Name: Thin Film composito silicone elastomeri per colture cellulari e applicazioni della pelle: produzione e caratterizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara a produrre e caratterizzare film compositi polimerici sottili con moduli di Young variabili per colture cellulari avanzate e applicazioni cutanee. Questo metodo consente analisi precise delle proprietà adesive.

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Martin Danner è riconosciuto per la sua assistenza nella preparazione di campioni e istituzione di procedure di coltura delle cellule. Gli autori vorrei ringraziare Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Amburgo, Germania), soprattutto Robert Radsziwill per il continuo supporto e discussioni. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP/2007-2013) convenzione di sovvenzione CER n. dell'Unione europea 340929.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La progettazione di strutture in composito consente la semplice regolazione delle proprietà dei materiali, come il modulo di Young o lo spessore dei campioni. Il modulo di Young di PDMS può essere cambiato in modo efficace in una vasta gamma alterando il rapporto di miscelazione tra i due componenti o fabbricazione di miscele utilizzando un diverso in silicone elastomero30,31. I metodi descritti non sono limitati al PDMS utilizzato nella presente inchiesta, ma soprattutto la prestazione adesiva dipende fortemente il tipo specifico utilizzato. Un passaggio fondamentale nell'ambito di questo protocollo è il processo di produzione dei film composito (Figura 1). È stato dimostrato che lo spessore dei film incide considerevolmente il comportamento di adesione dei film su diversi substrati, tra cui la pelle (Figura 5 e Figura 6). Oltre lo spessore del film, ora e temperatura durante il processo di polimerizzazione riguarda la proprietà del materiale32. Pertanto, parametri come lo spessore degli strati polimerici devono essere attentamente adattato e verificato.
Analisi delle proprietà adesive delle pellicole sottili è stata eseguita con misure di adesione di forza normale utilizzando due substrati di vetro con diverse rugosità fino a Ra = 0.338 µm (Figura 3). In generale, la rugosità influisce significativamente l'adesione delle superfici, soprattutto di materiali elastici33,34. La rugosità di vetro può essere facilmente variata di levigatura con carta vetrata di dimensioni diverse asperità, consentendo quindi la realizzazione di substrati esibendo i più alti valori di rugosità21. In aggiunta, altri materiali, ad esempio resina epossidica può essere utilizzata per la produzione di substrati15,35. Questo potrebbe essere una strategia importante modifica del protocollo presentato. Ad esempio, se substrati che esibiscono diverse superficie libera energie sono necessari o specifiche Topografie sono necessarie. Qui, pull-off stress e lavoro di separazione delle pellicole sottili prodotte di PDMS e SSA sono stati analizzati con un programma di installazione su misura (dispositivo di misurazione macroscopica adesione (MAD, Figura 4)). 36 l'allineamento ottico del substrato e penetratore è un passo fondamentale per l'analisi dei risultati delle misurazioni. Di conseguenza, regolazione dell'angolo di inclinazione deve essere eseguita con il goniometro, più preciso possibile. Ciò può essere ottenuto con sufficiente precisione manualmente portando il substrato a contatto con la superficie della pellicola fino a quando si ottiene un contatto orizzontale.
Nel protocollo attuale il tempo di attesa è stato mantenuto costante a un secondo (Figura 5 e Figura 7). Soprattutto per la ricerca delle prestazioni adesiva di un film elastico per una superficie di substrato grezzo, un'estensione del tempo di attesa fornisce informazioni aggiuntive. Ad esempio, un aumento nello sforzo di strappo con l'aumento del tempo di attesa è stato segnalato8. Oltre le misure eseguite nel protocollo attuale, altri metodi, ad esempio peel test potrebbe essere effettuato, permettendo una più vasta inchiesta di adesione prestazioni37.
Le proprietà adesive del film compositi che esibiscono differenti della pellicola sono stati determinati spessori dell'adesivo pelle morbida (Figura 7). I nostri risultati sono in linea con i dati pubblicati, che con un decremento di piombo di spessore di pellicola ad un aumento dello stress pull-off come il confinamento, cioè, il rapporto tra diametro e pellicola spessore del substrato, aumenti38,39 . Basato su questi risultati e i dati rappresentati in Figura 7, concludiamo che film compositi con uno spessore totale di circa 100 µm (spessore dello strato SSA di circa 60 µm applicato ad una pellicola PDMS con uno spessore di circa 40 µm) esibiscono favorevole adesione p roprietà su superfici ruvide.
Successivamente, sul film compositi incontaminate sono stati eseguiti esperimenti relazionati alla caratterizzazione biologica e trattate al plasma film compositi (Figura 8). Trattamento al plasma di elastomeri di silicone è una tecnica versatile, spesso applicata per aumentare le proprietà idrofile di superfici e promuovere attaccamento cellulare e cellulare diffusione40,41. Siliconi sono ben noti per la loro bassa tossicità e biostabilità alta ma possono contenere di monomeri residui o catalizzatori in grado di influenzare processi fisiologici, che conduce anche a citotossicità42,43. Nell'esperimenti condotti abbiamo osservato a meno di 5% citotossicità con rilascio di LDH come un indicatore e un test di esclusione del Trypan Blue. Nel protocollo presentato, l'intera popolazione cellulare, tra cui aggregati cellulari indipendente forma che la superficie è stata analizzata per analisi di proliferazione (figura 9B). Una modifica del protocollo potrebbe produrre risultati più differenziati. Per ciascun campione, il supernatante contenente aggregati cellulari indipendenti potrebbe essere trasferito in una provetta di reazione separata e non combinato con le cellule enzimaticamente rimosse dalla superficie del polimero. Ciò consente l'esatta determinazione delle cellule attaccate alla superficie e alla fine rivelano una più dettagliata valutazione dell'influenza dei polimeri sul processo di adesione cellulare. Oltre ai metodi di immunocytochemical ha presentati qui, le cellule potrebbero essere raccolte per indagine con metodi di immunoblot, permettendo una valutazione quantitativa dettagliata dell'espressione della proteina.
In sintesi, abbiamo stabilito le condizioni di produzione per la produzione di film sottili di compositi elastomerici per applicazioni in ricerca della coltura avanzata delle cellule. Inoltre, questi film sottili possiedono alta adattabilità alla pelle rugosità, consentendo il sofisticato design degli adesivi di pelle.

In questo protocollo, sono presentati metodi dettagliati per la produzione di film sottile elastomero. La tecnica di lama medico ampiamente disponibile è stata utilizzata per la produzione di film sottili di composito. La tecnica di fabbricazione è stata effettuata su fogli di polietilentereftalato (PET), che consente la produzione successiva di questi film in larga scala. L'enfasi di questo protocollo è la valutazione della riproducibilità, precisa produzione di diversi strati di film compositi e determinazione delle proprietà biologiche e adesione della patch composito finale. Il poly-(dimethylsiloxane) di elastomero di silicone (PDMS) è ampiamente utilizzato nella tecnologia biomedica, compresa la produzione di pelle adesivi, applicazioni di microfluidica e ulteriori ricerche campi1,2,3 ,4. Recentemente, un'altra sottoclasse di PDMS, i cosiddetti Soft pelle adesivi (SSAs) sono stati introdotti, in particolare per la pelle delicata di legame e de-bonding.
SSAs in silicone sono elastomeri vinile funzionalizzato, differiscono dai polimeri analoghe dall'assenza di silice5di rinforzo. Simile a altri PDMS, SSA modulo di Young può essere adattato in una vasta gamma di concentrazione cross-linker modulante o polimerizzazione tempo6,7,8. Questo cambiamento di modulo di Young di elastomeri di silicone influisce in modo significativo le proprietà adesive del materiale e ha anche profonde conseguenze sulle cellule procariote ed eucariote coltivate sulla superficie9,10 , 11. il livello biologico cellulare, è stato dimostrato, che le cellule eucariotiche rispondono sul livello di trasduzione del segnale per una modulazione dell'elasticità matrice o spessore della superficie9,10,12 ,13,14. Di conseguenza, esiste un vasto interesse nelle applicazioni della coltura delle cellule di polimeri con proprietà meccaniche sintonizzabile. D'importanza, l'intrinsecamente bassa energia superficiale degli elastomeri a base di silicone non fornisce le condizioni ottimali per la coltura cellulare delle cellule eucariotiche. Trattamento al plasma di ossigeno è una tecnica ampiamente utilizzata per aumentare PDMS bassa energia superficiale temporaneamente, che porta ad un potenziamento della sua forza di strappo, diminuita superficie adsorbimento di molecole, mentre in parallelo promuovere attaccamento, diffusione e proliferazione di cellule eucariotiche15,16,17,18.
Oltre alle proprietà dei materiali, la topografia di superficie influenza in modo significativo di adesione cellulare e l'interazione adesivo tra due materiali19,20,21,22. Rugosità superficiale ha parecchi effetti sulla formazione contatto tra due superfici: riduzione della zona di contatto, alta memorizzati energia elastica che circonda asperità così come influenza sulla propagazione di crepa può alterare la resistenza adesiva23, 24. Adesione di pellicole autoadesive per la pelle umana è un settore emergente di applicazione, ad esempio, medicazioni, fissazione di elettrodi ECG o altri dispositivi elettronici indossabili25,26,27, 28. Per misurare la prestazione adesiva di autoadesivi in relazione alla topografia superficiale, substrati di vetro con diversi gradi di rugosità possono essere utilizzati nella normale adesione misure8,21. Qui, i due substrati di vetro sono stati selezionati per indagare le proprietà adesive delle pellicole polimeriche. Composito, primo film con un strato di rinforzo PDMS in un rapporto di 10 a 1 peso parti coperte da PDMS con diverso rapporto di miscelazione miscelazione sono state caratterizzate. In una seconda fase uno strato adesivo di SSA è stato preparato con una quantità di peso uguale di entrambi i componenti e con vario spessore di pellicola sopra un supporto film PDMS.

<table><tbody><tr><td>2-Propanolo, 97%</td><td>Stockmeier Chemie</td><td>1000452610000</td><td>Isopropanolo</td></tr><tr><td>Tampone abrasivo per le mani</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>Grana: 220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Capricorn Scientific</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Fraktion V</td><td>Roth</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A12379</td><td>altamente tossico</td></tr><tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>terreno di montaggio solubile in acqua</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE Saggio di integrità omogenea della membrana</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza Ca2+, Mg2+</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino oro</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Goniometro OCA35</td><td>Dataphysics</td><td></td><td>per la determinazione dell'angolo statico di contatto con l'acqua</td></tr><tr><td>Hoechst Dye 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155-100MG</td><td>bisBenzimide H 33342 tricloridrato, altamente tossico</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio utilizzato per la documentazione di colture cellulari</td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse LV100ND</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio utilizzato per la determinazione dello spessore del film</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, soluzione acquosa 16%</td> <td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>RT 15710</td> grado di <td>microscopia elettronica</td></tr><tr><td>penicillina e streptomicina soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Phenom XL Microscopio elettronico a scansione (SEM)</td><td>Phenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-(alcol vinilico) 4-88, MW 31000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>Poli-dimetil silossani, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreno basale</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>adesivo per pelle morbida (SSA)</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)</td></tr><tr><td>miscelatore di velocità DAC 600.2 VAC-P</td><td>Hauschild</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stilo profilomter</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modello: SURFCOM 1500SD3</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 pro</td><td>Lettore di piastre a fluorescenza</td><td>Tecan</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td> soluzione <td>altamente tossica</td></tr><tr><td>di tripsina/EDTA</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>0,05% tripsina, 0,02% EDTA in PBS</td></tr><tr><td>Colla UV</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>media viscosità</td></tr></tbody></table>

thin film composito silicone elastomeri per colture cellulari e applicazioni della pelle: produzione e caratterizzazione

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

In questo protocollo, presentiamo metodi per fabbricare film composito sottile in elastomero per applicazioni della coltura avanzata delle cellule e per lo sviluppo di adesivi di pelle. Due diversi poli-(dimethyl siloxanes) (PDMS e morbida pelle adesivo (SSA)), sono stati utilizzati per indagini approfondite di effetti biologici e caratteristiche adesive. Il film compositi sono costituiti da uno strato di supporto flessibile e un rivestimento superiore adesivo. Entrambi gli strati sono stati fabbricati dalla tecnica di applicazione lama medico. Nella ricerca attuale, il comportamento adesivo dei film composito è stato studiato come una funzione di spessore dello strato o una variazione del modulo di Young del livello superiore. Il modulo di Young di PDMS è stato modificato variando la base per il rapporto di miscelazione di reticolante. Inoltre, lo spessore del film di SSA è stato variato da circa 16 µm a circa 320 µm. scansione microscopia elettronica (SEM) e microscopia ottica sono stati utilizzati per misure di spessore. Le proprietà adesive del film elastomero dipendono fortemente lo spessore del film, il modulo di Young dei polimeri e le caratteristiche superficiali. Di conseguenza, è stato studiato normale adesione di questi film su substrati di vetro che esibiscono le superfici lisce e ruvide. Il rapporto di miscelazione di elastomeri di silicone dipendono strappo stress e lavoro di separazione.
Inoltre, lo spessore dell'adesivo pelle morbida posizionato sopra uno strato di appoggio solidale è stato variato per produrre le patch per le applicazioni della pelle. Citotossicità, proliferazione e adesione cellulare dei fibroblasti murini L929 su pellicole di PDMS (rapporto di miscelazione 10:1) e SSA (miscelazione rapporto 50: 50) sono stati condotti. Ci hanno mostrato qui, per la prima volta, il confronto fianco a fianco di sottili pellicole compositi prodotte di entrambi polimeri e presentare lo studio delle loro proprietà biologiche - e adesivo.

Un protocollo per il processo di fabbricazione di strutture in composito polimerico pellicola sottile che possiede di diversi giovani moduli o spessori è presentato. Film sono prodotti per studi su colture cellulari avanzati o come adesivi di pelle.

Thin Film composito silicone elastomeri per colture cellulari e applicazioni della pelle: produzione e caratterizzazione

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre e caratterizzare strutture composite polimeriche a film sottile per studi avanzati di colture cellulari o come adesivi cutanei. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i compositi elastomerici possono essere utilizzati per ottenere un'azione di adesione ottimale, anche su superfici irregolari. I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono semplici e universalmente applicabili.Ciò consente una produzione su larga scala con una precisione molto elevata. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché le misurazioni dell'adesione richiedono un allenamento intensivo e pratica per raggiungere la precisione necessaria. A dimostrare le procedure di coltura cellulare e l'applicazione del plasma sarà Angela Rutz, un tecnico del nostro laboratorio.Per preparare il PDMS, mescolare e degassare 1,1 grammi della miscela di prepolimero in un miscelatore a velocità a 2350 giri/min sotto vuoto per tre minuti. Per preparare lo strato di supporto PDMS, utilizzare una macchina per l'applicazione della racla a controllo automatico. Posizionare la racla sopra un pezzo di foglio di PET pulito al 100% con isopropanolo e utilizzare le viti di microposizionamento per regolare lo spessore dello strato di supporto.Caricare il PDMS in una siringa monouso da 10 millilitri. Riempire il serbatoio della racla con il polimero e avviare il movimento della lama con una velocità di circa 2 millimetri al secondo. Quando il pezzo di pellicola in PET è stato rivestito, trasferire la pellicola in un forno a 95 gradi Celsius per un'ora.Per preparare lo strato superiore del film composito, utilizzare una lama per rimuovere le strisce sottili dai lati lunghi dello strato di supporto. Per consentire lo scorrimento della racla sulla lamina in PET, applicare il secondo strato di PDMS come descritto in precedenza. Quindi, metti la carta stagnola nel forno.Per preparare i campioni per le misurazioni dell'adesione, utilizzare una lama di rasoio per tagliare le pellicole sulla pellicola in PET in pezzi di quattro centimetri quadrati e utilizzare la colla UV per fissare i pezzi su un vetrino. Illuminare i pezzi con luce UV per tre minuti e montare il primo campione polimerico sul portacampioni. Utilizzare il goniometro per regolare l'angolo di inclinazione, fino a quando il substrato non è a contatto con il film polimerico con un allineamento completamente parallelo di entrambe le superfici, come visualizzato dalle immagini della telecamera.L'allineamento ottico del substrato al campione è estremamente critico per l'interpretazione dei risultati della misurazione. Pertanto, la regolazione dell'angolo di inclinazione deve essere eseguita nel modo più preciso possibile utilizzando l'inclinometro. Spostare il substrato allineato sulla superficie del film polimerico fino a raggiungere una sollecitazione di precarico di 13 più o meno cinque kilopascal e avviare il pacchetto software programmato personalizzato scritto in LabView.Quindi, impostare i parametri di misurazione richiesti per misurare le proprietà di adesione di tre campioni prodotti in sei diverse posizioni su ciascuna superficie del film. Per preparare le pellicole per la microscopia ottica, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il campione polimerico in pezzi di 0,25 centimetri quadrati e attaccare i pezzi al bordo di un vetrino. Quindi, posizionare il vetrino in orientamento verticale al microscopio verticale e misurare lo spessore della sezione trasversale del film.Per preparare un esperimento di coltura cellulare, utilizzare prima un bisturi per tagliare pezzi di circa cinque per cinque millimetri dallo strato di supporto in PET e utilizzare una pinzetta per trasferire i pezzi su singoli vetrini di vetro da 12 millimetri. Trasferire i vetrini coprioggetto all'interno della camera di reazione di un dispositivo al plasma e chiudere il coperchio del dispositivo. Evacuare la camera fino a raggiungere una pressione di 1,6 volte 10 al meno secondo millibar e trattare i film con plasma per tre minuti.Quindi, ventilare la camera di reazione e trasferire i campioni nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Successivamente, lavare una coltura cellulare L929 confluente al 70-80% con DPBS privo di calcio e magnesio per 30 secondi in una cappa a flusso laminare. Seguito da un'incubazione di cinque minuti con due millilitri di una soluzione proteolitica e collagenolitica appropriata a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.Quando le cellule si sono staccate, aggiungere otto millilitri di terreno integrato con siero e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, dopo il conteggio, seminare 60.000 cellule per millilitro di terreno per pozzetto della piastra a 24 pozzetti contenente i campioni polimerici e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per tre giorni prima dell'acquisizione e della fissazione dell'immagine a contrasto di fase. A seconda dello spessore del film superiore, si osserva una diminuzione dello stress di pull-off con l'aumentare dello spessore del film, indipendentemente dalla consistenza della superficie del substrato.Il lavoro di separazione, tuttavia, è generalmente leggermente inferiore per le superfici ruvide del substrato rispetto a quelle lisce. Quando si registra il meccanismo di distacco, si osserva poca cavitazione sui film più sottili, mentre la comparsa di crepe simili a dita è osservabile sui film più spessi. Gli esperimenti di coltura cellulare rivelano che le cellule seminate su polimeri incontaminati mostrano scarso comportamento di adesione e diffusione cellulare, mentre il monostrato confluente si osserva per le cellule coltivate su superfici trattate al plasma.In generale, i livelli di lattato deidrogiasi sono comparabili per le cellule coltivate su entrambi i materiali polimerici, con una citotossicità inferiore al 5%. Una volta padroneggiata, la produzione dei compositi di film polimerici può essere completata in circa tre ore. Sebbene l'analisi successiva con un normale tack test richieda una formazione, è uno strumento molto potente per studiare le proprietà adesive dei film.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre sottili film compositi polimerici e analizzarli con specifici test di adesione e strumenti biologici cellulari. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche e materiali biologici può essere estremamente pericoloso. Pertanto, prendere le precauzioni appropriate, come seguire le procedure di sicurezza obbligatorie, indossare dispositivi di protezione individuale e maneggiare questi materiali in un armadio di sicurezza.

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