Name: Trasporto dellelettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri come monitorare il trasporto elettronico trans-membrana plasmatica in tempo reale utilizzando saggi spettrofotometrici su cellule C2C12. Questo metodo avanza la ricerca in biologia redox.

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Vorremmo ringraziare Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal premio United States Public Health Service R15DK102122 dall'Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali (NIDDK) a Jonathan Fisher. Il contenuto del manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale il NIDDK o il National Institutes of Health.

Nota: Vedere la Figura 1 per una descrizione schematica di passaggi chiave.
1. analisi di riduzione WST-1
<ol><li>Crescere e differenziare cellule aderenti C2C12 con cella standard cultura procedure7 in una piastra a 96 pozzetti utilizzando righe A-F.<ol>
<li>Usare un mezzo di differenziazione consistente dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 2% di siero equino, 100 U/mL di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.</li>
		<li>Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, supplemento media di differenziazione con l'acido ascorbico 100 µM. Consentire alle cellule di Incubare in media di differenziazione per ~ 24-48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzioni «stock» WST-1 e PMS.<ol>
<li>Per rendere uno stock di 10 mM di WST-1, sciogliere 0,033 g di WST-1 (Formula peso (FW): 651.34 g/mol) in 5 mL di fosfato tampone salino (PBS). Conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Per rendere una scorta di 5 mM di PMS, sciogliere 0,0023 g di PMS (FW: 306.34 g/mol) in 1,5 mL di deionizzata H2O (diH2O). Conservare a-20 ° C e proteggere dalla luce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungi 0,0108 g di glucosio per soluzione salina tamponata con una concentrazione finale di 5 mM a 11,4 mL di PBS o HEPES (HBS; sale di sodio di 20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM MgSO4, 1mm CaCl2). µ L 480 di 10mm WST-1 per una concentrazione finale di 400 µM e 48 µ l di 5mm PMS per una concentrazione finale di 20 µM.</li>
	<li>Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, aggiungere 6 µ l di diH2O e l'altra aliquota aggiungere 6 µ l di AO 2 kU/mL per una concentrazione finale di 2 U/mL.</li>
	<li>Durante il monitoraggio di coinvolgimento di superossido in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, 55 µ l di tampone di4 KPO 0.1 M e l'altra aliquota aggiungere 55 µ l di SOD 6.5 kU/mL per una concentrazione finale di 60 U/mL.</li>
	<li>Lavare le cellule con PBS. Aspirare i media e aggiungere 150 µ l PBS. Poi aspirare il PBS. Nota: Il test è fatto con cellule placcate, allegate. Così, non esiste nessuna centrifugazione o uso della tripsina nel processo di lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione WST-1 (-) SOD o (-) AO a colonne 1-6 e aggiungere 100 µ l di soluzione WST-1 (+) SOD o (+) AO a colonne 7-12 la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare righe G e H come sfondo controlli (vale a dire, per monitorare il cambiamento di assorbanza nel reagente solo nei pozzi senza cellule).</li>
	<li>Misurare i valori di assorbanza utilizzando lo spettrofotometro ogni 10 min per 1 h a 438 nm.</li>
	<li>Dopo la lettura, i media di aspirare e lavare ogni bene con 150 µ l di PBS. Poi aspirare il PBS.</li>
	<li>Calcolare la variazione di assorbanza di ciascun pozzetto sottraendo l'assorbanza iniziale per un pozzo dall'assorbanza in qualsiasi momento per bene. Correggere questo cambiamento per la variazione di assorbanza (se qualsiasi) osservata nei pozzetti sfondo (cioè, pozzetti con soluzione di saggio ma nessun cellule).</li>
	<li>Per l'analisi, normalizzare i dati di assorbanza per la misurazione di controllo 60 min o lavare i pozzetti con PBS o HBS e quindi eseguire un'analisi della proteina di bicinconinico acida (BCA).</li>
	<li>Aggiungere standard di albumina di siero bovino (BSA) 2 mg/mL (intervallo da 0,5-2 µ l per la curva standard, a seconda del grado di confluenza delle cellule) ai pozzetti vuoti (righe G e H), quindi aggiungere il reagente BCA in tutti i pozzetti.</li>
	<li>Quantificare i dati via nmol di WST-1 riduzione per µ g di proteina. Utilizzare 37 mM-1 cm-1 22 come il coefficiente di estinzione per ridotta WST-1 a 438 nm.</li>
</ol>2. analisi di riduzione DPIP
<ol><li>Crescere e differenziare le cellule aderenti C2C12 con la stessa procedura come passo 1.1.</li>
	<li>Preparare soluzione DPIP stock 10 mM come segue. Sciogliere 0,029 g di DPIP (FW: 290.08 g/mol) in 10 mL di diH2O. Confirm la concentrazione di DPIP misurando l'assorbanza a 600 nm con uno spettrofotometro. Utilizzare 1 mM-1 cm-1 23 come il coefficiente di estinzione per DPIP ridotta a 600 nm. Conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 0,0108 g di glucosio 11,880 mL di PBS per una concentrazione finale di 5 mM. Aggiungere 120 µ l di 10 mM DPIP per una concentrazione finale di 100 µM.</li>
	<li>Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, aggiungere 6 µ l di diH2O e l'altra aliquota aggiungere 6 µ l di AO 2 kU/mL per una concentrazione finale di 2 U/mL.</li>
	<li>Durante il monitoraggio di coinvolgimento di superossido in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, 55 µ l di tampone di4 KPO 0.1 M e l'altra aliquota aggiungere 55 µ l di SOD 6.5 kU/mL per una concentrazione finale di 60 U/mL.</li>
	<li>I media di aspirare e lavare le cellule in 150 µ l di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 100 µ l di soluzione di DPIP (-) SOD o (-) AO a colonne 1-6 e aggiungere 100 µ l di soluzione DPIP (+) SOD o (+) AO a colonne 7-12 la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare righe G e H volontà come sfondo controlli (vale a dire, per monitorare il cambiamento di assorbanza nel reagente solo nei pozzi senza cellule).</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 600 nm mediante spettrofotometro ogni 10 min per 1 h. quantificare la variazione di assorbanza relativo al controllo al min 60 simile procedura 1,9-1.13.</li>
</ol>3. determinazione di se ridotta accettori sono substrati per AO o SOD
<ol><li>5,436 mL di PBS o HBS, aggiungere 240 µ l di 10 mM WST-1 per una concentrazione finale di 400 µM e 24 µ l di 5mm PMS per una concentrazione finale di 20 µM.<ol>
<li>Per DPIP, aggiungere 60 µ l di 10 mM DPIP, per una concentrazione finale di 100 µM, a 5,940 mL di PBS o HBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di ogni bene in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto in assenza di cellule e misurare l'assorbanza a uno spettrofotometro a 438 nm, per WST-1, o 600 nm, per DPIP.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di ascorbato di 10 mM per la metà dei pozzi per una concentrazione finale di 100 μM. Monitorare l'assorbanza finché non si stabilizza.</li>
	<li>Al momento di stabilizzazione, aggiungere 1 µ l di 200 U/mL AO per una concentrazione finale di 2 U/mL ad ogni pozzetto o aggiungere 1 µ l di 6 kU/mL SOD per una concentrazione finale di 60 U/mL a ciascun bene e monitorare l'assorbanza per 1 h.</li>
</ol>

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<li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li>
<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo presentato due metodi per utilizzare extracellulare accettori, WST-1 e DPIP, nelle analisi spettrofotometriche per monitorare tPMET in miotubi C2C12. Con la crescita di linee cellulari nelle procedure standard di cultura e di un lettore di piastra spettrofotometro, è possibile monitorare tPMET con questi accettori in un'analisi semplice micropiastra. WST-1 riduzione è riproducibile dal pozzetto a altro all'interno di un test, ma non c'è variabilità giorno per giorno. Il quotidiano coefficiente di variazione (CV) ...

La capacità delle membrane plasmatiche purificate per ridurre accettori ha condotto alla vista che la membrana plasmatica ha un redox intrinseca capacità1. Precedentemente visto in funghi, piante e animali, tPMET è un processo comune a più organismi2,3,4,5. In particolare, questo processo è stato dimostrato in Saccharomyces cerevisiae, cellule di carota, eritrociti, linfociti, osteosarcoma, il melanoma, macrofagi, muscolo scheletrico e neutrofili2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in un processo che trasporta gli elettroni attraverso la membrana plasmatica per ridurre extracellulari ossidanti, tPMET è coinvolto in molte funzioni cellulari tra cui: cella crescita5,8, cellula attuabilità9, Ferro da stiro metabolismo10,11,12,13e protezione da ossigeno reattivo specie12,14,15di segnalazione delle cellule. A causa del coinvolgimento di tPMET in molte funzioni cellulari, uno squilibrio di tPMET è stata supposta per contribuire allo sviluppo di alcune condizioni di salute gravi, tra cui cancro16, malattia cardiovascolare17e metabolica la sindrome18.
Ci sono diversi modi per monitorare il trasferimento di elettroni attraverso la membrana plasmatica, ma la tecnica più ampiamente usata è quello di valutare la riduzione di accettori extracellulari attraverso saggi colorimetrici. Accettori extracellulari comunemente utilizzati sono sali di tetrazolio, DPIP e FeCN ferricitocromo c19,20. Il sale di tetrazolio più comunemente usato è un noto sale seconda generazione come WST-119. Questo composto è più facile da utilizzare in saggi colorimetrici rispetto ai sali di tetrazolio di prima generazione a causa di due gruppi solfonato, che aumentano la sua acqua solubilità21. WST-1, in concomitanza con l'intermedio elettrone accettore 1-metossi-fenazina methosulfate (MPM), è ridotto in eventi di due trasferimento singolo elettrone. Questa riduzione cambia la forma ossidata debolmente colorato di WST-1 a un più intenso, giallo formazan20,22. WST-1 ha un coefficiente di estinzione molare alta di 37 x 103 M-1cm-1, portando a un dosaggio ad alta sensibilità21,22. DPIP viene anche utilizzato come un ricettore dell'elettrone extracellulare per monitorare tPMET. È stato dimostrato che DPIP può essere ridotto extracellularly di tPMET senza l'ausilio di intermedi elettroni accettori23,24. A causa della mancanza di accettori intermedi, DPIP può direttamente gli elettroni di pick-up dalla membrana del plasma, a differenza di WST-124. Simile a DPIP, FeCN ha dimostrato di essere ridotto extracellularly a ferrocianuro di tPMET senza l'ausilio di intermedi elettroni accettori19,24. A differenza di WST-1 e DPIP, FeCN ha un coefficiente di estinzione molare basso che conduce a un più basso dosaggio sensibilità9. Un altro accettore di elettroni extracellulare comunemente usate per monitorare tPMET è ferricitocromo c. simile a WST-1, ferricitocromo c riduzione aumenta con l'uso di accettore di elettroni intermedi, mPMS22. A differenza di WST-1 però, il metodo di ferricitocromo c è meno sensibile a causa di un'alta priorità bassa e un coefficiente di estinzione molare basso22.
Qui presentiamo un metodo per l'analisi in tempo reale di tPMET attraverso analisi spettrofotometriche. Il metodo utilizzato l'accettori extracellulari WST-1 e DPIP, dato che entrambi hanno un coefficiente di estinzione molare alta mentre essendo meno costoso rispetto agli altri comunemente usato accettori extracellulari quali ferricitocromo c. Abbiamo utilizzato fenazina methosulfate (PMS) invece di mPMS hanno una composizione chimica simile e PMS è molto meno costoso. mPMS è fotochimicamente stabile che è una caratteristica importante per un kit commerciale che ha bisogno di una lunga shelf life. Tuttavia, facciamo PMS fresco per ogni dosaggio, quindi stabilità non dovrebbe essere un problema. Presentiamo anche un metodo per valutare le possibili interazioni enzimatiche (Vedi Figura 1) tra il ricettore dell'elettrone extracellulare ed enzimi che possono essere utilizzati per caratterizzare ulteriormente il processo di tPMET. In particolare, gli enzimi AO e SOD può essere usato determinano quale parte del tPMET è dovuto al trasporto dell'ascorbato o rilascio extracellulare del superossido, due metodi comuni per gli elettroni essere trasportato attraverso la membrana plasmatica.

<table><tbody><tr><td>Collezione di colture di tipo americano</td> <td>dei mioblasti C2C12</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex animal serum complex</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>penicillina-streptomicina</td><td>Sigma</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>siero di cavallo</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 15 cm</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 96 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disolfofenil)-2H-tetrazolio sale sodico (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>fenazina metosolfato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>acido L-ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>ascorbato ossidasi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>superossido dismutasi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico di 2,6-dicloroindofenolo&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Powerwave X-I</td><td>Biotek Istituments</td><td>fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti PureGrade, fondo F, trasparente, non trattata, non sterile</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>cloruro tetraidrato</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>ipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>xantina ossidasi</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>fuori produzione&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

trasporto dell'elettrone di miotubi c2c12 trans-plasma membrana di misura

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrana electron transport (tPMET) svolge un ruolo nella protezione delle cellule dallo stress riduttivo intracellulare così come protezione da danni da ossidanti extracellulari. Questo processo di trasporto di elettroni da riducenti intracellulare agli ossidanti extracellulari non è ben definito. Qui vi presentiamo le analisi spettrofotometriche di miotubi C2C12 per monitorare tPMET utilizzando gli accettori extracellulari: sale di tetrazolio solubile in acqua-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). Attraverso la riduzione di questi accettori, siamo in grado di monitorare questo processo in un'analisi in tempo reale. Con l'aggiunta di enzimi come la superossido dismutasi (SOD) per l'analisi e l'ascorbato ossidasi (AO), possiamo determinare quale parte del tPMET è a causa della produzione di superossido o esportazione dell'ascorbato, rispettivamente. Mentre WST-1 è stato indicato per produrre risultati stabili con fondo basso, DPIP è stato in grado di essere ri-ossidato dopo l'aggiunta di AO e SOD, che è stata dimostrata con analisi spettrofotometriche. Questo metodo dimostra un'analisi spettrofotometrica in tempo reale, multi-pozzetto e veloce con vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per il monitoraggio tPMET, come ferricianuro (FeCN) e ferricitocromo c riduzione.

Le statistiche sono state effettuate con ANOVA con misure ripetute utilizzando RStudio software statistico25. Dimensioni del campione sono indicate nelle leggende figura.
Per monitorare tPMET, miotubi C2C12 sono stati utilizzati insieme accettori extracellulari, WST-1 e DPIP. AO è stato usato per determinare quale parte del WST-1 e DPIP riduzione era a causa del deflusso dell'ascorbato e SOD è stato utili...

L'obiettivo del presente protocollo è di monitorare spettrofotometricamente trans-plasma membrana elettrone trasporto utilizzando accettori extracellulari e di analizzare le interazioni enzimatiche che possono verificarsi con questi accettori extracellulari.

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare il processo di trasporto degli elettroni di membrana trans-plasma in tempo reale attraverso saggi spettrofotometrici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del radox riguardo al meccanismo del trasporto di elettroni di membrana trans-plasma e al modo in cui viene mantenuto l'ambiente redox di una cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il test è un test spettrofotometrico rapido, multipozzetto e in tempo reale.Per iniziare, posizionare le cellule di aderenza C2C-12 a due volte 10 rispetto alla quarta cellula per centimetro quadrato nelle file da A a F di una piastra a 96 pozzetti, quindi coprire le cellule con mezzi di crescita. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore in coltura, aspirare il terreno di coltura, lavare con 150 microlitri di PBS, sostituire con terreno di differenziazione e incubare le cellule per altre 24-48 ore.Successivamente, prepara una serie di soluzioni WST-1 e PMS. Preparare una soluzione madre da 10 millimolari di WST-1 sciogliendo 033 grammi di WST-1 in cinque millilitri di P

measuring-trans-plasma-membrane-electron-transport-by-c2c12-myotubes

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Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

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Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

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Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

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