Name: Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri l'editing genico cardiaco in vivo nei topi usando virus adeno-associato ricombinante e CRISPR per ripristinare l'espressione della distrofina. Questo metodo offre una strategia terapeutica promettente per la cardiomiopatia distrofica.

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Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati mantenuti a The Ohio State University laboratorio le risorse animali conformemente alle linee guida sull'uso degli animali. Tutti gli studi sugli animali sono stati autorizzati dal istituzionale Animal Care, uso e Comitato di revisione della Ohio State University.
1. progettazione e clonazione del gRNAs nel vettore CRISPR
<ol><li>Selezionare 2 gRNAs targeting distrofina introne 20 e introne 23 (i20 e i23) per SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT e i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (la sequenza di PAM è sottolineata e corsivo). Nota: I siti di destinazione per i20 e i23 sono circa 23 kg coppia di basi (kbp) distanza. Per interrompere un gene che codifica, due gRNAs targeting degli esoni comuni con il PAM NNGRRT sequenza per SaCas9 (preferibilmente NNGAAT, NNGGGT e NNGAGT) e distanza all'interno di 20 kbp sono raccomandati.</li>
	<li>Utilizzare i seguenti parametri PCR per temprare il gRNA oligos (100 µmol/L) in 1x tampone di ricottura (5 x ricottura scorte regolatrici contiene 0,5 mol/L K-acetato, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetato, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cicli di 95-59 ° C con un 0,4 ° C diminuire al ciclo per 20 s, 90 cicli di 59 a 32 ° C con una diminuzione di 0,3 ° C per ciclo per 20 s, 20 cicli di 32 a 26 ° C con una diminuzione di 0,3 ° C per ciclo per 20 s.</li>
	<li>Legare i oligos gRNA ricotto nella pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA utilizzando BsaI e T4 DNA ligasi in uno reazione (1 µ l 50 ng / µ l pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, i oligos 1 µ l ricotto, buffer di 1,5 µ l 10 x T4 DNA ligasi, 0,5 µ l T4 DNA ligasi, 1 µ l BsaI, 10 µ l ddH2O ), con la seguente condizione di reazione in un cycler PCR: 5 cicli di [37 ° C 5 min e 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.</li>
	<li>Trasformare il prodotto di legatura di 15 µ l in cellule competenti di 30 µ l, piatto le cellule nella piastra di agar con 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C per 24 h.</li>
	<li>Prendere 5-10 colonie e cultura in LB medium contenente ampicillina 100 µ g/mL a 37 ° C, 250 giri/min in un incubatore agitatore per 3-4 h.</li>
	<li>Le colonie di PCR a schermo: 10 µ l 2 x mix master PCR, 8 µ l ddH2O, cultura di e. Coli 1 µ l, primer di 10 µmol/L U6-forward 1 µ l, 1 µ l i20 o i23 gRNA reverse primer. I parametri di ciclismo di PCR: 95 ° C 5 min, 35 cicli di 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.</li>
	<li>Preparare 5 mL coltura dei cloni positivi aggiungendo 4 mL fresco LB Media containing100 µ g/mL ampicillina e cultura durante la notte a 37 ° C, 250 giri/min.</li>
	<li>Purificare il plasmide DNA utilizzando il kit di estrazione del plasmide appropriato e verificare il plasmide di Sanger sequenziamento con il primer di U6-forward.</li>
	<li>Coltura di cellule C2C12 in DMEM completati con 10% FBS e 1% penna-Strep fino a raggiungere la confluenza di ~ 70% per le prove del gene efficacia dei plasmidi di editing.</li>
	<li>Electroporate un totale di 5 µ g SaCas9/gRNA miscela di plasmide in rapporto molare 1:1 in 1 x 106 C2C12 cellule secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Dopo la post-trasfezione 48h raccolto le cellule C2C12 ed estrarre il DNA genomico.</li>
	<li>Uso 100 ng DNA genomico come modello per eseguire la reazione di PCR per locus distrofina del mouse: forward primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ l 10 µmol/L), reverse primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ l 10 µmol/L), 10 µ l 2 x il verde PCR master mix, 7 µ l ddH2O, (DNA genomico di 1 µ l 100 ng). Utilizzare la PCR ciclismo condizioni come 95 ° C 5 min, 35 cicli di [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.</li>
</ol>2. rAAV produzione
<ol><li>Per la coltura delle cellule, le cellule di AD293 sui 20-40 di 15 cm piatti del seme e mantenere in DMEM completati con 10% FBS e 1% penna-Strep fino a raggiungere la confluenza di ~ 90% per la transfezione.</li>
	<li>Diluire 3 plasmidi con 200 µ l ridotto medio del siero (per ogni piatto): 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 o altri sierotipi) e 3) un totale di 5 µ g di miscela pX601-i20 e pX601-i23 (rapporto 1:1). Eseguire polyethylenimine (PEI) transfezione mescolando con 80 µ l PEI e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungi la miscela su colture cellulari AD293 in modo goccia a goccia.</li>
	<li>Per la produzione di virus AAV, dopo la trasfezione di 72 h post, usate un raschietto di cella per raccogliere sia i media e il pellet di cellule AD293 mediante centrifugazione a 1100 x g per 10 minuti.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi rAAV 15 mL (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5) seguito da 3 cicli di gelo-disgelo con alternanza di incubazione in azoto liquido e bagnomaria a 42 ° C. Memorizzare i lisati cellulari a-80 ° C per l'elaborazione di futuri se non vengono elaborati immediatamente.</li>
	<li>Filtrare i terreni di coltura con un filtro da 0,45 µm e aggiungere un 40% PEG8000 2,5 mol/L NaCl a una concentrazione finale di 8%. Incubare la miscela a 4 ° C per 1 h e centrifugare a 1100 x g per 15 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet in tampone di lisi rAAV e si combinano con i lisati cellulari dal punto 2.3, seguita da trattamento benzonase (50 U/mL) a 37 ° C per 1 h.</li>
	<li>Centrifugare il rAAV benzonase-trattati contenente miscela 1100 x g per 15 min a 4 ° C e salvare il surnatante (la preparazione rAAV grezzo).</li>
</ol>3. rAAV purificazione e concentrazione
<ol><li>Caricare la preparazione rAAV grezzo su una pendenza di iodixanol in un tubo di ultracentrifuga nel seguente ordine dall'alto verso il basso: greggio AAV lisato (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5ml 40% Iodixanol, 5ml 58% Iodixanol. Riempire il restante volume vuoto del tubo verso l'alto utilizzando 1 x DPBS.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 230.000 x g in un rotore ultracentrifuga per 120 min a 10 ° C e raccogliere 3-4 mL della frazione gradiente 40% contenenti le particelle rAAV con un ago da 18 G.</li>
	<li>Diluire le particelle rAAV con 1 x DPBS e centrifuga utilizzando l'unità filtro centrifugo (MWCO 100 kDa). Ripetere questo passaggio per 3 - 5 volte e finalmente concentrarsi la preparazione rAAV a 300-500 µ l.</li>
</ol>4. rAAV titolazione
<ol><li>Estrarre il DNA genomico da 2 µ l concentrato rAAV, precipitato con 3 M NaOAc in etanolo e risospendere in 20 µ l ddH2O.</li>
	<li>Per ottenere la curva standard per la quantificazione rAAV diluizione seriale del plasmide pX601: 1 x 109, 1x108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 copie in ogni 10 µ l ddH2O. Diluire il rAAV dnaasi-trattati campioni come 01:10, 01:50, 1: 100 e 1: 1000.</li>
	<li>Determinare il titolo rAAV, mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), utilizzando qPCR Kit seguendo le istruzioni del produttore in un sistema Real-Time PCR: 1 µ l 10 µmol/L di ciascun primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC e 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ l 2 x mix master di PCR, 1 µ l diluito rAAV campioni e 2 µ l ddH2O. eseguire la reazione con i seguenti parametri in bicicletta: 95 ° C 3 min, 45 cicli di [95 ° C 5 sec e 61 ° C 20 sec].</li>
</ol>5. endovenoso e l'iniezione intraperitoneale di rAAVrh.74-CRISPR in neonatale mdx/utrofina+ /- topi
<ol><li>Immobilizzare il mdx/utrofina+ /- cuccioli di topo (giorno 3) inserendo il ghiaccio per 1 min e quindi amministrare con 1 x 1012 particelle virali in 50 µ l per topo sistematicamente tramite un approccio retro-orbitale o un'iniezione intraperitoneale.</li>
	<li>Consentire i topi recuperare e rimettere nella loro casa gabbie. A dieci settimane dopo amministrazione di rAAV, eutanasia i topi di CO2 esposizione per la raccolta del tessuto.</li>
	<li>Snap-congelare tessuti per estrazione di DNA e RNA genomico e uso raffreddamento isopentano in azoto liquido per congelare i tessuti con temperatura ottimale di taglio composto per il criosezionamento.</li>
</ol>6. l'analisi del Gene Target risultati di Editing
<ol><li>
Analisi di PCR del DNA genomic
	<ol>
<li>Isolare il DNA genomico da tessuti del cuore dei topi mdx/utrofina+ /- trattato con o senza rAAV totale.</li>
		<li>Utilizzare lo stesso protocollo in 1.12 passo per l'analisi di PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di RT-PCR dell'espressione di distrofina
	<ol>
<li>Estrarre RNA totale da tessuti del cuore con il kit di estrazione di RNA seguendo il manuale del produttore.</li>
		<li>Per eseguire la trascrizione inversa, pre-trattare il RNA totale con una dnasi RNAsi-libera e utilizzare 5 µ g di RNA trattato come il modello per la sintesi del cDNA del primo-filo con il kit di trascrizione inversa.</li>
		<li>Utilizzare il prodotto di trascrizione d'inversione per l'analisi di RT-PCR dell'espressione di distrofina con gli iniettori di cDNA di distrofina: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT e 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimare il gene editing efficacia da analisi qPCR
	<ol>
<li>Stimare il gene editing efficacia mediante RT-PCR quantitativa per rilevare la riduzione delle trascrizioni di esone contenente 22 utilizzando il primer forward (esone 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA e il primer reverse (esone 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Utilizzare Gapdh come un gene di riferimento con il primer forward: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC e il reverse primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), utilizzando la qPCR Kit seguendo le istruzioni del produttore in un sistema Real-Time PCR e le condizioni di reazione di 2-step: 95 ° C 3 min, 45 cicli di 95 ° C 5 sec e 61 ° C 30 sec.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunofluorescenza che macchia per analizzare l'espressione di distrofina
	<ol>
<li>Tagliare i tessuti congelati utilizzando un criostato ad uno spessore di 10 µm. Fix le sezioni congelate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Lavare 2 volte con PBS e incubare con blocco soluzione (10% di siero equino) per 1 h.</li>
		<li>Incubare l'anticorpo primario anti-distrofina, a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Lavare i vetrini con PBS 3 x 5 min e incubare con anticorpi secondari fluorescenti (1: 500) a temperatura ambiente per 1 h.</li>
		<li>Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio con DAPI e imaging con un microscopio confocale invertito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. off-target analisi dall'analisi di T7E1
<ol><li>Prevedere i potenziali siti di fuori bersaglio utilizzando il CRISPR online strumenti di progettazione come < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>Amplificare le regioni genomiche che copre la parte superiore 5-10 siti potenziali di fuori bersaglio mediante PCR: genomic DNA 200 ng, 1 µ l ad alta fedeltà della polimerasi di DNA, 5 µ l 10X PCR Buffer mix, 1,5 µ l 10 µmol/L di site-specific primers forward e reverse, regolazione del volume totale di 50 µ l con ddH2O.</li>
	<li>Eseguire i prodotti PCR mediante elettroforesi, estrarre e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel. Misurare la concentrazione utilizzando spettrofotometri.</li>
	<li>Promuovere la formazione di denaturazione e ri-ricottura gli ampliconi purificati lentamente nella 2.1 Buffer utilizzando un cycler PCR. Utilizzare le stesse condizioni di ciclismo come descritto al punto 1.2.</li>
	<li>I prodotti ri-Ricotti per 30 min a 37 ° C con enzima di T7E1 0,5 µ l di digerire e analizzare la reazione l'elettroforesi del gel dell'agarosi 1-2%. Nota: Gli ampliconi possono essere analizzati anche da sequenziamento profondo mirato.</li>
</ol>

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<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi esiste.

In questo protocollo, abbiamo dettaglio tutti i passi necessari per raggiungere in vivo gene cardiaco modifica in topi postnatali utilizza il recapito rAAVrh.74-mediata di SaCas9 e due gRNAs. Come precedentemente osservato, questo approccio può essere utilizzato per ripristinare l'espressione di distrofina in topi distrofici come descritto nel nostro lavoro27, ma potrebbero anche permettere gli studi di genetica inversa rapida dei geni legati al cardiaco in topi senza il lungo processo de...

Il cluster, regolarmente intercapedine, breve palindromi ripetere (CRISPR) tecnologia rappresenta il più recente avanzamento in ingegneria del genoma e ha rivoluzionato la pratica corrente della genetica in cellule e degli organismi. Editing basato su CRISPR genomico utilizza una sola guida RNA (gRNA) per dirigere un'endonucleasi associata CRISPR come CRISPR-associated protein 9 (Cas9) e Cpf1 ad un target di DNA genomico che è complementare in sequenza la protospacer codificati da gRNA con un protospacer specifici motivi adiacenti (PAM)1,2. Il PAM varia a seconda della specie batterica del gene Cas9 o Cpf1. Il più comunemente usata nucleasi Cas9 derivata da Streptococcus pyogenes (SpCas9) riconosce una sequenza di PAM di NGG che si trova direttamente a valle della sequenza dell'obiettivo nel DNA genomico, sul filo del non-bersaglio. Presso il sito di destinazione, le proteine Cas9 e Cpf1 generano una rotture a doppio filamento (DSB), che sono poi ripristinata via intrinseci meccanismi di riparazione del DNA cellulari tra cui unirsi non-omologo fine (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR) vie3, 4. In assenza di un modello di DNA per ricombinazione omologa, il DSB è principalmente riparato da pathway NHEJ errori, che possono provocare gli inserimenti o eliminazioni (indels) di nucleotidi causando mutazioni frameshift, se l'organo di conciliazione sono stato creato nella codificazione regione di un gene5,6. Così, il sistema CRISPR è stato ampiamente utilizzato per progettare le mutazioni di perdita-de-funzione in vari modelli cellulari e interi organismi, al fine di studiare la funzione di un gene. Inoltre, il cataliticamente inattivo Cas9 e Cpf1 sono stati sviluppati per trascrizionalmente ed epigeneticamente modulare l'espressione di geni bersaglio7,8.
Più recentemente, sia SpCas9 e SaCas9 (derivato da Staphylococcus aureus) sono stati imballati in vettori ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) per la correzione genica postnatale nel modello animale di malattie umane, in particolare, Duchenne distrofia muscolare (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD è una malattia recessiva legata al X fatale causata da mutazioni nel gene DMD , che codifica per la proteina distrofina16,17, che interessa circa uno in 3500 nati maschi secondo screening neonatale18 , 19. è caratterizzata da debolezza muscolare progressiva e lo spreco. I pazienti DMD di solito perdono la capacità di camminare tra i 10 e i 12 anni di età e morire di insufficienza respiratoria e/o cardiaco all'età di 20-30 anni20. In particolare, la cardiomiopatia si sviluppa in > 90% dei pazienti DMD e rappresenta la principale causa di morte in pazienti DMD21,22. Anche se Deflazacort (un farmaco anti-infiammatorio) ed Eteplirsen (un esone che salta medicina per saltare essone 51) recentemente sono stati approvati per la DMD da Food and Drug Administration (FDA)23,24, nessuno di questi trattamenti correggere il difetto genetico a livello di DNA genomico. Il topo mdx, che trasporta una mutazione di punto all'esone 23 del gene della distrofina, è stato ampiamente usato come un DMD modello25. Inoltre, abbiamo in precedenza dimostrato che l'espressione di distrofina funzionale è stato restaurato da omissione in-struttura del DNA genomic che coprono gli essoni 21, 22 e 23 nella muscolatura scheletrica di topi mdx utilizzando intramuscolare annuncio-SpCas9/gRNA consegna9 e nei muscoli del cuore di topi mdx/utrofina+ /- mediante consegna di rAAVrh.74-SaCas9/gRNA endovenosa ed intraperitoneale26.
In questo protocollo, descriviamo in dettaglio ogni passo nel gene cardiaco postnatale di editing per ripristinare la distrofina in topi mdx/utrofina+ /- utilizzando rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vettori, dalla progettazione di gRNA alla distrofina analisi nelle sezioni del muscolo di cuore.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 capra anti-coniglio IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasi Nucleasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Armadi di sicurezza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Serie A2 Classe II, Tipo A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>Cellule competenti</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, 150 mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific MT10017CV</td><td></td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Anticorpo distrofina</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kit</td><td>IBI</td><td>Scientific IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro, 0,45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit di plasmidi ad alta velocità</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Bagno d'acqua</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Blocco termico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 strumento</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Strumento II</td></tr><tr><td>Centrifuga di grande capacità</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Spettrofotometri Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligo per i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos per i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligo per i23-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>Oligos for i23-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga a tenuta rapida</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit qPCR Hi-ROX verde SYBR radiante</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Kit di trascrizione inversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotore</td><td>Beckman Coulter Inc</td> 337922 <td>Tipo 70Ti</td>T4 <td></td></tr><tr><td>DNA ligasi</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Unità filtrante ultra centrifuga</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

adeno-associato virus-mediate consegna di crispr per gene cardiaco nei topi di editing

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Il sistema cluster, regolarmente intercapedine, breve, palindromico di ripetere (CRISPR) ha notevolmente facilitato ingegneria genoma in cellule coltivate e gli organismi viventi da una grande varietà di specie. La tecnologia CRISPR è stata esplorata anche come approcci terapeutici per un certo numero di malattie umane. Dati di prova sono molto incoraggianti, come esemplificato da studi recenti che dimostrano la fattibilità e l'efficacia di gene editing basato su approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) utilizzando un modello murino. In particolare, iniezione endovenosa ed intraperitoneale del rh.74 di sierotipo del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permesso la consegna efficiente cardiaca di Staphylococcus aureus CRISPR-collegata della proteina 9 (SaCas9) e due Guida RNAs (gRNA) per eliminare una regione genomica con un codone mutante nell'esone 23 del gene Dmd del mouse. Questo stesso approccio è utilizzabile anche per battere il gene di interesse e studiare la loro funzione cardiaca nei topi postnatali quando il gRNA è progettato per la regione di codificazione del gene. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio come ingegnere vector rAAVrh.74-CRISPR e come raggiungere altamente efficiente consegna cardiaca in topi neonatali.

L'efficacia di gRNAs per indurre l'eliminazione della regione di DNA genomica di destinazione dovrebbe essere valutata in colture di cellule prima del confezionamento in rAAV per studi in vivo. A tal fine, il gRNAs e il SaCas9 esprimenti costrutti erano individulamente in cellule C2C12 e il DNA genomico è stato analizzato mediante PCR con primers fiancheggianti i siti di destinazione (Figura 1). Un prodotto PCR di ~ 500 bp indica l'eliminazione di successo de...

Qui forniamo un protocollo dettagliato per effettuare in vivo gene cardiaco editing nei topi utilizzando Virus ricombinante Adeno-Associated (rAAV)-mediate consegna di CRISPR. Questo protocollo offre una strategia terapeutica di promessa per il trattamento di cardiomiopatia distrofica nella distrofia muscolare di Duchenne e può essere utilizzato per generare specifico knockout in topi postnatali.

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di editing genico cardiaco in vivo è ripristinare l'espressione della distrofina nel cuore di topi distrofici utilizzando il virus adeno-associato ricombinante rh. 74 con CRISPR SaCas9 e vettori di RNA guida. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della distrofia muscolare, ad esempio se l'editing genetico è una strategia terapeutica affidabile per trattare la causa principale della cardiomiopatia associata alla distrofia muscolare di Duchenne.Il vantaggio principale di queste tecniche è che l'espressione del gene della distrofina corretta è sotto il suo controllo regolatorio endogeno e questo effetto di salvataggio è permanente. L'implicazione di questa tecnica si estende al trattamento di altre malattie genetiche in cui la correzione del gene mutante può essere ottenuta con la tecnologia di editing genetico CRISPR Cas9. Questo metodo non solo fornisce informazioni sul ripristino della distrofina nel cuore distrofico, ma può anche essere utilizzato per eliminare il gene di interesse per studi genetici inversi.A dimostrare la procedura sarà Yandi Gao, un tecnico del nostro laboratorio. La corretta progettazione degli RNA guida, o gRNA, è fondamentale per il successo di questo protocollo. Selezionare due gRNA che hanno come bersaglio l'introne 20 e l'introne 23 della distrofina per la proteina nove associata a CRISPR di Staphylococcus aureus.La sequenza del motivo adiacente al protospaziatore per ciascun gRNA è sottolineata e in corsivo. Per ricuocere gli oligonucleotidi di gRNA, impostare una reazione contenente 100 micromoli per litro di oligonucleotidi di gRNA in 1x tampone di ricottura. Utilizzare i seguenti parametri PCR: 95 gradi Celsius per 10 minuti, 90 cicli da 95 a 59 gradi Celsius con una diminuzione di 0,4 gradi Celsius per ciclo per 20 secondi, 90 cicli da 59 a 32 gradi Celsius con una diminuzione di 0,3 gradi Celsius per ciclo per 20 secondi e 20 cicli da 32 a 26 gradi Celsius con una diminuzione di 0,3 gradi Celsius per ciclo per 20 secondi.Successivamente, preparati a legare gli oligonucleotidi gRNA ricotti nel vettore CRISP in un'unica reazione. Aggiungere quanto segue a un tubo: un microlitro di 50 nanogrammi per microlitro di vettore CRISPR, un microlitro di oligonucleotidi ricotti, 1,5 microlitri di tampone DNA ligasi 10x T4, 0,5 microlitri di DNA ligasi T4, un microlitro di Bsal e 10 microlitri di acqua distillata doppia. Eseguire la seguente reazione in un termociclatore: cinque cicli di 37 gradi Celsius per cinque minuti e 16 gradi Celsius per 10 minuti, 37 gradi Celsius per 20 minuti e 80 gradi Celsius per cinque minuti.Trasformare il prodotto di legatura da 15 microlitri in 30 microlitri di cellule competenti e placcare le cellule su una piastra di agar contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Cultura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno seguente, prelevare da cinque a 10 colonie dalla piastra di agar e coltivarle in terreno LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina a 37 gradi Celsius e 250 giri/min per tre o quattro ore.Per lo screening delle colonie mediante PCR, preparare reazioni che contengano ciascuna 10 microlitri di master mix PCR, otto microlitri di acqua a doppia distillazione, un microlitro di coltura di E.coli, un microlitro di primer U6-forward e un microlitro di primer inverso i20 o i23 gRNA. Utilizzare i seguenti parametri di ciclo PCR: 95 gradi Celsius per cinque minuti, seguiti da 35 cicli di 95 gradi Celsius per 30 secondi, 61 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 30 secondi. Una volta identificati i cloni positivi, preparare una coltura da cinque millilitri di ciascun clone positivo aggiungendo quattro millilitri di terreno LB fresco contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e coltivando a 37 gradi Celsius e 250 giri/min durante la notte.Il giorno seguente, purificare il DNA plasmidico utilizzando l'apposito kit di estrazione del plasmide. Il plasmide viene successivamente verificato mediante sequenziamento Sanger con il primer U6-forward. Per testare l'efficacia dell'editing genetico dei plasmidi, colture di cellule C2C12 in DMEM integrate con il 10% di FBS e l'1% di Pen-Strep fino a quando le cellule raggiungono circa il 70% di confluenza.Elettroporare un totale di cinque microgrammi di miscela plasmidico SaCas9/gRNA in rapporto molare uno a uno in cellule C2C12 secondo il protocollo del produttore. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere le cellule C2C12 ed estrarre il DNA genomico come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare il DNA genomico come modello per eseguire la PCR per il locus della distrofina di topo.Impostare le reazioni contenenti il primer diretto, il primer inverso, la miscela master PCR verde, l'acqua distillata doppia e 100 nanogrammi di DNA genomico. Utilizzare le stesse condizioni PCR utilizzate per lo screening dei cloni positivi. Prima di iniziare questa procedura, preparare il virus adeno-associato ricombinante, o rAAV, come descritto nel protocollo di testo.Somministrare ai cuccioli di topo mdx del terzo giorno particelle virali per via sistemica tramite un'iniezione intraperitoneale. Lascia che i topi si riprendano e rimettili nelle loro gabbie domestiche. A 10 settimane dalla somministrazione di rAAV, raccogliere i tessuti dai topi.Congelare i tessuti per l'estrazione genomica del DNA e dell'RNA e utilizzare l'isopentano raffreddato in azoto liquido per congelare i tessuti con un composto a temperatura di taglio ottimale per la criosezione. Iniziare il protocollo di colorazione in immunofluorescenza fissando le sezioni di tessuto congelate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo 15 minuti, lavare le sezioni di tessuto due volte con PBS.Incubare con soluzione bloccante a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, incubare con l'anticorpo primario anti-distrofina a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, lavare i vetrini con PBS, quindi incubare con anticorpi secondari fluorescenti a temperatura ambiente per un'ora.Montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio con DAPI e acquisire immagini con un microscopio confocale invertito. L'efficacia dei gRNA nell'indurre la delezione della regione del DNA genomico bersaglio nelle colture cellulari è stata valutata mediante PCR. Un prodotto della PCR di circa 500 paia di basi indica la delezione riuscita del DNA genomico bersaglio risultante dall'editing genetico, mentre le cellule di controllo non dovrebbero produrre una banda.Una volta che l'efficacia dei gRNA è stata confermata nelle colture cellulari, i gRNA vengono impacchettati in rAAV. Le particelle virali di rAAV vengono purificate e la purezza analizzata mediante SDS-PAGE. La presenza di sole tre bande corrispondenti alle tre proteine del capside indica un'elevata purezza.Queste immagini rappresentative in immunofluorescenza di sezioni cardiache di topi wild type, mdx e mdx trattati con AAV SaCas9 gRNA mostrano sistemicamente che AAV SaCas9 gRNA ripristina l'espressione della distrofina nei topi distrofici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere l'editing genetico cardiaco in vivo nei topi postnatali utilizzando rAAV rh. Rilascio mediato da 74 di SaCas9 e gRNA.

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In questo video, dimostriamo la consegna genica ricombinante basata su virus adeno associati nel cucciolo di topo. Questo metodo aiuta a studiare l'espressione genica nelle cellule bersaglio.

Consegna genica basata su virus associato ad adeno ricombinante: una tecnica per la consegna di transgeni e l'espressione cardiaca-specifica in un modello di roditore

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

In questo manoscritto, viene descritto un metodo per preparare vettori ricombinanti del virus adeno-associato 9 (rAAV9) per manipolare l'espressione genica nel cuore del topo.

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Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Per la comprensione della neoplasia è necessario lo sviluppo di modelli murini con geni specifici mutati nei pazienti affetti da cancro alla testa e al collo. Qui, presentiamo un protocollo per la trasformazione in vitro delle cellule primarie della lingua murina utilizzando un sistema adeno-associato al virus-Cas9 per generare linee cellulari MURine HNC con specifiche alterazioni genomiche.

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Generazione di topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema combinato di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato

Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l'elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell'embrione a 2 cellule.

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Questo rapporto descrive in dettaglio il metodo di iniezione localizzato dei vettori AAV attraverso la pelvi renale per un trasferimento genico efficace e sicuro nel rene di topo.

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