Name: Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri un modello di ferita neuronale in Drosophila con imaging in vivo e laser a due fotoni per screening di neuro-rigenerazione. Questo metodo permette di identificare promotori e inibitori nel sistema nervoso periferico e centrale.

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Ringraziamo Jessica Goldshteyn per il supporto tecnico. Lavoro in laboratorio canzone è finanziato dalla sovvenzione NIH R00NS088211 e intellettuale e disabilità dello sviluppo Research Center (IDDRC) nuovo programma Development Award.

1. preparazione delle piastre di coltura e delle bottiglie
<ol><li>Preparazione delle piastre di agar di succo d'uva<ol>
<li>Aggiungere 10 g di agar in polvere, succo di uva 200ml e 192 mL ddH2O in un becher e forno a microonde per circa 4-5 minuti, mescolando in modo discontinuo fino a quando l'agar è dissolto completamente.</li>
		<li>In una cappa, raffreddare la soluzione a circa 60 ° C. Aggiungere 4,2 mL di etanolo al 95% e 4,0 mL di acido acetico glaciale. Regolare il volume totale della soluzione da 400 mL con ddH2O. Mix bene.</li>
		<li>Per ogni piatto di 35 mm, aggiungere circa 2-3 mL di soluzione. Fare circa 120-150 tavole per un totale di 400 mL di soluzione di succo d'uva agar.</li>
		<li>Attendere 10 minuti per raffreddare le piastre e solidificare la soluzione di agar. Imballare il succo d'uva piastre di agar in sacchetti ziplock self-sigillato e conservare a 4 ° C per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei flaconi per coltura della drosofila<ol>
<li>Utilizzare una lama per perforare un foro triangolare del lunghezza laterale di 1,5 cm su una parete del flacone di coltura della drosofila e riempire il foro con una sfera del diametro di 2-2.5 cm di cotone per la ventilazione.</li>
		<li>Inserire la bottiglia con una piastra di agar di succo d'uva completata con circa 0,5 cm3 di pasta di lievito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. raccolta delle larve di Drosophila
<ol><li>Impostare la pagina di croci di mosche adulte<ol>
<li>Posto 10 femmine vergini e 5 maschio adulto vola insieme in un flacone di coltura collegato con una piastra di agar di succo d'uva.</li>
		<li>Mettere i fondi di bottiglia fino a 25° C, in modo che mosche deporranno le uova sulla piastra di agar di succo d'uva. Cambiare la piastra con la pasta di lievito almeno una volta al giorno. Per un periodo di raccolta 2-h, che consente la raccolta delle larve di una fase inerente allo sviluppo omogenea, iniziare con più di 20 Vergine femmine e 10 maschi al punto 2.1.1.</li>
		<li>Cultura la piastra a 25° C in una capsula Petri 60 mm con un panno umido, per esempio, imbevuta di soluzione di acido propionico del 0,5%. Disporre il tessuto in modo che non bloccare il flusso di ossigeno. Nota: La soluzione di acido propionico è utilizzata per mantenere l'umidità nel piatto ed evitare la crescita di muffe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta delle larve di un età specifici<ol>
<li>Utilizzare un paio di pinze per trasferire le larve della fase desiderata, ad esempio, 2nd a 3rd instar larve a 48-72 h dopo (AEL), la deposizione delle uova per una nuova piastra di agar di succo d'uva senza pasta di lievito.</li>
		<li>Rimuovere il lievito dalla pelle di larve consentendo loro di strisciare sul piatto di nuovo, per evitare che interferiscano potenziali di lievito con laser assotomia e imaging. In alternativa, pulire accuratamente le larve di lavarli in un piatto di PBS e asciugare brevemente su un pezzo di carta velina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. due-fotone ferita e Imaging confocale
<ol><li>Installazione di microscopio Nota: Un microscopio a due fotoni laser confocale del laser è stato usato per questo esperimento, ma altri sistemi con un setup di equivalente saranno anche sufficiente. Il laser del due-fotone (930 nm) è stato utilizzato per la consegna di lesioni e un laser ad Argon (488 nm) è stato usato per formazione immagine confocal di GFP.<ol>
<li>All'inizio di ogni sessione, accendere il laser del due-fotone e/o il laser(s) confocale e il microscopio. Aprire il software di imaging.</li>
		<li>Per la ferita del due-fotone, impostare i seguenti parametri per l'imaging di GFP con il laser del due-fotone a 930 nm (1.950 mW).<ol>
<li>Selezionare la modalità di scansione di linea. Aprire completamente il foro stenopeico. Aumentare l'intensità del laser al ~ 20% (390 mW).</li>
			<li>Selezionare 512 x 512 come l'esplorazione della struttura. Utilizzare la massima velocità di scansione (in genere con il tempo di permanenza di pixel a 0,77 µs). Assicurarsi che il numero medio è 1 e profondità di bit è di 8 bit.</li>
			<li>Guadagno a ~ 750 e l'offset a 0.</li>
			<li>Salva questo pre-set protocollo sperimentale come 2P GFP 930 ablazione, consentendo facile riutilizzare in futuro gli esperimenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per formazione immagine confocal, impostare i seguenti parametri per l'imaging di GFP con il laser di Argon a 488 nm:<ol>
<li>Selezionare la scheda di acquisizione e quindi Z-stack.</li>
			<li>Sotto "Laser", attivare l'alimentazione per il laser di Argon 488 nm.</li>
			<li>Vai ai canali, selezionare il laser 488 mm e aumentare la potenza del laser per 5-10%. Per il foro stenopeico, utilizzare l'unità arioso di 1-2 (AU). Regolare il guadagno a 650.</li>
			<li>In Modalità di acquisizione, selezionare 1024 x 1024 come l'esplorazione della struttura, utilizzare la velocità di scansione massima, un numero medio di 2 e profondità di bit di 8 Bit.</li>
			<li>Salvare questo protocollo sperimentale pre-impostato come GFP Imaging.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia di larve con etere dietilico e montaggio<ol>
<li>In una cappa aspirante, posizionare un piatto di vetro 60 mm in una capsula di Petri di plastica di 15 cm. Piega e laici un pezzo di carta velina nella parte inferiore del piatto di vetro, quindi inserire una piastra di agar di succo d'uva sul tessuto. Aggiungere etere etilico nel piatto di vetro, al punto in cui la carta velina è intrisa e c'è uno strato di etere liquido rimanente nel piatto. Tenere il coperchio in ogni momento.</li>
		<li>Preparare un vetrino con una goccia di halocarbone 27 olio nel centro. Aggiungere 4 macchie di grasso per vuoto sui quattro angoli della diapositiva, per poi sostenere il vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Utilizzare pinze per raccogliere una larva pulita e posizionarlo sulla piastra di agar nel piatto di vetro di 60 mm. Coprire il piatto di vetro con il coperchio e attendere fino a quando la larva smette di muoversi. PNS ferita/imaging, per estrarre la larva appena la coda ferma spasmi muscolari. Per il sistema nervoso centrale, attendere fino a quando la larva intera diventa immobile, soprattutto i segmenti di testa. Nota: I tempi di esposizione di etere sono fondamentali. Vedere la discussione.</li>
		<li>Delicatamente prendere la larva anestetizzata e posizionarlo testa-montante nella goccia di olio halocarbone sulla diapositiva. Aggiungere un vetrino coprioggetto sopra la diapositiva. Utilizzare una leggera pressione per spingere il vetrino coprioggetto, fino a toccare la larva (Figura 1A).</li>
		<li>Regolare posizione di larva spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti verso sinistra o verso destra per rotolare la larva, in modo che il neurone/assone/dendrite di interesse è sulla parte superiore e più vicina alla lente del microscopio.</li>
		<li>Per lesioni PNS, è possibile montare il lato dorsale della larva, in modo che entrambe le trachee sono visibili. Poi rotolare la larva ~ 30 gradi a sinistra per ferire classe III da neurone assoni (Figura 1B e 1C), 90 gradi per ferire gli di assoni di classe IV da neurone (Figura 1B e 1E) o ~ 30 gradi per ferire classe IV da neurone dendriti ( Figura 2A).</li>
		<li>Per lesione dello SNC, posizionare la larva per essere perfettamente ventrale verso l'alto (Figura 3A), in modo che la regione di interesse è più vicina alla lente del microscopio nel piano z.</li>
	</ol></li>
	<li>Ferita da due fotoni laser<ol>
<li>Porre il vetrino con la larva sotto il microscopio e fissarlo in posizione con il supporto per diapositive sul palco. Obiettivo di uso il 10 X (0,3 NA) per trovare la larva.</li>
		<li>Aggiungere 1 goccia di olio oggettiva il vetrino coprioggetto, passare al 40 X (1,3 NA) obiettivo e regolare la messa a fuoco.</li>
		<li>Passare alla modalità di scansione e riutilizzare il protocollo sperimentale 2P GFP 930 ablazione. Assicurarsi che il foro stenopeico è aperto tutta la strada. Nota: La configurazione deve essere ottimizzato basato sui singoli sistemi.</li>
		<li>Avviare la modalità Live per individuare l'area di interesse (ROI) e ottimizzare le impostazioni per ottenere immagini di buona qualità con lo zoom appropriato. Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di trovare il neurone/assone/dendrite di ferire, invece di prendere la migliore immagine di qualità. Di conseguenza, è possibile utilizzare le impostazioni minime sufficienti per visualizzare l'area di destinazione, al fine di evitare la sovraesposizione o photobleaching.</li>
		<li>Arrestare Live scansione, in modo che il pulsante Ritaglia diventerà disponibile. Lasciare che l'immagine ancora servire come la tabella di marcia. Selezionare la funzione di ritaglio e adattare la finestra di scansione a concentrarsi sul bersaglio per essere ferito.</li>
		<li>Ridurre il ROI per essere la dimensione del futuro sito della ferita. Ad esempio, basta coprire la larghezza di un assone o un dendrite, per garantire la precisione della ferita e ridurre i danni ai tessuti vicini. Se lo si desidera, zoomare sul ROI prima del taglio, permettendo per la ferita più precisa.</li>
		<li>Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Determinano l'aumento nell'intensità del laser basato sul segnale di fluorescenza del tessuto scansionato in modalità Live .</li>
		<li>In genere, impostare l'intensità del due-fotone laser a partire da 25% per le lesioni PNS e 50-100% per le lesioni VNC. Per la ferita di assone PNS, garantire che l'intensità del laser è ~ 480 mW e pixel tempo di sosta è 8,19 μs. Per la ferita dell'assone VNC, assicurarsi che il tempo di permanenza di intensità e pixel laser sono solitamente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs, rispettivamente.</li>
		<li>Avviare la scansione continua . Lasciare il cursore mouse sopra il pulsante continua . Tenere d'occhio sull'immagine e interrompere la scansione, non appena si osserva un aumento drastico in fluorescenza. Nota: L'aspetto del picco di fluorescenza è dovuta auto-fluorescenza al sito di lesione.</li>
		<li>Passare alla modalità "Live" riutilizzando le impostazioni. Trovare la regione di interesse che è stato mirato solo regolando la messa a fuoco. Nota: Una buona indicazione della ferita di successo è l'aspetto di un piccolo cratere, struttura anulare o detriti localizzato proprio al sito di lesione.</li>
		<li>Spostare il neurone successivo e ripetere dal punto 3.3.5, a danneggiare i neuroni multipli in un singolo animale. O ripetere il punto 3.3.5 mentre gradualmente aumentando la potenza e/o riducendo la velocità di scansione se la lesione iniziale era insufficiente. Nota: Nel caso in cui la potenza del laser è troppo alta, una grande area danneggiata sarà visibile nell'immagine post-ferita scan in tempo reale. Troppo ferita può causare la morte della larva.</li>
		<li>Recuperare la larva con attenzione rimuovere il vetrino coprioggetto e trasferendo la larva ferita su una piastra di nuova con la pasta di lievito. Fosso diverse grotte sulla piastra di agar con il forcipe; in alternativa, è possibile rendere un'isola di agar in lastra invece di utilizzare tutta la piastra, per ridurre la possibilità della larva strisciando fuori la piastra.</li>
		<li>Mettere la piastra in una capsula di Petri 60mm con tessuto umido (imbevuto con soluzione di acido propionico del 0,5%) e la cultura a temperatura ambiente o 25° C. Nota: La larva rimarrà allo stadio larvale per circa un giorno extra a temperatura ambiente (22° C) rispetto ai 25° c.</li>
	</ol></li>
	<li>Formazione immagine confocal di alberino-ferita<ol>
<li>Immagine la larva ferita a intervalli di tempo desiderato preparando la larva utilizzando la stessa procedura di anestesia e montaggio come in passo 3.2, quindi delle immagini con il laser confocale. Nota: Immagine della larva a 24 h dopo la lesione (AI) per confermare la ferita axonal e a 48 h AI (neuroni da classe IV) o 72 h AI (neuroni da di classe III) per valutare la rigenerazione.</li>
		<li>Individuare la larva utilizzando l'obiettivo 10x, quindi passa a un 25x (0,8 NA) obiettivo. Riutilizzare il protocollo sperimentale GFP Imaging.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Live e trovare il neurone stesso ferito in precedenza.</li>
		<li>Impostare le posizioni di Z prime e l'ultima nella finestra di scan in tempo reale. Premere il tasto stop e fare clic su Start sperimentare per acquisire un'immagine dello stack Z. Nota: Assicurarsi che un punto di normalizzazione (il punto di convergenza di assone) è incluso quando si acquisiscono immagini in modo che la quantificazione di rigenerazione è possibile (Figura 1, 1F) – questo è discusso ulteriormente nella sezione di analisi di dati.</li>
		<li>Passare all'Elaborazione di immagine, selezionare l'immagine appena scattata e generare una proiezione di massima intensità. Salvare il z-stack e l'intensità massima proiezione immagini.</li>
	</ol></li>
</ol>4. analisi dei dati
<ol><li>Elaborare e quantificare le immagini utilizzando il software di imaging o ImageJ.</li>
	<li>Quantificazione di rigenerazione assonale nel PNS<ol>
<li>Calcolare la percentuale di rigenerazione, che si riferisce alla percentuale di rigenerante assoni tra tutti gli assoni che sono stati lesi. Punteggio ottenuto un assone come rigenerante, purché essa ricresce oltre il sito di lesione.</li>
		<li>Misura lunghezza di rigenerazione, che è l'aumento della lunghezza dell'assone. Se quantificare con ImageJ, utilizzare lo strumento Linea segmentata per tracciare l'assone rigenerata e utilizzare misura nel menu a discesa analizza per ottenere la lunghezza della linea che rappresenta l'assone rigenerata.</li>
		<li>Calcolare l' Indice di rigenerazione, che è l'aumento della lunghezza dell'assone normalizzato. Nota: La lunghezza dell'assone è normalizzato dalla distanza tra il corpo cellulare e l'assone convergenti punto (DCAC) – assone lunghezza/DCAC (Figura 1 e 1F). Questo valore consente di account per qualsiasi crescita assonale che è a causa di ridimensionamento larvale. Un valore positivo rappresenta la rigenerazione, un valore pari a 0 non significa nessuna rigenerazione e un valore negativo significa ritrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione di rigenerazione dendrite<ol>
<li>Calcolare la percentuale di rigenerazione, che è la percentuale di neuroni da tra tutti quelli reciso che mostrano dendrite evidente ricrescita. Nota: Dendrite ricrescita è segnato come positivi se nuovi dendriti ricrescono fuori dallo stelo retratto dendritico e oltre il sito di lesione. Il sito di lesione è determinato da punti di riferimento e in alcuni casi, è facilmente visibile a causa il autofluorescence indotto da lesione residuo.</li>
		<li>Calcolare l' aumento dei punti di ramo, che conta l'aggiunta di nuovi punti di ramo dendritico dopo la ferita.</li>
		<li>Calcolare l' aumento della lunghezza totale dendrite, che è la lunghezza cumulativa di tutti i nuovi dendriti aggiunto dopo la ferita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione di rigenerazione assonale nel SNC Nota: Se un sito di lesione mostra degenerazione nel primo punto di tempo imaged (Figura 3B), potranno essere inclusi nell'analisi della lunghezza di rigenerazione e.<ol>
<li>Misura lunghezza di rigenerazione, che è la lunghezza dell'assone ricresciuto. Nota: L'assone ricresciuto di un sito di singola lesione è identificato come proviene fuori del percorso di axon originale prima della lesione.</li>
		<li>Calcola la lunghezza di rigenerazione normalizzato, che normalizza la lunghezza di rigenerazione per la lunghezza del segmento commessura - la distanza longitudinale tra commissure ("Y" in Figura 3A e 3B). Nota: Questo valore aiuta a correggere l'effetto delle differenze di dimensione larvale.</li>
		<li>Calcolare il tasso di rigenerazione, che è la percentuale di rigenerante segmenti tra tutti i segmenti che sono stati lesi, in modo da riflettere la capacità di rigenerazione di un particolare genotipo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando attraversa la configurazione di volo, il numero di femmine e maschi utilizzati può variare a seconda dei genotipi e il numero di larve necessarie per gli esperimenti specifici. Per le mosche WT, tipica croce utilizza 10 femmine e 5 maschi. La finestra di raccolta può essere ristretta, a seconda della precisione dell'età larve. Ad esempio, un periodo di 2 h raccolta produrrà le larve di una popolazione più omogenea. In questo caso, utilizzando 20 o più vergine femmine per impostare le croci aiuterà a produrre uova ...

L'incapacità degli assoni di rigenerarsi dopo una lesione al sistema nervoso centrale (CNS), può portare a disabilità permanenti nei pazienti e svolge anche un ruolo nei deficit neurologici irreversibili in neurodegenerative malattie1,2 ,3,4,5. L'ambiente del CNS, come pure la capacità intrinseche di crescita dei neuroni, determina se gli assoni sono in grado di rigenerare dopo il trauma. Fattori extracellulari da oligodendrociti, astroglial e fibroblastici fonti sono stati indicati per impedire la crescita neuronale4,6,7,8, ma l'eliminazione di queste molecole consente solo limitata5di germogliatura. Segnali di rigenerazione intrinseca possono influenzare il successo rigenerativa5,9 e rappresentano potenziali bersagli terapeutici, ma questi processi sono ancora non ben definiti a livello molecolare. Aumenti in fattore trofico segnalazione o eliminazione dei freni endogeni, quali la fosfatasi Pten10, possono causare la rigenerazione assonale in determinate circostanze. Combinazioni di diversi metodi trovati per essere singolarmente efficace forniscono anche solo limitato recupero complessivo ad oggi11,12,13,14. Di conseguenza, c'è un disperato bisogno per identificare ulteriori vie per la terapia mirata. Oltre l'inizio della ricrescita dell'assone, se e come gli assoni ricollegherai alla destinazione corretta, specificità di sinapsi di riforma e realizzare il recupero funzionale sono importanti domande senza risposta.
In sintesi, comprensione corrente del macchinario dettando la rigenerazione dell'assone è ancora molto frammentaria. Parte del problema è la difficoltà tecnica di studiare assone rigenerazione nei mammiferi in tempo reale, un approccio che è costosa, richiede tempo e stimolante per lo svolgimento di schermi genetici su larga scala. Drosophila melanogaster, d'altra parte, ha dimostrato di essere un sistema eccezionalmente potente per lo studio delle complesse questioni biologiche. Moscerino della frutta è stato determinante nella definizione di geni e vie che sono straordinariamente conservate negli esseri umani di segnalazione ed è stato un modello di successo per lo studio delle condizioni umane, come le malattie neurodegenerative, attraverso gli strumenti di genetica molecolare vasto disponibili per manipolare gene funzione15. In particolare, sono considerate uno strumento ideale per la scoperta di geni coinvolti in lesioni neurali e ricrescita15,16mosche della frutta. Sono stati sviluppati diversi modelli di lesioni neurali volare, compreso adulto-testa o nervo ventrali larvale cavo (VNC) lancinante con aghi, larvale VNC o schiacciamento del nervo con forcipe, neurone larvale laser assotomia, rimozione di neuroni recettori olfattivi, espianti trauma cranico, e la lesione del nervo periferico di ala severance15,17,18,19,20,21,22,23. Eccitante, recente lavoro che utilizzano modelli di lesione Drosophila hanno avanzato la nostra comprensione delle vie cellulari e genetiche utilizzati dal sistema nervoso per rispondere alle lesioni neurali, alcuni dei quali sono stati indicati per essere conservata nei mammiferi24 ,25. Ancora una volta, questo sottolinea l'utilità di questo organismo di modello per identificazione di nuovi meccanismi di riparazione neurale.
Un modello del due-fotone basato su laser Drosophila larvale neurone sensoriale lesioni è descritto qui. Un laser del due-fotone fu usato per tagliare gli assoni in zebrafish in vivo nel 200326. Nello stesso anno, il primo laser dendriotomy è stato effettuato in Drosophila utilizzando un laser pulsato azoto27. Poco dopo, diversi laboratori di c. elegans utilizzato con laser a femtosecondi per stabilire modelli di assone rigenerazione28. Nel 2007, Wu e colleghi rispetto e segnalato le differenze fra le lesioni laser in c. elegans indotte da vari tipi di laser29. Nel 2010, la rigenerazione assonale dopo lesione assonale laser era primo indicata per accadere in Drosophila30. Sulla base di questa letteratura di lesioni ampie laser, abbiamo sviluppato un modello di lesioni neurali volare utilizzando il laser del due-fotone, che permette la precisa induzione della lesione per siti mirati con minima perturbazione della vicina tessuti, fornendo un ambiente relativamente pulito sistema per lo studio di entrambe le proprietà intrinseche ed estrinseche della neurorigenerazione con cella singola ad alta risoluzione. In particolare, abbiamo stabilito un insieme di metodi di pregiudizio per i neuroni sensoriali arborization dentritico (da) in entrambi sistema nervoso periferico (PNS) e sistema nervoso centrale. Da neuroni possono essere raggruppati in quattro distinte classi distingue principalmente per la loro complessità ramificazione dendrite: classe I a IV31. Nostro lavoro pubblicato dimostra che da rigenerazione di neurone assomiglia a modelli di lesione dei mammiferi a livello molecolare e fenotipico: neuroni da visualizzare le proprietà di rigenerazione specifico di classe, con la classe IV ma non di classe I o neuroni da III che esibiscono rigenerazione nella PNS; assoni di neuroni di classe IV da rigenerano robustamente nella periferia, ma il loro potenziale rigenerativo è drasticamente ridotto nel SNC, così simile a neuroni gangliari (DRG) radice dorsale nei mammiferi; migliorante l'attività di mTOR tramite Pten eliminazione o iperespressione di Akt migliora la rigenerazione assonale nel moscerino della CNS19. Utilizzando questo modello di ferita, ci hanno suonato schermi genetici e hanno identificato l'enzima di elaborazione del RNA Rtca come fattore inibitorio evolutivamente conservato per rigenerazione dell'assone, che collega ferita dell'assone di stress cellulare e modifica di RNA20 .
Nel paradigma presentato, il pregiudizio è indotta tramite laser assotomia/dendriotomy di larvale classe IV o III da neuroni, etichettati da ppk-CD4-tdGFP o 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, rispettivamente. La ferita viene eseguita su 2nd a 3rd instar larve a circa 48-72 h dopo (h AEL) la deposizione delle uova. PNS assotomia la lesione è destinato alla sezione dell'assone ~ 20-50 µm lontano dal corpo cellulare, per CNS assotomia ad un'area di ~ 20 µm di diametro allo svincolo commissura in VNC e per dendriotomy ai punti di ramo dendritico primario. Il neurone stesso è imaged a 8-24 h dopo la lesione (AI) per confermare il transection completo e a 48-72 h per valutare la rigenerazione. Attraverso la formazione immagine confocal time-lapse, degenerazione e rigenerazione degli assoni/dendriti individuali che sono stati feriti in vivo possono essere monitorati nel tempo.

<table><tbody><tr><td>Etere dietilico, reagente ACS, acros organics anidro</td><td>AC615080010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>olio di alocarburi 27</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), concentrato 20x, pH 7,5, fornitore # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar in polvere, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>Succo d'uva</td><td>Welch' s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 95% (Reagente Alcol 95%)</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acido propionico</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>Copri occhiali: Rettangoli</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm X 22 mm</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 microscopio a scansione laser</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Zen</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di ferita drosophila in vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

La capacità di ricrescita di neuroni danneggiati governa neurorigenerazione ed il recupero funzionale dopo trauma del sistema nervoso. Negli ultimi decenni, sono stati identificati diversi fattori inibitori intrinseche ed estrinseche coinvolti nella restrizione di rigenerazione dell'assone. Tuttavia, semplicemente rimuovendo questi spunti inibitori è insufficiente per successo di rigenerazione, che indica l'esistenza di ulteriori normative macchine. Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, condivide evolutivamente conservati geni e vie di segnalazione con vertebrati, compreso gli esseri umani. Combinando la casella degli strumenti genetico potente di mosche con due fotoni laser assotomia/dendriotomy, descriviamo qui il neurone sensoriale di Drosophila – modello di lesione del neurone arborization dentritico (da) come una piattaforma per lo screening sistematico per il romanzo regolatori di rigenerazione. Brevemente, questo paradigma include un) la preparazione di larve, induzione b) lesione di dendrite(s) o axon(s) utilizzando un laser del due-fotone, c) dal vivo confocale imaging post-infortunio e d) analisi dei dati. Il nostro modello consente altamente riproducibile lesioni di singoli neuroni con etichettati, assoni e dendriti dei sottotipi neuronali ben definiti, nel sistema nervoso centrale e periferico.

Neuroni da mostrano il differenziale rigenerazione potenziale tra la periferica e del sistema nervoso centrale, come pure la specificità di classe. Questo offre l'opportunità unica di screen per nuovi fattori che sono necessari per la rigenerazione dell'assone (utilizzando la classe lesioni IV PNS), come pure quelli che sono inibitori per la rigenerazione (con lesioni snc di IV classe e classe lesione III PNS).
Rigenerazione assona...

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando la drosofila neurone sensoriale - modello di lesione del neurone arborization dentritico (da), che combina in vivo live imaging, due fotoni laser assotomia/dendriotomy e il potente toolbox di volare genetica, come una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione.

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

L'obiettivo generale di questo modello di lesione del neurone sensoriale larvale di Drosophila è quello di combinare l'imaging dal vivo in vivo, l'assotomia/dendriotomia laser a due fotoni e il potente toolbox genetico del moscerino in una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione. Questo metodo aiuterà ad affrontare le questioni chiave in un campo della neurogenerazione, ad esempio identificando nuovi regolatori intrinseci ed estrinseci per la neurogenerazione, sia in un sistema nervoso periferico che centrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i nuovi candidati per la neurorigenerazione possono essere esaminati in modo facile, veloce ed economico.Sebbene questo sistema possa fornire informazioni sulla neurorigenerazione, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le malattie neurodegenerative e le interazioni neurone-glia. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché diverse configurazioni sperimentali che utilizzano diversi tipi di neuroni vengono utilizzate per modellare la rigenerazione degli assoni rispetto a quella dendritica. Per la raccolta delle larve, preparare le

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Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

Questo video descrive l'ablazione laser a due fotoni degli assoni in una larva di Drosophila melanogaster e un protocollo di esempio per indurre lesioni e visualizzare il sito della lesione.

Lesione neurale indotta da laser a due fotoni: un metodo per osservare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni nelle larve di Drosophila

Questo video mostra un metodo per indurre un danno neuronale mirato nelle larve di Drosophila utilizzando un laser ad alta potenza. Dopo aver posizionato la larva al microscopio, un laser a bassa potenza esegue la scansione dei neuroni fluorescenti, quindi la potenza del laser viene aumentata per indurre un danno localizzato. La lesione è confermata da un aumento della fluorescenza e da un cratere nel sito della lesione.

Induzione di una lesione neuronale mirata utilizzando un laser ad alta potenza in una larva di Drosophila

Questo video dimostra l'induzione di una lesione cerebrale traumatica penetrante nel cervello della drosofila. I moscerini appena emersi vengono selezionati, anestetizzati e posizionati sotto uno stereomicroscopio dotato di fluorescenza. Viene identificato il corpo del fungo che esprime GFP e viene inserito un perno Minutien per causare lesioni. Le mosche sono autorizzate a riprendersi per ulteriori studi.

Induzione di lesioni cerebrali traumatiche penetranti nelle mosche adulte di Drosophila

Un paradigma danno usando il cavo larvale nervoso ventrale Drosophila per studiare la rigenerazione del sistema nervoso centrale e la riparazione è descritto. Stabbing seguito da scansione laser microscopia confocale in time-lapse e fissi campioni, combinata con l'analisi quantitativa con software volutamente sviluppato e genetica, sono utilizzati per studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione e riparazione del SNC.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila larve sono un sistema modello attraente per l'imaging dal vivo a causa della loro cuticola trasparente e potenti genetica. Questo protocollo descrive come utilizzare un dispositivo PDMS singolo strato, chiamato il 'chip di larva' per l'imaging dal vivo di processi cellulari all'interno dei neuroni di 3 ° instar larve di Drosophila.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Qui descriviamo un metodo semplice e ampiamente accessibile per danneggiare i nervi segmentali nelle larve Drosophila per visualizzare e quantificare la neurodegenerazione dei neuroni motori alla giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di terzo istar.

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Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

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Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

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Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

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Questo articolo fornisce protocolli dettagliati per infliggere lesioni cerebrali traumatiche penetranti (PTBI) a Drosophila adulta ed esaminare la neurogenesi risultante.

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Scopri un modello di ferita neuronale in Drosophila con imaging in vivo e laser a due fotoni per screening di neuro-rigenerazione. Questo metodo permette di identificare promotori e inibitori nel sistema nervoso periferico e centrale.

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