Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuromodulazione per il trattamento dell'epilessia, come ad esempio quale area cerebrale e protocollo di stimolazione sono più adatti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le fette di cervello dei roditori rappresentano un modello semplificato e realistico dei circuiti cerebrali, mentre gli array di microelettrodi consentono più punti di osservazione a distanza interelettrodica nota. Per preparare il MEA, stendere uniformemente il sigillante elastomerico sulla superficie inferiore della camera di registrazione e assicurarsi che non vi siano bolle.

Quindi, montare la camera di registrazione sul MEA con l'aiuto di una pinzetta e applicare una leggera pressione. Stendere uno strato di sigillante attorno al bordo esterno della camera di registrazione. Quindi, posizionare il gruppo MEA/camera in un ambiente chiuso e umido e lasciarlo indurire a temperatura ambiente per una notte.

Per preparare il banco di registrazione, impostare il bagno caldo a 32 gradi Celsius. Quindi, versare l'ACSF di tenuta nelle camere di contenimento e preriscaldamento. Bollare le soluzioni con una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% e rimuovere eventuali bolle intrappolate utilizzando una pipetta Pasteur capovolta.

Mantenere la camera di mantenimento a temperatura ambiente e posizionare la camera di preriscaldamento nel bagno caldo. Preparare le fette orizzontali di cervello ippocampo-corteccia secondo le procedure standard e lasciarle recuperare nella camera di contenimento a temperatura ambiente per almeno 60 minuti. Versare 4AP ACSF in una camera di incubazione.

Quindi, bollarlo con una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% e rimuovere eventuali bolle intrappolate utilizzando una pipetta Pasteur capovolta. Successivamente, coprire la camera e trasferirla nel bagno caldo. Assicurarsi che le temperature ACSF di preriscaldamento e ACSF 4AP siano comprese tra 30 e 32 gradi Celsius.

Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro rovesciato per trasferire una fetta di cervello nella camera di preriscaldamento e lasciare riposare il tessuto per 25-30 minuti. Quindi, trasferire la fetta di cervello nella camera di incubazione 4AP ACSF e lasciarla riposare per 60 minuti. Lasciare che l'ACSF 4AP fluisca attraverso il tubo di perfusione in un becher fino a quando non c'è aria all'interno.

Quindi, arrestare il flusso della soluzione. Posizionare il chip MEA asciutto all'interno dell'amplificatore MEA e fissare la testa dell'amplificatore. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur in plastica per trasferire 4AP ACSF nel serbatoio di ingresso e uscita della camera di registrazione.

Fissare la cannula riscaldante a un supporto magnetico e posizionare la punta all'interno della porta di ingresso della camera di registrazione. Quindi, fissare il supporto magnetico a una striscia magnetica sul MEA amphead dell'amplificatore. Collegare il tubo di perfusione alla cannula e la cannula al termostato.

Successivamente, posizionare l'ago di aspirazione nel serbatoio di uscita. Verificare che vi sia una pressione negativa immergendo l'ago di aspirazione nell'ACSF e verificare la presenza di un rumore di aspirazione costante a bassa frequenza. Quindi, impostare il regolatore di flusso in modo che consenta una portata di un millilitro al minuto e iniziare a perfondere.

Una volta che l'ACSF 4AP scorre attraverso la cannula, accendi il termostato. Impostare la cannula riscaldante a 37 gradi Celsius e la base MEA a 32 gradi Celsius per ottenere una temperatura compresa tra 32 e 34 gradi Celsius all'interno della camera di registrazione. Quindi, posizionare l'elettrodo di riferimento esterno nel serbatoio di ingresso della camera di registrazione.

Una volta che il livello 4AP ACSF e la temperatura di registrazione si sono stabilizzati come desiderato, ruotare i rubinetti di perfusione e di aspirazione in posizione off per arrestarli temporaneamente. Trasferire rapidamente una fetta di cervello sulla camera di registrazione MEA utilizzando una pipetta Pasteur in vetro rovesciato. Regolarne la posizione sull'area di registrazione MEA secondo necessità utilizzando una pipetta Pasteur arricciata e lucidata a fuoco o un pennello morbido, compatto e piccolo.

Posizionare l'ancora di fissaggio sulla fetta di cervello. Riavviare la perfusione e l'aspirazione riportando i rubinetti in posizione di accensione. Scatta una foto della fetta di cervello usando una fotocamera montata su un tavolino per microscopio invertito.

Quindi, eseguire lo script mapMEA sul software del computer per avviare la GUI per mappare gli elettrodi. Fare clic sul pulsante Sfoglia per caricare l'immagine della fetta di cervello. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento appaia nella colonna superiore del semilato sinistro del MEA.

Quindi, fai clic sul pulsante Attiva puntatore. Selezionare gli elettrodi superiore e inferiore nella colonna più a sinistra dell'array per contrassegnare le coordinate XY per il raddrizzamento dell'immagine e la mappatura degli elettrodi. Dal menu a discesa Tipo di sezione, selezionare Orizzontale.

Seleziona la casella di controllo Strutture predefinite. Utilizzando i pulsanti numerati sotto l'immagine della fetta di cervello, selezionare gli elettrodi corrispondenti al ROI e fare clic sui pulsanti corrispondenti nel pannello della struttura per assegnarli. Ripeti questo passaggio per ogni ROI.

Successivamente, premere il pulsante Salva. Il software genererà una cartella dei risultati contenente una tabella che riporta gli elettrodi selezionati e le ROI. Per lo studio elettrofisiologico, accendere l'unità di stimolo almeno 10 minuti prima del protocollo di stimolazione per consentire l'autocalibrazione e la stabilizzazione.

Quindi, avviare il software di controllo dello stimolo e verificare che lo stimolatore e l'amplificatore MEA siano collegati correttamente, come indicato da un LED verde nel pannello principale del software di controllo dello stimolo. Impostare la stimolazione in configurazione bipolare. Collegare l'unità di stimolo a terra.

Quindi, collegare le coppie di elettrodi a contatto con lo strato di celle piramidali del CA1/subiculum prossimale tra quelli mappati con lo script mapMEA. Per acquisire i dati, premere il pulsante di riproduzione nel pannello principale del software di registrazione. Registrare almeno quattro secrezioni ictali.

Successivamente, esegui un test di input/output veloce per identificare la migliore intensità di stimolo. Per fare ciò, utilizzare il pannello principale per progettare un impulso di corrente bifasico positivo-negativo quadrato con una durata di 100 microsecondi per fase. Nella scheda Ampiezza impulso, immettere un'ampiezza iniziale dell'impulso di 100 microampere per fase.

Impostare l'impulso di stimolazione a 0,2 hertz o inferiore aggiungendo un intervallo tra gli impulsi di cinque secondi o più. Aumentare l'ampiezza dello stimolo da 50 a 100 microampere ad ogni prova fino a quando la stimolazione può evocare in modo affidabile eventi di tipo interictale nelle cortecce paraippocampali. Per la modulazione elettrica dell'ictogenesi limbica, programmare l'unità di stimolo in modo che fornisca il protocollo di stimolazione di interesse e utilizzare l'ampiezza dello stimolo identificata durante il test di input/output.

Dopo l'interruzione della stimolazione, verificare il ripristino della rete alla condizione pre-stimolo registrando almeno quattro scariche ictali. Questa figura mostra le registrazioni dell'attività ictale indotta da 4AP nella corteccia entorinale e nella corteccia peririnale durante la condizione di controllo, la stimolazione periodica a un hertz e durante il recupero dopo la sospensione dello stimolo. Questo grafico mostra la quantificazione dell'effetto della stimolazione periodica a un hertz, che indica una significativa riduzione del tempo totale di presa durante la stimolazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di posizionare rapidamente e correttamente la fetta di cervello sul MEA. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la manipolazione farmacologica per rispondere a ulteriori domande sul contributo dei neurotrasmettitori o dei canali ionici all'attività epilettiforme e all'effetto della neuromodulazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'interazione della rete neuronale in salute e malattia nei neuroni in coltura e nelle fette di cervello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare e modulare elettricamente l'attività epilettiforme indotta dalla quattro-aminopiridina in fette di cervello di roditori accoppiate a MEA.