Name: Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Impara a visualizzare la fagocitosi in tempo reale nei macrofagi peritoneali del topo con microscopia confocale a disco rotante. Questa tecnica consente di osservare la cattura e l'ingestione delle particelle in 3D.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni HA 3271/4-1 e HA 3271/4-2 dalla DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) e la concessione FF-2016-05 da EXC 1003 (Cluster di eccellenza 1003), cellule in movimento (CiM), DFG.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La stragrande maggioranza dei saggi di fagocitosi, soprattutto end-point e saggi di alto-rendimento, non fornire una visualizzazione di come le particelle sono effettivamente catturate, avvolto e ingerite. Studi pionieristici di Munthe-Kaas et al. 10 e Kaplan2 nel 1970 ha suggerito che sorprendentemente diverse riorganizzazioni del citoscheletro sono stati coinvolti nella fagocitosi di IgG-opsonized contro complemento-opsonized particelle (globuli rossi delle pecore). Qui descriviamo saggi di fagocitosi usando la microscopia confocal di filatura disco che permettono la formazione immagine ad alta risoluzione, in tempo reale dei singoli eventi fagocitici. Fagocita il nostro modello è il macrofago peritoneale residente del mouse, che può essere isolata con gestione minima, e usiamo i globuli rossi umani appena isolate come particelle. Tuttavia, i test di fagocitosi potrebbero essere applicati ad altri fagociti, quali macrofagi derivanti dal midollo osseo del topo o neutrofili, linee cellulari di topo del macrofago, macrofagi monocito-derivati umani o i neutrofili del sangue periferico umano. Nel caso di fagociti umani o neutrofili del mouse, alternativa fluorescente anticorpi marcati con sarebbe necessaria, ad esempio fluorescente identificati anti-CD14 anticorpi (monociti/macrofagi umani)16 o anticorpi anti-Gr-1 (Ly - 6 G) (mouse neutrofili).
Unopsonized globuli rossi umani, come globuli rossi di pecora tradizionalmente utilizzati, sono inerti nel senso che queste cellule sono non (o, almeno, molto raramente) ingerite dai macrofagi peritoneali del topo. In questo modo, in contrasto con perle di polistirolo, attività di basso fondo. Globuli rossi umani può essere convenientemente opsonized con immunoglobuline utilizzando anticorpi monoclonali di topo IgG o IgM contro CD235a (glycophorin A), un marker specifico di umani eritrociti (globuli rossi) e di precursori eritroidi17, 18. nelle analisi parallele, anti-topo fluorescente contrassegnati IgG o IgM anticorpi secondari possono essere applicati per confermare opsonizzazione. Le classi di anticorpi IgG e IgM sono emoagglutinine, sostanze (anticorpi) che causano globuli rossi per agglutinare. Per evitare di agglutinazione, mescoliamo a intermittenza la sospensione cellulare durante il periodo di incubazione di 8 min con l'anticorpo anti-CD235a, e poi aggiungiamo la sospensione mista direttamente a una diapositiva di canale macrofago-contenenti (rivestite di fibronectina diapositiva) senza una fase di lavaggio . Fasi di lavaggio coinvolgono sedimentazione dei globuli rossi per centrifugazione, che promuove fortemente agglutinazione. Prima opsonizing globuli rossi umani, etichettiamo la membrana plasmatica con una sonda fluorescente lipofilica di arancione/rosso. Questa sonda è brillantemente fluorescente all'inizio di time-lapse registrazioni, ma il segnale svanisce gradualmente, probabilmente in gran parte dovuto photobleaching19. Inoltre, i macrofagi e il rivestimento di fibronectina della diapositiva può diventare debolmente arancione/rosso fluorescente durante le registrazioni. Questo problema è presumibilmente a causa di un lavaggio insufficiente di globuli rossi umani dopo l'etichettatura. Invece di utilizzare un marcatore di membrana plasmatica fluorescente lipofilico, globuli rossi umani potrebbe essere etichettati con un derivato di rodamina pH sensibili usando suo ammina reattiva succinimidyl ester15,20. Questo ha il vantaggio di permettere la visualizzazione di maturazione del fagosoma poiché l'intensità di fluorescenza aumenta con la diminuzione di pH15,20, ma questo approccio ha lo svantaggio che i preparati reattivi estere sono attualmente costosi e instabile dopo la ricostituzione in mezzo acquoso.
IgG-opsonized globuli rossi umani sono ingerite tramite FcγRs, che può essere confermata mediante macrofagi peritoneali isolati da NOTAM21 o Fcer1g- / - (Fcer1g) topi. I macrofagi NOTAM associare IgG-opsonized globuli rossi umani, ma mancano ITAM (immunoreceptor motivo l'attivazione basata su tirosina) - mediata segnalazione richiesta per indurre la fagocitosi, mentre i macrofagi Fcer1g knockout non esprimono superficie FcγRs. IgG - o IgM-opsonized globuli rossi umani può essere inoltre opsonized con C3b (che viene scisso a iC3b) incubando le cellule con siero fresco isolato da un mouse null complemento C5 (selvaggio-tipo siero provoca emolisi). Opsonine IgG e IgM attivano la cascata del complemento classico, che conduce alla formazione di pori (complessi di attacco di membrana) e lisi cellulare. In topi privi di complemento C5, la cascata del complemento procede a complemento C3 clivaggio, ma C5 convertasi mancano il substrato necessario per catalizzare la via terminale. Abbiamo sviluppato le analisi semplice per misurare la cinetica della cascata del complemento. In breve, i globuli rossi umani può essere co-etichettati con un rosso fluorescente, marcatore di membrana plasmatica e il fluoroforo verde fluorescente, citosolico. Formazione del complesso di attacco della membrana, formata da componenti del complemento C5-C9, il fluoroforo citosolico è rapidamente (in secondi) perso dal cytosol. Visualizzazione della funzione attuatore (citolisi) della cascata del complemento ha indicato che il tempo di incubazione di 4 min è sufficiente per C3b/iC3b Opsonizzazione dei globuli rossi umani. Nelle analisi parallele, C3b/iC3b rivestimento di globuli rossi umani può essere facilmente valutata dopo l'applicazione di una miscela di anti-topo C3b e identificato fluorescente anticorpi secondari. In questo caso, è necessaria una fase di lavaggio per rimuovere gli anticorpi fluorescenti non legati. Anche se la fase di lavaggio coinvolge cella sedimentaion mediante centrifugazione, che promuove l'agglutinazione, Opsonizzazione successo possa essere prontamente valutati mediante microscopia confocale. Fagocitosi mediata dal recettore di complemento possono essere ripreso da entrambi l'applicazione IgG- / iC3b-opsonized umano globuli rossi ad NOTAM o Fcer1g- / - macrofagi o introducendo IgM- / iC3b-opsonized umano globuli rossi ai macrofagi di selvaggio-tipo. IgM-opsonized globuli rossi non vengono riconosciuti dall'ITAM contenenti FcγRs (FcγRI, FcγRIII e FcγRIV) necessaria per la fagocitosi delle particelle di IgG-opsonized22.
Per realizzare l'immagine fagocitica eventi, la membrana plasmatica dei macrofagi possono essere etichettati con anticorpo anti-F4/80 coniugato fluoroforo fluorescente verde, che serve anche come indicatore specifico dei macrofagi del topo. Globuli rossi umani può essere renderizzati rosso fluorescente tramite incubazione con un pennarello rosso/arancio fluorescente della membrana plasmatica, come discusso in precedenza. Questo marcatore di membrana plasmatica lipofilico evita potenziali effetti confondenti delle etichette a base di anticorpi. Rossi fluorescente globuli rossi umani, con o senza opsonizzazione, può essere dispensati direttamente nel canale di 100 µ l di una diapositiva di canale ed imaged time-lapse 3D tramite un 60x / 1,49 olio immersione (o simili) obiettivo eseguita utilizzando la 488 nm e 561 nm laser linee , rispettivamente, di un microscopio confocale (o simile) del disco di filatura. È tentato di ottimizzare il sistema per imaging ad alta risoluzione, ma l'acquisizione di ripetute Z-stack oltre 16 min o così può causare fototossicità e considerevole photobleaching. Abbiamo scelto di utilizzare il 2 x 2 binning per promuovere buoni rapporti segnale-rumore e consentire riduzioni in intensità di eccitazione e/o tempi di esposizione, ma a scapito della risoluzione ottica. Inoltre, per ridurre la fototossicità, aggiungiamo un organismo saprofago delle specie reattive dell'ossigeno al mezzo. Negli studi futuri, l'analisi potrebbero essere modificate per la fagocitosi dei globuli rossi umani apoptotica di immagine. Applicazione di un Ca2 + ionoforo del, ad esempio A23187, utilizzabile per indurre la fosfatidilserina esternalizzazione23, un "eat me" segnale e segno distintivo del precoce apoptosi24,25.

Vent'anni prima osservazione di Metchnikoff delle cellule fagocitiche mesenchima nelle larve di stelle marine, nel 1882 e lo sviluppo successivo della sua teoria della fagocitosi1, Ernest Haeckel descritto, nel 1862, il engulfment delle particelle insolubili tintura di sangue cellule di fimbris Thetis (Tethys fimbria), una specie di predatori sea slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Ha descritto in modo esplicito protrusioni di membrana che avvolge le particelle, che sono stati successivamente ripreso nel citoplasma e accumulate intorno al nucleo delle cellule. Più di 100 anni più successivamente, uno studio pionieristico di Kaplan ha suggerito che c'erano morfologicamente distinte almeno due meccanismi di fagocitosi,2. Kaplan ha mostrato mediante microscopia elettronica a scansione che il mouse peritoneale macrofagi ingerito un IgG-opsonized pecora rossa del globulo utilizzando estensioni di membrana sottile che ha raggiunto e strettamente avvolto la particella, inizialmente dando luogo a un tazza-come struttura. Coppa fagocitica formazione necessaria polimerizzazione dell'actina, poiché è stata abolita dalla cellula-permeabile tossina fungina citocalasina B, nota per bloccare l'actina dinamiche3. Al contrario, globuli rossi delle pecore opsonized con complemento sembrava sprofondare direttamente il macrofago senza la generazione di estensioni della membrana, anche se, in alcune immagini, Increspature di membrana possono essere visto in prossimità immediata delle particelle d'abbassamento. A differenza di formazione tazza fagocitica, complemento recettore-mediata affondamento era insensibile al trattamento di citocalasina B2. Negli esperimenti descritti da Kaplan, complemento opsonizzazione è stata eseguita incubando immunoglobulina M (IgM) con etichetta pecore globuli rossi con il siero da topi complemento C5-carenti, che aggira il hemolysis dal terminale complemento C5-dipendente completano il complesso.
Le due modalità di fagocitosi, formazione di Coppa fagocitica e affondamento in, identificate da Kaplan sono diventati opinione consolidata nel campo4,5,6,7,8,9 . Tuttavia, le immagini ad altissima risoluzione utilizzata nello studio originale di Kaplan2, come pure uno studio simile di Munthe-Kaas et al. 10, forniscono solo istantanee di eventi fagocitici. In una recente revisione, Rougerie et al. 11 ha sottolineato che differenze morfologiche tra la fagocitosi mediata da FcγR e CR restano ancora da chiarire, e, inoltre, Increspature di membrana sono stati osservati durante complemento recettore-mediata delle particelle assorbimento2. Formazione immagine di cellule vive di singoli eventi fagocitici che vanno dalla cattura delle particelle alla interiorizzazione, combinato con geneticamente modificato modelli murini, potrebbe notevolmente migliorare la nostra comprensione di come i fagociti catturano e ingeriscono particelle. Un approccio potrebbe essere utilizzare microscopia a forza atomica veloce (AFM) che permette la formazione immagine topografica (10 – 20 nm) ad altissima risoluzione delle cellule viventi. Recentemente, è stato sviluppato un veloce sistema AFM12 , che è adatto per superfici di cellule imaging rapidamente con basso rumore. Questa tecnica ha il vantaggio che parametri ad alta risoluzione, topografico e meccanica di vivere cellule possono essere misurate a brevi intervalli (secondi), a differenza di microscopia elettronica, che rende necessaria la fissazione e il punto critico di essiccazione di cellule. Un altro approccio è time-lapse microscopia confocale 3D, che è ampiamente disponibile, anche se fototossicità e candeggio sono fattori limitanti durante le registrazioni. Questo approccio è estremamente versatile e permette di sezionamento con elevata risoluzione spaziale ottico e consente straordinaria flessibilità nell'etichettatura con una serie impressionante di sonde fluorescenti, tra cui proteine fluorescenti geneticamente codificate. Qui descriviamo saggi di fagocitosi usando la microscopia confocal di disco di time-lapse filatura che consentono ad alta risoluzione spazio-temporale di specifici eventi fagocitici ricevitore-mediata.

<table><tbody><tr><td>Catetere in plastica da 24 G</td><td>B Braun Mesungen AG, Germania</td><td>4254503-01</td><td>Utilizzato per il lavaggio peritoneale</td></tr><tr><td>Hank' soluzione salina tamponata senza Ca2+ e Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170120</td><td>Utilizzato per il lavaggio peritoneale</td></tr><tr><td>14 mL di provette in polipropilene a fondo tondo</td><td>BD</td><td>Falcon</td><td>352059 Utilizzato per raccogliere le cellule peritoneali</td></tr><tr><td>Terreno RPMI 1640 contenente 20 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>Terreno base per saggi</td></tr><tr><td>Fetale bovino inattivato termicamente siero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td>Utilizzato come integratore per RPMI 1640 media</td></tr><tr><td>100x penicillina/streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Utilizzato come integratore per RPMI 1640 media</td></tr><tr><td>Fibronectina rivestita &micro;-Slide&nbsp; I chambers</td><td>Ibidi, Martinsried, Germany</td><td>80102</td><td>Vetrini per canali utilizzati per saggi</td></tr><tr><td>&micro;-Rack per vetrini (alluminio anodizzato)</td><td>Ibidi, Martinsried, Germany</td><td>80003</td><td>Rack impilabile autoclavabile per vetrini per canali</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Terreno contenente bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Terreno per colture notturne</td></tr><tr><td>N-(2-mercaptopropionil)glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6635</td><td>Scavenger delle specie reattive dell'ossigeno</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonale (clone BM8) anticorpo F4/80 anti-topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>Marcatore macrofagico di topo ed etichetta della membrana plasmatica</td></tr><tr><td>CellMask Orange Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td>Colorazione fluorescente rossa della membrana plasmatica</td></tr><tr><td>Succinimidil estere di pHrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36600</td><td>Estere succinimidilico reattivo all'ammina di pHrodo</td></tr><tr><td>Mouse (IgG2b) monoclonale (clone HIR2) anti-umano CD235a&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-20893</td><td>Utilizzato per opsonizzare i globuli rossi umani con IgG</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-coniugato&nbsp; anticorpo IgG di capra (secondario)</td><td>Abcam Abcam</td><td>Ab150116</td><td>Utilizzato per confermare l'opsonizzazione dei globuli rossi umani con anticorpo IgG di ratto di topo</td></tr><tr><td>C3b/iC3b/C3c</td><td>Hycult Biotech</td><td>HM1065</td><td>Utilizzato per confermare l'opsonizzazione C3b/iC3b dei globuli</td></tr> <tr><td>rossi umaniAlexa Fluor 488-coniugato capra anti-ratto anticorpo IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario per confermare l'opsonizzazione C3b/iC3b</td></tr><tr><td>Calcein/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C3100MP</td><td>Utilizzato per caricare i globuli rossi umani con il</td></tr><tr><td>sistema di imaging di cellule vive Calcein UltraVIEW Vox 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germania</td><td></td><td>Sistema di microscopio confocale a disco rotante</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti microscopio inverso</td><td>Nikon, Giappone</td><td></td><td>Microscopio invertito</td></tr><tr><td>CSU-X1 scanner a disco rotante</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Giappone</td><td></td><td>Unità disco rotante Nipkow</td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-50 Dispositivo a coppia moltiplicata di elettroni (EM-CCD) fotocamera raffreddata</td> a <td>Peltier Hamamatsu Photonics Inc., Giappone</td><td></td><td>Fotocamera EM-CCD del sistema di microscopio confocale a disco rotante&nbsp;</td></tr><tr><td>Laser a stato solido da 488 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germania</td><td></td><td>Sorgente laser (488 nm) del sistema di microscopio confocale a disco rotante Laser a</td></tr><tr><td>stato solido da 561 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germania</td><td></td><td>Sorgente laser (561 nm) del sistema di microscopio confocale a disco rotante</td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging 3d della fagocitosi dai macrofagi del topo

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Fagocitosi gioca un ruolo chiave nella difesa dell'ospite, così come nella manutenzione e nello sviluppo del tessuto e coinvolge rapidi, mediata dal recettore riarrangiamenti del citoscheletro per catturare, avvolgono e fagocitare particelle di grandi dimensioni. Sebbene siano stati identificati recettori fagocitici, vie di segnalazione a valle ed effettori, come Rho GTPasi, il rimodellamento del citoscheletro dinamico di specifici eventi fagocitici ricevitore-mediata rimangono poco chiari. Quarant'anni fa, due distinti meccanismi di fagocitosi, esemplificato dal fcy ricevitore (FcγR) - e complemento recettore (CR) - mediato di fagocitosi, sono stati identificati usando la microscopia elettronica a scansione. Associazione dell'immunoglobulina G (IgG)-opsonized particelle a FcγRs innesca la protrusione delle estensioni di membrana sottile, che inizialmente formano una cosiddetta Coppa fagocitica intorno la particella prima che diventa completamente racchiusa e ritirato all'interno della cella. Al contrario, particelle di complemento opsonized sembrano affondare in fagocita seguito associazione a complemento dei recettori. Queste due modalità di fagocitosi, formazione di Coppa fagocitica e affondamento nel, sono diventati affermati nella letteratura. Tuttavia, le distinzioni tra le due modalità sono diventato offuscate dai rapporti che fagocitosi mediata dal recettore complemento possono indurre varie protrusioni di membrana. Con la disponibilità di tecniche di imaging ad alta risoluzione, sono necessari test di fagocitosi che consentono la visualizzazione 3D (tre dimensioni) in tempo reale di come specifici recettori fagocitici mediare l'assorbimento di particelle individuali. Più comunemente utilizzati approcci per lo studio della fagocitosi, come end-point saggi, perdere l'opportunità di capire cosa sta succedendo all'interfaccia delle particelle e fagociti. Qui descriviamo fagocitiche saggi, usando la microscopia confocal disco Time-lapse filatura, che consentono di immagini 3D di singoli eventi fagocitici. In più, descriviamo le analisi a inequivocabilmente immagine fcy recettore - o a completare la fagocitosi mediata dal recettore.

Un diagramma schematico della diapositiva canale utilizzato per l'imaging della fagocitosi mediante microscopia confocale filatura time-lapse è illustrato nella Figura 1. Globuli rossi umani (hRBCs) sono macchiati con il marcatore di membrana del plasma fluorescente rosso CellMask Orange, considerando che i macrofagi peritoneali residenti isolato mouse (Ms) sono etichettati con verde fluorescente Alexa Fluor 488-anti-F4/80 anticorpo coniugato ( Figura 2), che serve sia come un'etichetta di membrana plasmatica come un indicatore specifico dei macrofagi del topo. Globuli rossi umani può essere opsonized con mouse IgG (mIgG) o mouse IgM (mIgM), incubando le cellule con l'anticorpo anti-CD235a IgG (o IgM) (CD235a, noto anche come glicoforina A, è una proteina espressa specificamente su globuli rossi umani). Time-lapse imaging 3D dei macrofagi fluorescenti verdi ha presentato con rossi fluorescente globuli rossi umani permette la visualizzazione di eventi fagocitica di singola particella (Figura 2). Stretta osservazione di singoli eventi fagocitici consente dettagli di cattura delle particelle e l'ingestione di essere delineato. Ad esempio, la cattura di un mIgG-opsonized globulo rosso umano di un macrofago filopodium, una sottile, barretta-come proiezione, può essere osservata (Figura 3A; veda inoltre Horsthemke et al. 15). Inoltre, la spremitura di un globulo rosso umano durante la formazione fagocitica tazza può essere osservata (Figura 3A). Dopo l'introduzione del siero fresco del mouse, mIgG-opsonized, o globuli rossi umani, mIgM-opsonized innescare la cascata di classico del complemento, che culmina nella formazione di un complesso di attacco di membrana emolitica. La cinetica del hemolysis complemento-mediata può essere misurata da imaging cellule doppia colorazione con CellMask Orange e calceina. Verde fluorescente calceina citosolico fuoriesce rapidamente dalle cellule durante emolisi (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> Figura 1: gestione di diapositive canale rivestite su fibronectina. Diapositiva di canale (A) A è costituito da due serbatoi collegati da un canale con le dimensioni 50 x 5 mm 0,4 mm canale: le diapositive sono inizialmente predosate applicare 1-2 mL di terreno di uno dei due bacini e inclinando il vetrino. Tappi (B) possono essere inseriti i serbatoi prima dell'incubazione. I tappi possono essere utilizzati per pompare fuori le bolle d'aria indesiderate prima della semina il canale con le cellule. Canale 100 µ l (C) l'aria priva di bolle può essere riempito pipettando direttamente medio nella bocca di un canale. Questo passaggio viene utilizzato, ad esempio, ai macrofagi di seme in una diapositiva o per aggiungere gfluorophore (verde fluorescente)-anticorpo coniugato anti-F4/80, che serve come un'etichetta di membrana, come pure un indicatore del macrofago del mouse. (D) dopo la dispensazione di particelle, quali opsonized eritrociti umani, in un canale seminato con fluorescente macchiato macrofagi, la diapositiva può essere posizionata sul palco di un microscopio invertito e microscopia confocale di time-lapse filatura disco può essere eseguita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> Figura 2: Time-lapse imaging 3D della fagocitosi. Diagramma schematico (A), mostrando l'opsonizzazione della membrana plasmatica macchiata (rosso fluorescente) globuli rossi umani (hRBCs) con anticorpo di topo (m) anti-CD235a immunoglobulina G (mIgG) e la presentazione di hRBCs con etichetta ai macrofagi di topo (Ms), con l'etichetta (verde fluorescente) con l'anticorpo anti-F4/80 fluorophore-coniugato fluorescente verde. (B) Time-lapse immagini (XZ visualizzazioni), ottenute mediante microscopia confocale disco, Risultati Coppa fagocitica formazione e ingestione di hRBCs mIgG-opsonized di filatura. Barra della scala = 10 µm. (C) ricostruzioni 3D mostrando i macrofagi che ingeriscono mIgG-opsonized hRBCs. Visualizzazioni XZ corrispondenti (per 3 i punti temporali) sono mostrati in rappresentano spaziature griglia B. 5.07 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> Figura 3: acquisizione di una particella di un filopodium. Time-lapse immagini, ottenute facendo girare la microscopia confocale disco, mostrando un macrofago del mouse cattura un topo di G dell'immunoglobulina (mIgG)-opsonized globulo rosso umano (hRBC) tramite un filopodium (frecce nel pannello superiore), una proiezione di barretta-come. Si noti che il globulo rosso perde la sua crenations presto durante la formazione di Coppa fagocitica. Inoltre, la Coppa fagocitica sembra spremere il globulo rosso avvolto (indicato dalle frecce nel pannello inferiore). Barra della scala = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

L'obiettivo generale di questo saggio, è quello di preparare macrofagi e globuli rossi opsonizzati per la visualizzazione della fagocitosi mediante microscopia tridimensionale time lapse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come come fanno i fagociti a catturare e ingerire particelle. Questa tecnica consente la visualizzazione dell'assorbimento delle particelle in tempo reale, a differenza dei test più tradizionali del punto finale che consentono solo la valutazione se ma non come, una particella è stata ingerita.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà fino a quando non si abituano alle procedure di isolamento cellulare. Abbiamo avuto l'idea per la prima volta di questo metodo quando ci siamo resi conto dei vantaggi di girare questa microscopia confocale per l'imaging time-lapse 3D della fagocitosi. Per isolare i macrofagi peritoneali, posizionare un catetere di plastica calibro 24 nel peritoneo di un topo di tre o quattro mesi e utilizzare una siringa di plastica da cinque millilitri per lavare la cavità due volte con 4,5 millilitri di HBSS ghiacciato senza calcio e magnesio per lavanda.Trasferimento della sospensione aspirata in un tubo inferiore rotondo in polipropilene da 14 millilitri durante la raccolta. Quando entrambi i campioni sono stati raccolti, centrifugare l'aspirato e rimescolare le cellule peritoneali in un millilitro di mezzo RPMI 1640 privo di bicarbonato completo per ottenere circa sei per 10 alla sesta concentrazione di millilitro. Successivamente, per pre-riempire le diapositive aggiungere un millilitro di HEPES completo integrato medio-un serbatoio di uno scivolo a canale rivestito di fibronectina e inclinare il vetrino per consentire l'aspirazione del mezzo dal serbatoio a valle.Per rimuovere le bolle d'aria indesiderate, aggiungere da uno a due millilitri di mezzo fresco a uno dei due serbatoi e applicare saldamente un tappo del serbatoio. Quindi applicare la pressione ritmica del pollice sul cappuccio per pompare l'aria fuori dalla diapositiva, inclinando lo scivolo se necessario. Quando tutta l'aria è stata espulsa, inclinare lo scivolo verso il mezzo non conciato contenente il serbatoio e rimuovere il tappo per evitare che l'aria venga risucchiata nel canale.Ora pipettare la soluzione cellulare un paio di volte per ridurre l'accumulo e aggiungere 100 microlitri delle cellule in un canale dello scivolo per un'incubazione di due ore in una camera umida a 37 gradi celsius in assenza di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione sostituire l'HEPES contenente il mezzo in ogni diapositiva con mezzo integrato bicarbonato completo come appena dimostrato. Quindi posizionare le cellule in un incubatore umido di 37 gradi celsius con anidride carbonica del 5% per la loro coltura notturna.La mattina seguente trasferire un millilitro di sangue donatore sano appena ottenuto in un tubo di microcentrifugo in polipropilene rotondo a due millilitri. Quindi centrifugare il campione. Rimuovere il mantello al plasma e buffy contenente supernatante.E trasferire con cura 100 microlitri dei globuli rossi sedimentati in un tubo di mircocentrifuge a due millilitri contenente 100 microlitri di mezzo completo integrato hepes. Etichettare il tubo 1:1 e trasferire quattro microlitri dei globuli rossi diluiti in un nuovo tubo microcentrifugo a due millilitri contenente due millilitri di mezzo completo integrato hepes. Quindi etichettare questo tubo 4:2000 e posizionare entrambi i tubi campione di globuli rossi diluiti sul ghiaccio.Per etichettare i macrofagi peritoneali sostituire il mezzo bicarbonato in ogni diapositiva del canale con mezzi completi integrati con HEPES. Quindi inclinare la diapositiva per consentire l'aggiunta di 100 microlitri dell'anticorpo specifico del macrofago del topo contrassegnato fluorescentmente di interesse all'apertura del canale di 100 microlitri della diapositiva. Aspirare il mezzo che scorre nel serbatoio a valle e incubare le cellule per 20 minuti in una camera umida a 37 gradi celsius in assenza di anidride carbonica.Mentre le cellule peritoneali vengono etichettate mescolare delicatamente il campione di globuli rossi 4:2000 e trasferire 400 microlitri delle cellule in un nuovo tubo di microcentrifugo a due millilitri, in un blocco di alluminio riscaldato all'interno di una cappa di flusso laminare per circa cinque-otto minuti. Quando le cellule si sono riscaldate a 37 gradi celsius mescolare 0,4 microlitri di un'appropriata macchia di membrana plasmatica fluorescente rossa con le cellule. Quindi riposizionare le celle nel blocco di calore.Dopo cinque minuti lavare le cellule aggiungendo 1,6 millilitri di HEPES fresco integrato mezzo completo e centrifuga. Ruotare il tubo per identificare il pellet di globuli rossi. Utilizzando la punta della pipetta da uno a 1,5 millilitri rimuovere con cura il supernatante in due volumi senza disturbare il pellet e mescolare 2000 microlitri di HEPES fresco integrato con il mezzo completo con le celle.Centrifugare e sospendere di nuovo il pellet in 400 microlitri di mezzo. Quindi etichettare il tubo PMS per la macchia di membrana plasmatica. Al termine dell'incubazione peritoneale di 20 minuti per l'etichettatura delle cellule lavare lo scivolo con un millilitro di mezzo fresco completo integrato hepes.Per opsonizzare i globuli rossi aggiungere un microlitro di anticorpo cd235A monoclonale IGG2B del topo al tubo campione PMS. Dopo otto minuti a 37 gradi celsius con miscelazione una volta al minuto trasferire 100 microlitri della membrana plasmatica macchiato IGG opsonizzato globuli rossi umani al macrofago peritoneale contenente scorrimento del canale. Non appena i globuli rossi umani sono stati aggiunti montare la diapositiva su un microscopio confocale disco rotante.Con l'incubatore di palcoscenico impostato a 37 gradi celsius e iniziare immediatamente a immaginare le cellule. L'imaging 3D time lapse di macrofagi fluorescenti verdi presentati con globuli rossi fluorescenti rossi consente la visualizzazione di eventi fagocitici a singola particella. Ad esempio, si può osservare la cattura di un topo IGG opsonizzato globuli rossi umani da un filopodio macrofago.Così come, la spremitura di un globulo rosso umano durante la formazione di coppe fagocitiche. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare i macrofagi peritoneali residenti nel mouse, le cellule etichettate fluorescentmente e le particelle opsonizzate.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Questo video mostra un test per monitorare gli eventi di fagocitosi dei globuli rossi (RBC) mediati da macrofagi indipendenti. I globuli rossi umani opsonizzati con immunoglobuline G (IgG) di topo vengono incubati con macrofagi di topo e osservati al microscopio confocale. I globuli rossi sono inghiottiti dai macrofagi attraverso la formazione di una coppa fagocitaria e mirati alla degradazione lisosomiale.

Imaging in tempo reale della fagocitosi macrofagica dei globuli rossi opsonizzati IgG

Questo video mostra una tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) ad alta risoluzione per la visualizzazione in tempo reale della formazione e della chiusura dei fagosomi durante la fagocitosi mediata dai macrofagi dei globuli rossi (RBC) opsonizzati da IgG attaccati alla superficie di un piatto con fondo di vetro. I macrofagi estendono gli pseudopodi attorno ai globuli rossi e li inghiottono all'interno dei fagosomi, staccandoli dalla superficie del vetro.

Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Qui descriviamo una tecnica basata sul microscopio per visualizzare e quantificare le prime cascate di eventi durante la fagocitosi di agenti patogeni come i funghi Candida albicans e particolati che sono più grandi di 0,5 μm, inclusi zimosani e perle rivestite di IgG.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia a contrasto temporale e a contrasto di fase per immagini di macrofagi peritoneici residenti nel gradiente C5a di complemento chemiotattico. I protocolli possono essere estesi ad altre cellule immunitarie.

Immagine time-lapse di Mouse Macrophage Chemotaxis

Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.

Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging

Impara a visualizzare la fagocitosi in tempo reale nei macrofagi peritoneali del topo con microscopia confocale a disco rotante. Questa tecnica consente di osservare la cattura e l'ingestione delle particelle in 3D.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

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