Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo
11 agosto 2018
Qui, forniamo una dimostrazione del modello cutaneo richiamo della bolla di aspirazione. Il modello consente un semplice accesso a studiare umano in vivo risposte immunitarie, per esempio nel contesto di sviluppo di un vaccino.
L'obiettivo generale di questo video è dimostrare il metodo di richiamo cutaneo della vescica di aspirazione che ci consente di raccogliere cellule T antigene-specifiche e citochine rappresentative della risposta immunitaria adattativa in vivo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le risposte cellulari e l'immunità adattativa negli esseri umani. Il vantaggio principale di questa tecnologia è che ci consente di raccogliere cellule T antigene-specifiche direttamente dal sito della reazione immunitaria utilizzando un metodo relativamente non invasivo e sicuro.
Il principio di base del richiamo cutaneo è quello di depositare l'antigene nello strato dermico della pelle. Negli individui con memoria immunologica esistente dell'antigene, le cellule T migreranno verso il sito di reazione e indurranno una risposta immunitaria locale in cui specifiche cellule T vengono espanse clonalmente e differenziate in situ. L'induzione di bolle di aspirazione su questa reazione ci consente di raccogliere queste specifiche cellule T e le citochine prodotte in vivo.
In questa dimostrazione video, utilizziamo la PPD come antigene di richiamo. La PPD è comunemente usata per la diagnosi dell'infezione da mycobacterium tuberculosis. Ma induce anche reazioni cutanee nelle persone precedentemente vaccinate con il vaccino BCG, come vedrai in questo video.
I materiali per il test cutaneo alla tubercolina includono tamponi imbevuti di alcol, una siringa da un millilitro con un ago corto da 27 a 30 gauge e una soluzione di PPD approvata per uso umano. Utilizzare una soluzione PPD di 20 unità di tubercolina per millilitro. Disinfettare la fiala con un tampone imbevuto di alcol.
E si prega di notare che la composizione può variare tra i produttori. Quindi individuare il sito di iniezione sul lato ventrale dell'avambraccio del volontario e disinfettare l'area utilizzando un tampone imbevuto di alcol. Utilizzare una siringa sterile da un millilitro con ago fisso da 29 gauge e 12 millimetri.
Mescolare delicatamente e aspirare 0,1 millilitri di soluzione PPD. Assicurati che non ci siano bolle visibili. Stressare la pelle e puntare l'ago con un angolo da cinque a quindici gradi con lo smusso rivolto verso l'alto.
Inserisci la punta dell'ago nello strato dermico della pelle e assicurati che la punta sia quasi visibile attraverso l'epidermide. Iniettare lentamente 0,1 millilitri di soluzione PPD. Se somministrata correttamente, apparirà immediatamente una papula da sei a dieci millimetri.
La papula scompare dopo circa dieci minuti. Sono possibili deposizioni multiple di PPD, ma potrebbero richiedere un'ulteriore approvazione etica. Se vengono somministrate due iniezioni, mirare alla massima separazione mantenendo una buona distanza dalla zona del gomito e del polso.
La reazione cutanea clinica compare entro le prime 24 ore ed è accompagnata da una sensazione di prurito. Misurare l'entità della reazione cutanea da 48 a 72 ore dopo l'iniezione. Quando si valuta la risposta, è importante misurare l'indurimento e non l'eritema.
Palpare il gonfiore del cappello usando il dito. Quindi segna i bordi dell'indurimento usando una penna a sfera. Infine, utilizzare un righello morbido per misurare il diametro di indurimento e annotare i risultati in millimetri.
Dopo sette giorni, è il momento di indurre la vescica di aspirazione. Per l'induzione della vescica di aspirazione cutanea, utilizzare una pompa a vuoto con una camera di aspirazione collegata. Utilizzare un dispositivo disponibile in commercio o personalizzato.
È importante sottolineare che la pompa deve essere regolabile nell'intervallo da meno 20 a meno 40 kilopascal e fornire una pressione negativa costante e affidabile. La parte inferiore della camera di aspirazione è costituita da una piastra con un piccolo foro che è a contatto con la pelle. Le placche possono avere fori singoli o multipli e possono essere applicate diverse dimensioni per adattarsi alla reazione cutanea.
La parte superiore della camera deve consentire il monitoraggio visivo del blister. Prima dell'induzione, disinfettare la pelle e la piastra della camera. Assicurati che il braccio sia appoggiato comodamente.
Fissare e fissare la camera, qui utilizzando cinghie regolabili. Il centro della reazione cutanea dovrebbe essere visibile attraverso il foro inferiore della piastra. Accendere il dispositivo di aspirazione e regolare la pressione negativa a meno 20 kilopascal.
Dopo trenta minuti, aumentare la pressione a meno 25 kilopascal. Dopo 60 minuti, aumentare ulteriormente la pressione a meno 30 kilopascal. E mantieni la pressione qui fino a quando non si forma completamente una singola vescica.
La fase di induzione delle vesciche dura normalmente da una a tre ore. Con l'effettiva formazione di vesciche che si verifica gradualmente negli ultimi 30 minuti, come dimostrato qui ad alta velocità. Se ci sono segni di rottura o emorragia delle vesciche, si consiglia di rilasciare lentamente la pressione e interrompere l'induzione in anticipo.
Le vesciche possono apparire come vesciche a fusione singola o multipla. Il processo è spesso associato a una sensazione di prurito. Dopo che il blister è completamente formato, rilasciare la pressione e rimuovere con cautela la camera di aspirazione.
Nelle vesciche correttamente indotte, lo strato epidermico è completamente separato dallo strato dermico della pelle, lasciando una cavità piena di liquido. Proteggi la vescica applicando una medicazione morbida sulla zona circostante la pelle e posizionando un tappo rigido sopra la vescica, qui da un tubo di plastica da 15 millilitri. Fissare il cappuccio con un nastro anallergico seguito da una benda morbida ed elastica.
Istruire il volontario a conservare la medicazione protettiva durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere con cura la medicazione e disinfettare l'area della vescica con uno spray. Utilizzare una siringa sterile da 2 millilitri con un ago calibro 23 per raccogliere il contenuto del blister.
Inserire l'ago nella parte laterale superiore del tetto del blister e aspirare lentamente il fluido. Evita di toccare il pavimento della cavità, ma assicurati di raccogliere tutto il fluido poiché il volume della bolla potrebbe essere basso, come in questo esempio. La vescica collassata guarirà senza cicatrici.
Aggiungere una medicazione protettiva sulla vescica. Quindi trasferire il liquido della vescica in una provetta sterile. Centrifugare per quattro minuti a 600 g con una centrifuga da tavolo.
Successivamente, raccogliere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di terreno cellulare. Le cellule fresche sono ora pronte per il conteggio e ulteriori analisi. Le cellule blister di aspirazione possono essere utilizzate per analisi in vitro, come la citometria a flusso.
In questo esperimento con volontari vaccinati con BCG, la resa cellulare variava da 15.000 a oltre 200.000 cellule per blister. Qui, abbiamo isolato le cellule da un singolo blister di aspirazione e stimolato le cellule con PPD in vitro seguita da una colorazione e citometria a flusso. Per confronto, abbiamo fatto un'analisi parallela sulle PBMC dello stesso volontario vaccinato con PCG.
Nei pannelli, si vedono popolazioni di cellule T CD4 positive colorate per la produzione intercellulare di TNF-alfa, interferone-gamma e IL2. In questo volontario, oltre il 30% delle cellule T CD4 positive isolate dalla pelle erano antigene-specifiche. Nelle PBMC, questa frazione era inferiore all'1%Inoltre, i profili citochinici individuali delle cellule blister erano rappresentativi sia delle cellule T della memoria centrale che delle cellule T effettrici, illustrando come questo metodo ci permetta di studiare le risposte della memoria di lunga durata generate in vivo.
Qui, la figura A illustra che il fluido ottenuto dalle bolle di aspirazione può essere analizzato per le citochine prodotte in vivo. Nella figura B, abbiamo coltivato cellule ottenute da blister di aspirazione per quattro giorni in presenza di mycobacterium tuberculosis, illustrando come le cellule blister di aspirazione siano in grado di produrre interferone-gamma e TNF alfa ex vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come indurre e raccogliere cellule da vesciche di aspirazione dopo la deposizione cutanea di antigene.
In questa dimostrazione, abbiamo utilizzato un antigene di particolare rilevanza nel campo della ricerca sulla tubercolosi. Tuttavia, i principi di base di questa metodologia possono essere utili nel campo dell'immunità adattativa o negli studi che studiano gli agenti bersaglio delle cellule T. Inoltre, ricorda che l'etica e la sicurezza sono una priorità assoluta quando si lavora con volontari umani.
Ricorda inoltre che lavorare con campioni umani può essere pericoloso e che le precauzioni di sicurezza devono essere sempre seguite in laboratorio.
Panoramica
Questo video illustra il metodo cutaneo di richiamo tramite vescica sottovuoto, che consente la raccolta di linfociti T e citochine specifici per l'antigene in vivo. Questa tecnica è particolarmente utile per lo studio delle risposte immunitarie adattative umane, ad esempio nello sviluppo di vaccini.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Risposta immunitaria adattativa
- Sviluppo di vaccini
Sfondo
- Il metodo delle vesciche da aspirazione fornisce un modo non invasivo per studiare le risposte immunitarie.
- Permette la raccolta di linfociti T direttamente dal sito della reazione immunitaria.
- La PPD viene utilizzata come antigene di richiamo per valutare la memoria immunitaria.
- Questo metodo può contribuire alla comprensione dei meccanismi cellulari dell'immunità.
Scopo dello studio
- Dimostrare la tecnica delle vesciche da aspirazione per il prelievo di cellule immunitarie.
- Analizzare le risposte delle cellule T specifiche per l'antigene negli esseri umani.
- Fornire una guida pratica per l'implementazione di questo metodo nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di PPD nello strato dermico della pelle.
- Induzione di vesciche da suzione per raccogliere linfociti T e citochine.
- Misurazione delle reazioni cutanee dopo l'iniezione.
- Prelevamento del liquido vescicolare per ulteriori analisi.
Risultati principali
- Induzione con successo di vesciche da aspirazione dimostrata.
- I linfociti T raccolti e le citochine possono essere analizzati in vitro.
- Metodologia chiara per la misurazione delle risposte immunitarie stabilita.
- Sicurezza ed efficacia della tecnica della vescica da aspirazione dimostrate.
Conclusioni
- Il metodo delle vesciche da aspirazione è efficace per lo studio dell'immunità adattativa.
- Questa tecnica può essere d'aiuto nella ricerca e nello sviluppo di vaccini.
- Fornisce uno strumento prezioso per gli studi immunologici nell'uomo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Lo studio delle risposte di richiamo dei linfociti T umani in vivo fornisce informazioni meccanicistiche fondamentali per lo sviluppo di vaccini e la validazione di bersagli per l'immunoterapia. Il metodo cutaneo del richiamo mediante bolla da suzione permette un accesso diretto ai linfociti T specifici per l'antigene e ai microambienti citochinici nel sito della reazione immunitaria, supportando la riduzione del rischio preclinico di agenti mirati ai linfociti T. Questo approccio aumenta la capacità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando risultati ottenuti ex vivo alla biologia umana in vivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando direttamente dai tessuti umani linfociti T CD4+ polifunzionali specifici per l'antigene.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale di bersagli dei linfociti T in un sistema rilevante per la malattia.
- Valore strategico: Facilita l'identificazione dei candidati principali fornendo un'alta frazione di cellule specifiche per l'antigene da utilizzare in schermate meccanicistiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la standardizzazione di saggi successivi mediante letture multiplex e citofluorimetriche.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi e riproducibili sulla produzione di citochine e sulla funzionalità dei linfociti T ex vivo.
- Valore strategico: Consente il riutilizzo scalabile della piattaforma per valutare gli effetti di composti sulle risposte dei linfociti T della memoria umana.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la rilevanza clinica attraverso un modello umano vaccinato con BCG di richiamo alla tubercolina, in linea con le strategie traslazionali per biomarcatori.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, catturando i profili di cellule T della memoria centrale ed effettore generati in vivo.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sull'immunità cellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test delle ipotesi nella fase iniziale fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, in particolare per terapie che modulano i linfociti T e candidati vaccini.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il recupero di linfociti T clonalmente espansi e differenziati dal sito della reazione immunitaria.
- Screening: Garantisce la prontezza per i saggi grazie a protocolli standardizzati di induzione delle vesciche e di raccolta del liquido, che forniscono una viabilità cellulare costante per le analisi successive.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative della frequenza di linfociti T specifici per l'antigene e dei profili polifunzionali di citochine (ad esempio, IFN-γ, TNF-α, IL-2) per la valutazione comparativa delle diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica dimostrando come le cellule ottenute dalle vesciche da aspirazione riflettano le risposte di memoria a lunga durata generate in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per lo studio dell'immunità adattativa umana in programmi di vaccinazione e immunoterapia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle risposte immunitarie umane.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dell'isolamento di linfociti T specifici per l'antigene dalla cute umana.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci riguardo al proseguimento o meno dello sviluppo, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di immunoterapie.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati di risposta immunitaria rilevanti per l'uomo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche negli studi su volontari umani, nella somministrazione cutanea di antigeni e nelle tecniche di induzione di vesciche da aspirazione.
- Necessita di una pompa a vuoto regolabile (–20 a –40 kPa), siringhe sterili, antigene PPD e attrezzature per la centrifugazione per l'elaborazione delle cellule.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle misurazioni delle vesciche, al prelievo e al trasferimento del liquido, in collaborazione tra team di immunologia e clinici.
- Comporta la necessità di adattamenti per diversi modelli di antigene e siti di reazione cutanea, mantenendo al contempo gradienti di pressione negativa costanti.
- Comprende limitazioni pratiche, come la resa variabile di cellule (15.000–200.000 cellule/vescica) e la dipendenza dalla memoria immunologica preesistente nei volontari.
