25 mM) e una Mg2 + concentrazione leggermente inferiore rispetto alla detenzione ACSF (1 mM contro 1,3 mM). Questa concentrazione ancora rientri nei valori fisiologici segnalati di concentrazione di Mg2 + nel roditore CSF e viene utilizzato in molti laboratori (Vedi ad esempio17,18). Lo scopo del protocollo descritto, abbiamo trovato che questa lieve diminuzione è preferita per aiutare nell'effetto di 4AP.
Nel precedente lavoro, 4AP è stato applicato per la fetta di cervello quando era già posizionato all'interno le registrazione camera17,18. A meno che lo sperimentatore deve osservare la latenza di tempo tra l'applicazione 4AP e l'insorgenza di epileptiform modelli, troviamo che questo approccio è piuttosto lungo e non è adatto a perseguire la registrazione prolungata e sedute di stimolazione descritto in questo protocollo. Pre-incubazione delle fette di cervello in 4AP a 32 ° C consente risparmiando tempo molto sperimentale, poiché fette del cervello possono essere pre-trattati della serie pur perseguendo l'esperimento utilizzando altre sezioni di tessuto.
La redditività prolungata delle fette del cervello può essere utile per analizzare le caratteristiche di rete nel lungo termine. Inoltre, la loro resilienza migliorata alla stimolazione elettrica ripetitiva è di grande vantaggio se lo sperimentatore vuole confrontare diversi protocolli di stimolazione, che devono essere eseguiti nella stessa fetta di cervello per robustezza statistica. Nelle nostre mani, quando 3 protocolli di stimolazione di prova, ciascuno preceduto da una fase di controllo e seguita da una fase di recupero, l'esperimento può durare 3-5 h. In questo contesto, mappe in tempo reale MEA è fondamentale al fine di attivare la via corretta e sopprimere, piuttosto che favorire ictogenesi tramite stimolazione elettrica. Il nostro user-friendly GUI rappresenta uno strumento rapido, semplice e flessibile per mappare gli elettrodi di strutture cerebrali differenti. Al contrario di software commerciale, è possibile aggiungere layout personalizzati MEA anche con competenze di programmazione di base. Immagini possono essere acquisite nel campo luminoso; così, qualsiasi fotocamera di uso generale che ha buona risoluzione e si inserisce su un microscopio è adatto. Un microscopio invertito è essenziale per visualizzare la posizione di microelettrodi rispetto la fetta di cervello, poiché questi sarebbero nascoste sotto il tessuto se si usa un microscopio in posizione verticale. Tuttavia, un impianto stereo-microscopio è consigliabile oltre al tipo invertito se lo sperimentatore deve eseguire tagli di coltello per interrompere specifici circuiti neuronali.
Infine, un ulteriore vantaggio dell'approccio proposto è l'Assemblea relativamente semplice ed economico della maggior parte degli strumenti necessari, come la camera di registrazione personalizzata e gli alloggiamenti di detenzione, il bagno caldo e l'ancoraggio di fetta, come pure l'uso inutile di un costoso pompa peristaltica a basso rumore.
Limiti della tecnica:
Registrazione di MEA non consente di visualizzare le onde molto lente, cioè, DC si sposta nel segnale. Tali deviazioni della linea di base possono aiutare a misura asintotica di scarico ictal durata e, più importante, sono fondamentali per lo studio di depressione di diffusione corticale (un fenomeno che riguarda la morte inattesa improvvisa nell'epilessia32 e viene condiviso tra l'epilessia ed emicrania33).
Per quanto riguarda neuromodulation elettrico, il protocollo qui descritto consente di effettuare diverse sessioni di stimolazione senza colpire l'attuabilità di fetta di cervello. Abbiamo potuto eseguire con successo fino a 3 sedute di stimolazione di 20-45 min, simile a quanto indicato nel precedente lavoro25. Anche se fette del cervello probabilmente possono sopportare un maggior numero di sessioni di stimolazione o protocolli di stimolazione più a lungo, abbiamo non prova fette del cervello a questo proposito. Si consiglia di limitare il numero di protocolli di stimolazione a 3 ed evitando prolungate sessioni di stimolazione (≥ 60 min), che possono significativamente lo stress del tessuto di cervello conservato in queste condizioni limite, fino alla mancanza di recupero al momento del ritiro di stimolo.
Fasi critiche all'interno del protocollo:
Diversi fattori critici possono ostacolare il riuscito inseguimento di registrazione e la modulazione dell'attività epileptiform in fettine di cervello accoppiato a MEA. Oltre la specie di roditori utilizzati e la qualità delle fette di cervello, il tasso di aspersione durante la registrazione e la dinamica del flusso ACSF (cioè., laminare contro circolare) all'interno della camera di registrazione, abbiamo trovato che le condizioni di recupero e manutenzione a lungo termine di fette del cervello così come la modalità di applicazione 4AP sono le fasi più critiche.
Quando si utilizza una camera sommersa è cruciale memorizzare le fette di cervello a temperatura ambiente per preservare le attività di rete di tessuto cerebrale e favoriscono l'induzione degli scarichi ictal-come da 4AP applicazione. Nelle nostre mani, recupero e manutenzione a 32 ° C si è deteriorato il tessuto cerebrale all'interno di 3-4 h di affettatura.
Incubazione del cervello fette in 4AP-ACSF a temperatura ambiente e registrazione a 32 ° C è, tuttavia, non auspicabile. Abbiamo trovato molte difficoltà nell'osservare gli scarichi ictal ricorrenti robusti in questa condizione. Infatti, basse temperature nell'intervallo 20-24 ° C sono state segnalate per smorzare o addirittura prevenire 4AP-indotto ictogenesi entrambi in vitro34 ed in vivodi35. Così, le temperature di incubazione e registrazione 4AP devono rientrare entro i 30-34 ° C e devono essere adeguate. Per evitare di mettere il tessuto cerebrale sotto troppo stress dovuto l'induzione simultanea di ipereccitabilità di 4AP e l'improvvisa esposizione delle fette del cervello dalla temperatura ambiente per il caldo (32 ° C) 4AP-ACSF, è fondamentale eseguire un pre-riscaldamento intermedio passo e lasciare che le fette di cervello habituate nell'azienda ACSF al 32 ° C per 20-30 min, saltare questo passaggio potrebbe influire sulla induzione di ictogenesi di 4AP.
Un altro aspetto che deve essere menzionato è l'importanza della concentrazione di D-glucosio nel ACSF dopo il taglio. Una concentrazione di 25 mM conserva le fette di cervello meglio di concentrazione 10 mM usata in molti laboratori e migliora anche il tasso di ricorrenza dell'attività convulsiva, che è 2 volte più veloce (, rendendo così più facile perseguire una lunga serie di sperimentale protocolli in parecchie fette di cervello ogni giorno).
Infine, alcuni importanti dettagli durante la procedura d'affettatura bisogno di essere menzionato. In primo luogo, non consentono il cervello intatto e le fette di cervello di congelare al freddo taglio ACSF. Agghiacciante il cervello per < 2 min è sufficiente date le piccole dimensioni del cervello del mouse. Sezioni di tessuto devono essere trasferite immediatamente da tampone per il risciacquo Becher a temperatura ambiente. Sciacquare il taglio ACSF è molto importante che altrimenti la concentrazione di saccarosio alta farà il cervello fette stick per la rete di nylon della camera della holding. Per sciacquare efficacemente il tessuto, è importante per ridurre al minimo il contenuto ACSF di taglio all'interno della pipetta di trasferimento in modo da non contaminare la detenzione ACSF eccessivamente. 2 stadi di risciacquo aiuta a minimizzare la contaminazione. Al completamento della procedura per affettare, sezioni di tessuto devono essere trasferite immediatamente dal risciacquo bicchieri alla camera di tenuta, dove il morbido nylon mesh sospesa a metà strada nell'azienda ACSF permette l'ossigenazione dei tessuti su entrambi i lati. Lo stesso principio deve essere applicato in tutte le fasi, seguendo la procedura per affettare: fettine di cervello non dovrebbero mai sedersi nella parte inferiore del bicchiere, non dovrebbero essere a contatto con i lati delle sezioni della holding e non dovrebbe mai essere in contatto tra loro, né si sovrappongono.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
ACSF composizione può essere modificata secondo le esigenze dello sperimentatore. Ad esempio, farmaci possono aggiungersi a sezionare il contributo di neurotrasmettitori specifici o scanalature dello ione per l'efficacia della neuromodulazione elettrica. Inoltre, piruvico e acido ascorbico (cfr. tabella 2) può essere omesso, anche se troviamo che esercitano un ruolo neuroprotective potenti. Segnaliamo in tabella 3 i problemi più comuni che si possono incontrare in questo protocollo e come trattare con loro.
CONCLUSIONI:
Registrazione di MEA è senza dubbio una tecnica insostituibile per affrontare le interazioni delle reti neuronali nella salute e nella malattia. Oltre a studi farmacologici, è anche possibile valutare il neuromodulation elettrico protocolli che sono rilevanti per DBS applicato a epilessia e altri disturbi neurologici. In questo protocollo, abbiamo indicato che è possibile riprodurre gli esperimenti di stimolazione periodica tipica con risultati simili a quelli ottenuti con la registrazione di potenziali di campo extracellulare convenzionale e gli elettrodi di stimolazione esterna. La crescente disponibilità di attrezzature di facile utilizzo e strumenti software avanzati rendono adatto anche per gli esperimenti di stimolazione del ciclo chiuso, per fornire lo stimolo ad hoc per il tessuto cerebrale e per la tecnica di registrazione di MEA studiare il contributo dei meccanismi di feedback alle risposte di rete di un neurone.

L'epilessia è un disordine progressivo pericolosa causando attività incontrollata del cervello1; trasporta tra il più alto carico di malattia e stigma sociale significativo2,3. TLE è la sindrome più frequente (40%) e il più frequentemente (~ 30%) resistente ai farmaci anti-epilettici4. Mentre l'ablazione chirurgica del tessuto epilettogeno può migliorare la condizione del paziente, non è fattibile in tutti i pazienti e non può garantire una vita completamente grippaggio-libero5. Modulazione delle reti epilettici limbiche di DBS elettrico è un approccio promettente quando trattamento farmacologico o neurochirurgia non sono adatti.
Fette del cervello del roditore sono uno strumento prezioso per studiare la funzione di reti come un neurone nella salute e nella malattia6 per mezzo di tecniche di elettrofisiologia in vitro , come conservare, almeno in parte, l'architettura originale e la connettività del cervello regioni di interesse (ROI). In particolare, orizzontale combinato ippocampo-entorhinal corteccia (ippocampo-CE) fette comprendono le essenziali reti neuronali coinvolte in TLE e pertanto sono abitualmente impiegati in vitro TLE ricerca7.
Attività di grippaggio-come può essere indotta acutamente nelle fette del cervello modificando la composizione ionica del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), come la diminuzione di magnesio mentre aumenta il potassio8,9,10, o per mezzo di manipolazioni farmacologiche, come il blocco di attività inibitoria GABAergica (Vedi11 per una rassegna completa). Tuttavia, questi modelli sono basati sull'alterazione sbilanciato di eccitazione ed inibizione; Pertanto, non consentono lo studio della interazione e concertata contributo delle reti eccitatorie ed inibitorie a ictogenesi. Migliora la perfusione continua di fette del cervello con il farmaco convulsivante 4AP neurotrasmissione sia eccitatori che inibitori, permettendo così di studiare ictogenesi acuta pur mantenendo intatta la attività sinaptica nel complesso12.
MEAs consentono di registrare l'attività elettrica generata da reti neuronali da un maggior numero di punti di osservazione rispetto al potenziale registrazione campo extracellulare convenzionale, dove restrizioni spaziali limitano il numero di elettrodi che possono essere accomodato sulla superficie della fetta del cervello. Inoltre, MEA chip offrono il vantaggio aggiunto di distanza inter-elettrodo nota, che è molto utile alla propagazione di traccia e valutare la velocità di viaggio di segnali registrati. Anche se inizialmente concepito per la registrazione da neuroni coltivati13,14, MEAs ora sono anche usate per caratterizzare le caratteristiche elettrofisiologiche di fettine di cervello acuto ottenuti da roditori15 e gli esseri umani16. Così, nel contesto della ricerca di epilessia, MEAs rappresentano uno strumento prezioso per individuare interazioni delle reti neuronali alla base del ictogenesi16,17,18.
Tuttavia, registrazione MEA trasporta inerentemente sfide tecniche nell'ottenere o mantenere un modello stabile epileptiform in tutta protocolli sperimentali lunga (diverse ore). In primo luogo, l'ossigenazione dei tessuti può non essere adeguato all'interno del grande e sommerso di registrazione camera19,20 tipici di MEAs commercialmente disponibili, mentre povero rapporto segnale-rumore e instabilità della temperatura potrebbe influenzare la qualità della registrazione quando un tasso elevato di aspersione (6-10 mL/min) è utilizzato per migliorare l'apporto di ossigeno per la fetta di cervello (Vedi ad esempio le note tecniche su riscaldamento e perfusione attrezzature21). In secondo luogo, il ricorrenti gli scarichi con componenti ad alta frequenza, quali scarichi epileptiform, difficilmente sono osservati quando si utilizza tipo sommerso registrazione Colombo19; Questo è specialmente il caso quando il pattern epileptiform acuta è chimicamente indotta e coinvolge meccanismi ephaptic, come è il caso per il modello 4AP22 (Vedi11 per una panoramica completa). Per superare queste limitazioni, sono state proposte diverse strategie dai ricercatori. Ad esempio, aumentando il tasso di aspersione19,20 , riducendo lo spessore fetta di cervello (≤ 300 µM) e zona17,18 è fattori cruciali per il raggiungimento di un'adeguata di ossigeno al tessuto. Inoltre, migliore cervello fetta attuabilità è possibile anche utilizzando perforato MEAs (pMEAs), che permettono che irrora il tessuto cerebrale da entrambi i lati di18.
Considerando che gli approcci descritti hanno notevolmente migliorato la fattibilità di registrazione MEA da fettine di cervello, essi non sono stati testati contro prolungato (diverse ore) sedute di stimolazione elettrica e registrazione, quest'ultima rappresentando un significativo stress per il tessuto cerebrale. Sessioni di registrazione prolungato potrebbero essere necessario studiare l'evoluzione nel tempo delle caratteristiche specifiche di modelli epileptiform che non sarebbe possibile smascherare tramite le misure a breve termine. Nel contesto della ricerca DBS, protocolli sperimentali prolungati potrebbero essere necessario valutare e confrontare gli effetti di diversi paradigmi di stimolazione nella stessa fetta di cervello.
Quando solo un'attività elettrica spontanea deve essere registrata, mappatura degli elettrodi per quanto riguarda il ROI è di solito fatto a posteriori, cioè, durante l'analisi dei dati; invece, lo studio delle risposte evocate o dei paradigmi di neuromodulazione elettrica richiede che stimolazione consegnato a specifici ROI(s), dettando la necessità del mapping di facile e veloce dal vivo elettrodo durante l'esperimento.
Qui, vi illustriamo un semplice protocollo sperimentale che permette per induzione e il mantenimento di un modello stabile epileptiform 4AP-indotta nelle fette del cervello del roditore adulto. L'attività osservata riproduce fedelmente le caratteristiche elettrofisiologiche di questo modello come caratterizzato utilizzando tecniche di elettrofisiologia extracellulari convenzionali. E persiste per diverse ore e dura più a lungo sostenuta la stimolazione elettrica per ripetute epoche prolungate. Gli alloggiamenti utilizzati per mantenere e incubare le fette di cervello possono essere montati facilmente utilizzando standard di laboratorio forniture (Figura 1A), considerando che una camera di registrazione personalizzato consentendo una soluzione ottimale tasso di cambio e a flusso laminare (Figura 1B) può essere ottenuti da fonti commerciali o utilizzando la tecnologia di stampa 3D ad un prezzo abbordabile. Mappatura rapida di ROI(s) per il monitoraggio in tempo reale e per la selezione degli elettrodi di stimolazione è reso possibile da un'interfaccia molto intuitiva personalizzata denominata mapMEA, liberamente disponibili su richiesta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg"> Figura 1: attrezzatura personalizzata utilizzata per questo protocollo. (A) la detenzione alloggiamenti per recupero, pre-riscaldamento e pre-incubazione in 4AP sono assemblati con un bicchiere e una capsula di Petri. Di Petri deve essere di diametro inferiore l'interruttore e viene tenuto in posizione per mezzo di un pistone della siringa. Fondo di Petri è sostituito da una rete di nylon (da morbide calze) incollata con cianoacrilato sul cerchio del piatto Petri. Ossigeno è fornito tramite un ago spinale piegato (22 G), inserito tra le pareti di Petri e il becher. Bolle dovrebbero essere emergenti dal lato del bicchiere e mai raggiungere la rete di nylon per evitare lo spostamento di fetta di cervello. Parte superiore di una capsula di Petri può essere usato come coperchio per evitare l'evaporazione ACSF e mantenere la saturazione di ossigeno. Camera di registrazione personalizzata di (B). in: serbatoio di aspirazione per ospitare la cannula di riscaldamento e l'elettrodo di riferimento. fuori: serbatoio di presa per ospitare l'ago di aspirazione. Camera di REC: registrazione. Pipetta Pasteur di vetro (C), arricciata di fuoco-lucidatura, utilizzato per gestire il tessuto e regolarne la posizione all'interno della camera di registrazione. Ancoraggio di Hold-Down fetta Custom (D). Il montaggio finale (E) della camera di registrazione montato sul chip MEA. Una fetta di cervello poggia sul fondo tenuto dal punto di ancoraggio. La freccia rossa indica la tubazione di PTFE che copre la cannula di riscaldamento, mentre il cerchio rosso indica l'elettrodo di riferimento, un pellet di KCl saturo sommersa da ACSF nel serbatoio di aspirazione. La freccia blu indica l'ago di aspirazione del serbatoio di scarico. <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Poli-D-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P7886</td><td>Necessario per il rivestimento MEA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S9888</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P9541</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Adrich</td><td>795488</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>C3306</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>MgCl2*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chimico MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD023</td><td></td></tr><tr><td>Acido piruvico chimico, 98%&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>107360</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>4-amminopiridina</td><td>Sigma-Adrich</td><td>A78403</td><td>Farmaco convulsivante</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>Sistema multicanale</td><td>STG4004-1,6 mA</td><td>Generatore di stimoli a 4 canali con tensione (&plusmn; 8 V) e l'uscita in corrente (&plusmn; 1,6 mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>Sistema multicanale</td><td>N/A</td><td>Amplificatore MEA</td></tr><tr><td>planare MEA</td><td>Sistema multicanale</td><td>60MEA500/30iR-Ti senza anello</td><td>Deve essere privo di anello per consentire l'utilizzo della camera di registrazione personalizzata</td></tr><tr>Sistema <td>multicanale</td><td></td><td>McRack</td><td>Software di registrazione</td></tr><tr><td>McStimulus II</td><td>Sistema</td><td></td> multicanale <td>STG4004 software di controllo</td></tr><tr><td>TC02</td><td>Sistema multicanale</td><td>TC02</td><td>Termostato a 2 canali</td></tr><tr><td>PH01</td><td>Sistema multicanale</td><td>PH01</td><td>Canula di perfusione riscaldante</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>Sistema multicanale</td><td>MPH&nbsp;</td><td>Supporto magnetico per PH01 e ago di aspirazione</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>Sigillante elastomerico utilizzato per montare la camera di registrazione personalizzata sulla camera di registrazione personalizzata MEA MEA</td></tr><tr><td></td><td>Strumento Crisel</td><td>Camera SKE Camera di registrazione personalizzata MEA Camera</td><td>di registrazione personalizzata</td></tr><tr><td>Elettrodo Ag/AgCl, pellet, 1,0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>Elettrodo di riferimento per la camera di registrazione personalizzata</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>Detergente enzimatico</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>L'ambiente di programmazione Mathworks</td><td></td><td>per la mappatura degli elettrodi</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Pellet di elettrodo Ag-AgCl 1,0 mm (E205). Elettrodo di riferimento.</td></tr></tbody></table>

registrazione e modulazione di attività epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Epilessia del lobo temporale (TLE) è la più comune sindrome epilettica complessa parziale e il meno sensibile ai farmaci. Stimolazione cerebrale profonda (DBS) è un approccio promettente quando il trattamento farmacologico non riesce o neurochirurgia non è raccomandato. Fettine di cervello acuto accoppiate a matrici di microelettrodi (MEA) rappresentano uno strumento prezioso per studiare le interazioni di rete neuronale e loro modulazione da stimolazione elettrica. Rispetto alle tecniche convenzionali registrazione extracellulare, che forniscono il vantaggio aggiunto di un maggior numero di punti di osservazione e una distanza nota Inter-elettrodo, che permettono di studiare il percorso di propagazione e velocità di elettrofisiologici segnali. Tuttavia, l'ossigenazione dei tessuti può essere notevolmente alterata durante MEA registrazione, che richiede un tasso alto di aspersione, che arriva al costo di rapporto segnale-rumore in diminuzione e superiore oscillazioni della temperatura sperimentale. Stimolazione elettrica ulteriormente sottolinea il tessuto cerebrale, che lo rende difficile da perseguire epoche di registrazione/stimolazione prolungata. Inoltre, elettrica modulazione dell'attività cerebrale fetta deve fare riferimento a specifiche strutture/vie all'interno della slice di cervello, che richiedono che il mapping di elettrodo facilmente e rapidamente eseguite dal vivo durante l'esperimento. Qui, vi illustriamo come eseguire la registrazione ed elettrica modulazione di 4-aminopiridina (4AP)-ha indotto l'attività epileptiform in fettine di cervello del roditore utilizzando MEAs planare. Indichiamo che il tessuto cerebrale ottenuti da topi supera il tessuto di cervello di ratto e così è più adatto per esperimenti MEA. Questo protocollo garantisce la generazione e la manutenzione di un modello stabile epileptiform che fedelmente riproduce le caratteristiche elettrofisiologiche osservate con registrazione potenziale campo convenzionale, persiste per diverse ore e dura più a lungo sostenuta stimolazione elettrica per epoche prolungate. Redditività dei tessuti in tutto l'esperimento è raggiunta grazie all'utilizzo di una camera di registrazione personalizzato piccolo-volume consentendo per flusso laminare e lo scambio di soluzione rapida anche a bassa (1 mL/min) velocità di perfusione. Veloce MEA mapping per monitoraggio in tempo reale e selezione degli elettrodi di stimolazione viene eseguito da un'interfaccia di utente grafica personalizzata (GUI).

Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un'interfaccia di utente grafica personalizzata.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuromodulazione per il trattamento dell'epilessia, come ad esempio quale area cerebrale e protocollo di stimolazione sono più adatti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le fette di cervello dei roditori rappresentano un modello semplificato e realistico dei circuiti cerebrali, mentre gli array di microelettrodi consentono più punti di osservazione a distanza interelettrodica nota. Per preparare il MEA, stendere uniformemente il sigillante elastomerico sulla superficie inferiore della camera di registrazione e assicurarsi che non vi siano bolle.Quindi, montare la camera di registrazione sul MEA con l'aiuto di una pinzetta e applicare una leggera pressione. Stendere uno strato di sigillante attorno al bordo esterno della camera di registrazione. Quindi, posizionare il gruppo MEA/camera in un ambiente chiuso e umido e lasciarlo indurire a temperatura ambiente per una notte.Per preparare il banco di registrazione, impostare il bagno caldo a 32 gradi Celsius. Quindi, versare l'ACSF di tenuta nelle camere di contenimento e preriscaldamento. Bollare le soluzioni con una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% e rimuovere eventuali bolle intrappolate utilizzando una pipetta Pasteur capovolta.Mantenere la camera di mantenimento a temperatura ambiente e posizionare la camera di preriscaldamento nel bagno caldo. Preparare le fette orizzontali di cervello ippocampo-corteccia secondo le procedure standard e lasciarle recuperare nella camera di contenimento a temperatura ambiente per almeno 60 minuti. Versare 4AP ACSF in una camera di incubazione.Quindi, bollarlo con una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% e rimuovere eventuali bolle intrappolate utilizzando una pipetta Pasteur capovolta. Successivamente, coprire la camera e trasferirla nel bagno caldo. Assicurarsi che le temperature ACSF di preriscaldamento e ACSF 4AP siano comprese tra 30 e 32 gradi Celsius.Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro rovesciato per trasferire una fetta di cervello nella camera di preriscaldamento e lasciare riposare il tessuto per 25-30 minuti. Quindi, trasferire la fetta di cervello nella camera di incubazione 4AP ACSF e lasciarla riposare per 60 minuti. Lasciare che l'ACSF 4AP fluisca attraverso il tubo di perfusione in un becher fino a quando non c'è aria all'interno.Quindi, arrestare il flusso della soluzione. Posizionare il chip MEA asciutto all'interno dell'amplificatore MEA e fissare la testa dell'amplificatore. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur in plastica per trasferire 4AP ACSF nel serbatoio di ingresso e uscita della camera di registrazione.Fissare la cannula riscaldante a un supporto magnetico e posizionare la punta all'interno della porta di ingresso della camera di registrazione. Quindi, fissare il supporto magnetico a una striscia magnetica sul MEA amphead dell'amplificatore. Collegare il tubo di perfusione alla cannula e la cannula al termostato.Successivamente, posizionare l'ago di aspirazione nel serbatoio di uscita. Verificare che vi sia una pressione negativa immergendo l'ago di aspirazione nell'ACSF e verificare la presenza di un rumore di aspirazione costante a bassa frequenza. Quindi, impostare il regolatore di flusso in modo che consenta una portata di un millilitro al minuto e iniziare a perfondere.Una volta che l'ACSF 4AP scorre attraverso la cannula, accendi il termostato. Impostare la cannula riscaldante a 37 gradi Celsius e la base MEA a 32 gradi Celsius per ottenere una temperatura compresa tra 32 e 34 gradi Celsius all'interno della camera di registrazione. Quindi, posizionare l'elettrodo di riferimento esterno nel serbatoio di ingresso della camera di registrazione.Una volta che il livello 4AP ACSF e la temperatura di registrazione si sono stabilizzati come desiderato, ruotare i rubinetti di perfusione e di aspirazione in posizione off per arrestarli temporaneamente. Trasferire rapidamente una fetta di cervello sulla camera di registrazione MEA utilizzando una pipetta Pasteur in vetro rovesciato. Regolarne la posizione sull'area di registrazione MEA secondo necessità utilizzando una pipetta Pasteur arricciata e lucidata a fuoco o un pennello morbido, compatto e piccolo.Posizionare l'ancora di fissaggio sulla fetta di cervello. Riavviare la perfusione e l'aspirazione riportando i rubinetti in posizione di accensione. Scatta una foto della fetta di cervello usando una fotocamera montata su un tavolino per microscopio invertito.Quindi, eseguire lo script mapMEA sul software del computer per avviare la GUI per mappare gli elettrodi. Fare clic sul pulsante Sfoglia per caricare l'immagine della fetta di cervello. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento appaia nella colonna superiore del semilato sinistro del MEA.Quindi, fai clic sul pulsante Attiva puntatore. Selezionare gli elettrodi superiore e inferiore nella colonna più a sinistra dell'array per contrassegnare le coordinate XY per il raddrizzamento dell'immagine e la mappatura degli elettrodi. Dal menu a discesa Tipo di sezione, selezionare Orizzontale.Seleziona la casella di controllo Strutture predefinite. Utilizzando i pulsanti numerati sotto l'immagine della fetta di cervello, selezionare gli elettrodi corrispondenti al ROI e fare clic sui pulsanti corrispondenti nel pannello della struttura per assegnarli. Ripeti questo passaggio per ogni ROI.Successivamente, premere il pulsante Salva. Il software genererà una cartella dei risultati contenente una tabella che riporta gli elettrodi selezionati e le ROI. Per lo studio elettrofisiologico, accendere l'unità di stimolo almeno 10 minuti prima del protocollo di stimolazione per consentire l'autocalibrazione e la stabilizzazione.Quindi, avviare il software di controllo dello stimolo e verificare che lo stimolatore e l'amplificatore MEA siano collegati correttamente, come indicato da un LED verde nel pannello principale del software di controllo dello stimolo. Impostare la stimolazione in configurazione bipolare. Collegare l'unità di stimolo a terra.Quindi, collegare le coppie di elettrodi a contatto con lo strato di celle piramidali del CA1/subiculum prossimale tra quelli mappati con lo script mapMEA. Per acquisire i dati, premere il pulsante di riproduzione nel pannello principale del software di registrazione. Registrare almeno quattro secrezioni ictali.Successivamente, esegui un test di input/output veloce per identificare la migliore intensità di stimolo. Per fare ciò, utilizzare il pannello principale per progettare un impulso di corrente bifasico positivo-negativo quadrato con una durata di 100 microsecondi per fase. Nella scheda Ampiezza impulso, immettere un'ampiezza iniziale dell'impulso di 100 microampere per fase.Impostare l'impulso di stimolazione a 0,2 hertz o inferiore aggiungendo un intervallo tra gli impulsi di cinque secondi o più. Aumentare l'ampiezza dello stimolo da 50 a 100 microampere ad ogni prova fino a quando la stimolazione può evocare in modo affidabile eventi di tipo interictale nelle cortecce paraippocampali. Per la modulazione elettrica dell'ictogenesi limbica, programmare l'unità di stimolo in modo che fornisca il protocollo di stimolazione di interesse e utilizzare l'ampiezza dello stimolo identificata durante il test di input/output.Dopo l'interruzione della stimolazione, verificare il ripristino della rete alla condizione pre-stimolo registrando almeno quattro scariche ictali. Questa figura mostra le registrazioni dell'attività ictale indotta da 4AP nella corteccia entorinale e nella corteccia peririnale durante la condizione di controllo, la stimolazione periodica a un hertz e durante il recupero dopo la sospensione dello stimolo. Questo grafico mostra la quantificazione dell'effetto della stimolazione periodica a un hertz, che indica una significativa riduzione del tempo totale di presa durante la stimolazione.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di posizionare rapidamente e correttamente la fetta di cervello sul MEA. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la manipolazione farmacologica per rispondere a ulteriori domande sul contributo dei neurotrasmettitori o dei canali ionici all'attività epilettiforme e all'effetto della neuromodulazione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'interazione della rete neuronale in salute e malattia nei neuroni in coltura e nelle fette di cervello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare e modulare elettricamente l'attività epilettiforme indotta dalla quattro-aminopiridina in fette di cervello di roditori accoppiate a MEA.

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Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video descrive la tecnica per registrare l'attività epilettiforme di fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo ex vivo utilizzando l'elettrofisiologia o l'EEG. Questo aiuta a studiare la dinamica e la progressione dell'epilettogenesi e a selezionare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento dell'epilessia.

Tecnica di registrazione basata sull'elettroencefalografia per registrare l'attività epilettiforme

Questo protocollo prevede l'utilizzo di un array di microelettrodi (MEA) per registrare l'attività elettrica in una fetta di cervello esposta a un farmaco che induce convulsioni. La procedura include il posizionamento della fetta di cervello in una camera di registrazione MEA, l'applicazione di stimolazione elettrica per indurre convulsioni artificiali e l'analisi dei segnali risultanti.

Monitoraggio dell'attività elettrica neurale indotta da convulsioni in fette di cervello utilizzando array di microelettrodi

Questo video mostra un metodo per la registrazione EEG ad alta risoluzione in un modello di ratto di epilessia focale. Delinea i passaggi coinvolti nella preparazione del ratto, collegando un mini-berretto EEG multicanale al cuoio capelluto del ratto e registrando l'EEG per identificare gli eventi correlati alle convulsioni caratteristici del modello di epilessia.

Registrazione elettroencefalografica in un modello di ratto di epilessia focale

Questo video mostra la registrazione elettroencefalografica (EEG) delle crisi epilettiche nei ratti indotti dall'epilessia. Un ratto con elettrodi impiantati nell'ippocampo ventrale viene collegato al sistema di registrazione EEG e posto in una camera di plexiglass. Il ratto è autorizzato a muoversi liberamente mentre l'attività cerebrale viene registrata per monitorare l'insorgenza di convulsioni.

Registrazione elettroencefalografica delle crisi epilettiche nei ratti indotti da epilessia

Questo video dimostra l'induzione di eventi ictali in fette corticali coronali da un topo transgenico che esprime canali cationici attivati dalla luce nei neuroni piramidali eccitatori corticali. La fetta viene posta in una camera di registrazione e un elettrodo di registrazione viene inserito nello strato corticale superficiale. Dopo la perfusione con un farmaco che induce convulsioni che blocca i canali del potassio, i neuroni diventano ipereccitabili e generano eventi ictali spontanei. Per...

Generazione di eventi ictali spontanei e on-demand in fette corticali cerebrali di topo

Siamo qui descritto come eseguire multi-elettrodo registrazioni matrice di tessuto corticale epilettica umana. Resezione del tessuto epilettico, preparazione e fetta di array multi-elettrodo di registrazioni di eventi interictali e ictali sono dimostrati in dettaglio.

Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

Gli studi hanno dimostrato che la stimolazione transcranica catodica a corrente continua può produrre effetti soppressivi sulle convulsioni resistenti ai farmaci. In questo studio, è stata ideata una configurazione sperimentale in vitro in cui la stimolazione a corrente continua e la registrazione di array multielettrodi dell'attività convulsiva sono state valutate nella preparazione di fette di cervello di topi. Sono stati valutati i parametri di stimolazione a corrente continua.

Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

Il protocollo descrive la metodologia di registrazione extracellulare nella corteccia motoria (MC) per rivelare le proprietà elettrofisiologiche extracellulari in topi coscienti che si muovono liberamente, nonché l'analisi dei dati dei potenziali di campo locale (LFP) e dei picchi, utile per valutare l'attività neurale della rete alla base dei comportamenti di interesse.

Registrazione extracellulare multicanale in topi che si muovono liberamente

Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo di sistemi di array di microelettrodi ad alta densità di semiconduttori a ossido di metallo complementare (CMOS-HD-MEAs) per registrare l'attività simile a un sequestro da fette di cervello ex vivo .

Attività simile a una crisi epilettica di alta qualità da fette cerebrali acute utilizzando un sistema di array di microelettrodi ad alta densità a semiconduttore di ossido di metallo complementare

Questo protocollo mira a placcare stabilmente assembloidi fusi dorsale-ventrale su array multi-elettrodi per modellare l'epilessia in vitro.

Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo è stato sviluppato per creare un sistema affidabile e facilmente accessibile per la registrazione dell'EEG dei roditori in movimento libero.

Un protocollo economico e minimamente invasivo per la registrazione dell'elettroencefalografia cronica multisito in topi che si muovono liberamente

Scopri come registrare e modulare l'attività epilettiforme indotta da 4-aminopiridina in fettine di cervello di roditore usando microelettrodi a matrice. Questo metodo elettrofisiologico ottimizza i protocolli di stimolazione per la ricerca sull'epilessia.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

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