Thin Film composito silicone elastomeri per colture cellulari e applicazioni della pelle: produzione e caratterizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre e caratterizzare strutture composite polimeriche a film sottile per studi avanzati di colture cellulari o come adesivi cutanei. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i compositi elastomerici possono essere utilizzati per ottenere un'azione di adesione ottimale, anche su superfici irregolari. I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono semplici e universalmente applicabili.

Ciò consente una produzione su larga scala con una precisione molto elevata. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché le misurazioni dell'adesione richiedono un allenamento intensivo e pratica per raggiungere la precisione necessaria. A dimostrare le procedure di coltura cellulare e l'applicazione del plasma sarà Angela Rutz, un tecnico del nostro laboratorio.

Per preparare il PDMS, mescolare e degassare 1,1 grammi della miscela di prepolimero in un miscelatore a velocità a 2350 giri/min sotto vuoto per tre minuti. Per preparare lo strato di supporto PDMS, utilizzare una macchina per l'applicazione della racla a controllo automatico. Posizionare la racla sopra un pezzo di foglio di PET pulito al 100% con isopropanolo e utilizzare le viti di microposizionamento per regolare lo spessore dello strato di supporto.

Caricare il PDMS in una siringa monouso da 10 millilitri. Riempire il serbatoio della racla con il polimero e avviare il movimento della lama con una velocità di circa 2 millimetri al secondo. Quando il pezzo di pellicola in PET è stato rivestito, trasferire la pellicola in un forno a 95 gradi Celsius per un'ora.

Per preparare lo strato superiore del film composito, utilizzare una lama per rimuovere le strisce sottili dai lati lunghi dello strato di supporto. Per consentire lo scorrimento della racla sulla lamina in PET, applicare il secondo strato di PDMS come descritto in precedenza. Quindi, metti la carta stagnola nel forno.

Per preparare i campioni per le misurazioni dell'adesione, utilizzare una lama di rasoio per tagliare le pellicole sulla pellicola in PET in pezzi di quattro centimetri quadrati e utilizzare la colla UV per fissare i pezzi su un vetrino. Illuminare i pezzi con luce UV per tre minuti e montare il primo campione polimerico sul portacampioni. Utilizzare il goniometro per regolare l'angolo di inclinazione, fino a quando il substrato non è a contatto con il film polimerico con un allineamento completamente parallelo di entrambe le superfici, come visualizzato dalle immagini della telecamera.

L'allineamento ottico del substrato al campione è estremamente critico per l'interpretazione dei risultati della misurazione. Pertanto, la regolazione dell'angolo di inclinazione deve essere eseguita nel modo più preciso possibile utilizzando l'inclinometro. Spostare il substrato allineato sulla superficie del film polimerico fino a raggiungere una sollecitazione di precarico di 13 più o meno cinque kilopascal e avviare il pacchetto software programmato personalizzato scritto in LabView.

Quindi, impostare i parametri di misurazione richiesti per misurare le proprietà di adesione di tre campioni prodotti in sei diverse posizioni su ciascuna superficie del film. Per preparare le pellicole per la microscopia ottica, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il campione polimerico in pezzi di 0,25 centimetri quadrati e attaccare i pezzi al bordo di un vetrino. Quindi, posizionare il vetrino in orientamento verticale al microscopio verticale e misurare lo spessore della sezione trasversale del film.

Per preparare un esperimento di coltura cellulare, utilizzare prima un bisturi per tagliare pezzi di circa cinque per cinque millimetri dallo strato di supporto in PET e utilizzare una pinzetta per trasferire i pezzi su singoli vetrini di vetro da 12 millimetri. Trasferire i vetrini coprioggetto all'interno della camera di reazione di un dispositivo al plasma e chiudere il coperchio del dispositivo. Evacuare la camera fino a raggiungere una pressione di 1,6 volte 10 al meno secondo millibar e trattare i film con plasma per tre minuti.

Quindi, ventilare la camera di reazione e trasferire i campioni nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Successivamente, lavare una coltura cellulare L929 confluente al 70-80% con DPBS privo di calcio e magnesio per 30 secondi in una cappa a flusso laminare. Seguito da un'incubazione di cinque minuti con due millilitri di una soluzione proteolitica e collagenolitica appropriata a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Quando le cellule si sono staccate, aggiungere otto millilitri di terreno integrato con siero e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, dopo il conteggio, seminare 60.000 cellule per millilitro di terreno per pozzetto della piastra a 24 pozzetti contenente i campioni polimerici e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per tre giorni prima dell'acquisizione e della fissazione dell'immagine a contrasto di fase. A seconda dello spessore del film superiore, si osserva una diminuzione dello stress di pull-off con l'aumentare dello spessore del film, indipendentemente dalla consistenza della superficie del substrato.

Il lavoro di separazione, tuttavia, è generalmente leggermente inferiore per le superfici ruvide del substrato rispetto a quelle lisce. Quando si registra il meccanismo di distacco, si osserva poca cavitazione sui film più sottili, mentre la comparsa di crepe simili a dita è osservabile sui film più spessi. Gli esperimenti di coltura cellulare rivelano che le cellule seminate su polimeri incontaminati mostrano scarso comportamento di adesione e diffusione cellulare, mentre il monostrato confluente si osserva per le cellule coltivate su superfici trattate al plasma.

In generale, i livelli di lattato deidrogiasi sono comparabili per le cellule coltivate su entrambi i materiali polimerici, con una citotossicità inferiore al 5%. Una volta padroneggiata, la produzione dei compositi di film polimerici può essere completata in circa tre ore. Sebbene l'analisi successiva con un normale tack test richieda una formazione, è uno strumento molto potente per studiare le proprietà adesive dei film.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre sottili film compositi polimerici e analizzarli con specifici test di adesione e strumenti biologici cellulari. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche e materiali biologici può essere estremamente pericoloso. Pertanto, prendere le precauzioni appropriate, come seguire le procedure di sicurezza obbligatorie, indossare dispositivi di protezione individuale e maneggiare questi materiali in un armadio di sicurezza.