Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare il processo di trasporto degli elettroni di membrana trans-plasma in tempo reale attraverso saggi spettrofotometrici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del radox riguardo al meccanismo del trasporto di elettroni di membrana trans-plasma e al modo in cui viene mantenuto l'ambiente redox di una cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il test è un test spettrofotometrico rapido, multipozzetto e in tempo reale.

Per iniziare, posizionare le cellule di aderenza C2C-12 a due volte 10 rispetto alla quarta cellula per centimetro quadrato nelle file da A a F di una piastra a 96 pozzetti, quindi coprire le cellule con mezzi di crescita. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore in coltura, aspirare il terreno di coltura, lavare con 150 microlitri di PBS, sostituire con terreno di differenziazione e incubare le cellule per altre 24-48 ore.

Successivamente, prepara una serie di soluzioni WST-1 e PMS. Preparare una soluzione madre da 10 millimolari di WST-1 sciogliendo 033 grammi di WST-1 in cinque millilitri di PBS. Quindi, fai vorticare la soluzione.

Quindi, preparare la soluzione madre di PMS sciogliendo 0023 grammi di PMS in 1,5 millilitri di acqua ionizzata. Vortex la soluzione. Per preparare la soluzione di lavoro, aggiungere glucosio al PBS per ottenere 11,4 millilitri di una soluzione di glucosio da cinque millimolari.

A questa soluzione, aggiungere 480 microlitri della soluzione madre WST-1 per una concentrazione finale di 400 micromolari WST-1 e 48 microlitri della soluzione madre PMS per una concentrazione finale di 20 micromolari PMS. Vorticare le soluzioni da miscelare. Quindi dividere la soluzione in due aliquote da sei millilitri.

A seconda del saggio, aggiungere i componenti pertinenti descritti qui. Con le soluzioni ora preparate, aspirare i mezzi di differenziazione dalle cellule e lavarle una volta con 150 microlitri di PBS. Rimuovere il PBS e aggiungere 100 microlitri dall'aliquota uno nelle colonne da uno a sei.

E aggiungere 100 microlitri dall'aliquota due alle colonne da sette a 12 della piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un lettore di piastre e misurare i valori di assorbanza ogni 10 minuti per un'ora a 438 nanometri. Dopo la lettura finale, aspirare il terreno e lavare ogni pozzetto con 150 microlitri di PBS.

Quindi, aspirare il PBS. Per l'analisi, calcolare la variazione dell'assorbanza per ciascun pozzetto sottraendo l'assorbanza iniziale per il pozzetto dall'assorbanza in qualsiasi momento successivo per lo stesso pozzetto. Correggere questa modifica in base alla variazione dell'assorbanza osservata nei pozzetti di fondo.

Una volta corretto lo sfondo, normalizzare i dati di assorbanza alle misurazioni di controllo di 60 minuti. In alternativa, normalizzare in base al contenuto proteico in ciascun pozzetto utilizzando un test standard delle proteine BCA. Infine, quantificare i dati per ottenere la quantità di riduzione di WST-1 in microgrammi di proteine.

Per iniziare il test di riduzione DPIP, far crescere e differenziare le cellule di aderenza C2C-12, come mostrato per il test di riduzione WST-1. Successivamente, preparare una soluzione madre contenente 10 millimolari di DPIP sciogliendo 029 grammi di DPIP in 10 millilitri di acqua ionizzata. Quindi agitare la soluzione.

Confermare la concentrazione misurando l'assorbanza della soluzione a 600 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Per realizzare la soluzione di lavoro, aggiungere 120 microlitri della soluzione madre DPIP da 10 millimolari a 11,88 millilitri di una soluzione da cinque millimolari di glucosio e PBS per una concentrazione di lavoro DPIP finale di 100 micromolari. Quindi, fai vorticare la soluzione.

Quindi dividere la soluzione in due aliquote da sei millilitri. A seconda del saggio, aggiungere i componenti pertinenti descritti qui. Con le soluzioni ora preparate, aspirare i mezzi di differenziazione dalle cellule e lavarle una volta con 150 microlitri di PBS.

Rimuovere il PBS e aggiungere 100 microlitri dall'aliquota uno nelle colonne da uno a sei e 100 microlitri dall'aliquota due alle colonne da sette a 12 della piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un lettore di piastre e misurare i valori di assorbanza ogni 10 minuti per un'ora a 600 nanometri e analizzare i valori risultanti come descritto nell'analisi del saggio di riduzione WST-1. Per iniziare, prepara due soluzioni.

Innanzitutto, preparare sei millilitri di 400 micromolari WST-1 e 20 micromolari PMS in PBS. Quindi preparare sei millilitri di una soluzione 100 micromolari di DPIP e PBS. Preparare la prima piastra a 96 pozzetti aggiungendo 100 microlitri di una soluzione WST-1/PMS alle file da A a D in una piastra a fondo piatto in assenza di cellule, e misurare l'assorbanza in uno spettrofotometro a 438 nanometri.

Quindi preparare una seconda piastra a 96 pozzetti aggiungendo 100 microlitri della soluzione DPIP alle file da A a D in una piastra a fondo piatto in assenza di cellule, e misurare l'assorbanza nello spettrofotometro a 600 nanometri. Quindi, aggiungere un microlitro di ascorbato da 10 millimolari a metà dei pozzetti per una concentrazione finale di 100 micromolari. Monitorare l'assorbanza nella piastra fino a quando non si stabilizza.

Successivamente, ripeti con DPIP. Dopo la stabilizzazione, determinare se gli accettori di elettroni prodotti sono substrati. Per l'ascorbato ossidasi per il super ossido si dismuta, aggiungendo l'ascorbato ossidasi o il super ossido dismuta a ciascun pozzetto e monitorando la variazione di assorbanza per un'ora.

Per monitorare il trasporto di elettroni di membrana transplasmatica, l'ascorbato ossidasi è stata utilizzata per bloccare gli effetti della riduzione mediata dall'ascorbato e la superossido dismutasi è stata utilizzata per bloccare la riduzione mediata dal superossido per determinare quale porzione della riduzione WST-1 era dovuta a ciascun componente. Con l'aggiunta di ascorbato ossidasi, la riduzione di WST-1 è stata soppressa di circa il 30%, indicando che circa il 30% del trasporto di elettroni di membrana transplasmatica era dovuto all'esportazione di ascorbato. Con l'aggiunta di superossido dismutasi, la riduzione di WST-1 è stata soppressa di circa il 70%, indicando che circa il 70% del trasporto di elettroni della membrana transplasmatica era dovuto al rilascio extracellulare di superossido.

Per determinare se la DPIP ridotta è un substrato per l'ascorbato ossidasi o la super ossido dismutasi, i livelli di DPIP sono stati ridotti con acido ascorbico. Dopo 20 minuti, è stata aggiunta l'ascorbato ossidasi e l'assorbanza è stata monitorata. Il recupero mostra che la riduzione della DPIP è un substrato per l'ascorbato ossidasi.

Quando è stata aggiunta la super ossido dismutasi, anche il DPIP è stato riossidato, anche se a una velocità inferiore; pertanto, la DPIP ridotta è un substrato per questi enzimi e non un accettore di elettroni extracellulari appropriato da utilizzare con questi enzimi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di preparare tutti i reagenti freschi ogni giorno.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia redox per esplorare il trasporto di elettroni di membrana transplasmatica in una varietà di tipi di cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare il trasporto di elettroni di membrana transplasmatico utilizzando accettori di elettroni extracellulari, nonché di come determinare se l'accettore di elettroni potrebbe essere un substrato per gli enzimi utilizzati nel saggio.