Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

L'obiettivo generale di questa procedura di microdissezione laser è quello di sviluppare un metodo robusto e riproducibile per l'isolamento di un reticolo trabecolare altamente arricchito dagli occhi di topo utilizzando la microscopia a cattura laser per il successivo isolamento dell'RNA e l'analisi dell'espressione a valle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia, come ad esempio quali sono i geni importanti e le vie di segnalazione che, se mal regolati, possono portare a malattie oculari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'RNA di alta qualità proveniente dalla rete trabecolare degli occhi di topo può essere isolato in modo riproducibile per l'analisi dell'espressione genica.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la microdissezione laser è una tecnica potente che prevede vari passaggi per la risoluzione dei problemi durante l'intero protocollo. Iniziare questa procedura con una raccolta ottimale dei tessuti per la microdissezione laser come descritto nel protocollo di testo. Spruzzare la soluzione decontaminante RNasi sulla spazzola, sulla pinza, sui barattoli di accoppiamento e sul mandrino di montaggio.

Dopo aver pulito accuratamente, sciacquare l'apparecchio con acqua priva di nucleasi e asciugarlo. Pulire il criostato con etanolo al 100% per evitare la contaminazione incrociata. Spremere una piccola quantità di OCT sul mandrino di montaggio, quindi rimuovere il blocco di tessuto dallo stampo e posizionare con cura il blocco sul mandrino di montaggio.

Una volta che il blocco di tessuto sul mandrino di montaggio è congelato, inserirlo nel portacampioni del criostato. Quindi regolare il criostato per tagliare sezioni di otto micron e sezionare con cura il blocco OCT per raggiungere il campione di tessuto. Una volta osservato il tessuto, interrompere il sezionamento.

Taglia i blocchi congelati su tutti i lati usando una lama di rasoio pulita e lascia tre o quattro millimetri di OCT che circondano il tessuto per consentirne la manipolazione con il pennello. Sezione attraverso l'occhio, lavorando rapidamente. Colora ogni terza sezione inondando il vetrino con una rapida macchia H&E in un solo passaggio per 60 secondi.

Sciacquare la sezione con acqua di rubinetto e asciugare all'aria. Dopo aver pulito la sezione con un agente di pulizia, montare la sezione su un vetrino caricato con un vetrino coprioggetto, rivedere al microscopio. Continuare il sezionamento fino a quando la TM diventa evidente nelle sezioni colorate.

Una volta che la TM inizia a comparire, tagliare due sezioni e montarle su un vetrino caricato per la colorazione H&E di routine per formare una mappa per il taglio con microdissezione a cattura laser. Dopo il primo vetrino della mappa H&E, tagliare e allineare sei sezioni seriali di otto micron di spessore nel criostato e montarle contemporaneamente sul vetrino a membrana in PET. Far aderire il tessuto facendo scorrere brevemente un pollice guantato lungo la parte posteriore della membrana.

Dopo il montaggio, posizionare immediatamente il vetrino della membrana in PET in una scatola di vetrini su ghiaccio secco. Continua a sezionare l'occhio. Dopo ogni due vetrini con membrana in PET con sei sezioni ciascuno, raccogliere due sezioni su un vetrino caricato per creare un altro vetrino mappa per la colorazione H&E.

Continuare a sezionare circa 100 sezioni seriali spesse otto micron fino a quando la TM non è più visibile. Confermare la mancanza di TM colorando rapidamente una sezione su un vetrino carico. Dopo aver eseguito la colorazione dei vetrini della mappa H&E come descritto nel protocollo di testo, rivedere visivamente i vetrini H&E utilizzando un microscopio.

Identifica i vetrini della mappa con TM chiaramente visibili e accessibili per il taglio. Utilizzare i vetrini della membrana in PET tra questi vetrini della mappa per LCM. Rimuovere la scatola dei vetrini contenente le sezioni di tessuto congelate dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionarla su ghiaccio secco.

Elaborare le diapositive una alla volta. Fissare le sezioni posizionando immediatamente il vetrino in un freddo contenente inibitori della RNasi al 75% contenenti etanolo per 30 secondi. Immergere delicatamente il vetrino in acqua priva di nucleasi per 10-15 secondi per sciogliere l'OCT senza interferire con le sezioni di tessuto.

Pipettare con cura 300 microlitri di soluzione di acetato di violetto di cresil all'1,5% direttamente sulle sezioni e incubare per 45 secondi a temperatura ambiente. Quindi lavare le sezioni una volta mettendole in un bagno di etanolo al 75% per 30 secondi. Pipettare 200 microlitri di soluzione di Eosina Y sulle sezioni e incubare per tre-cinque secondi.

Disidratare il tessuto posizionando successivamente i vetrini in etanolo al 75%, etanolo al 95% e infine in un bagno di etanolo al 100% per 30 secondi ciascuno. Tamponare l'estremità del vetrino con un panno di carta tra ogni passaggio per rimuovere il liquido in eccesso. Lasciare asciugare completamente lo scivolo all'aria sotto il cofano per cinque minuti.

Una volta asciutto, eseguire LCM subito dopo. Evitare l'uso di xilene per l'ultima fase di pulizia. Il trattamento con xilene causerà un montaggio inadeguato della sezione di tessuto sul vetrino della membrana.

Lo xilene ridurrà anche l'efficienza della cattura tissutale da parte della LCM. Posizionare il vetrino a membrana in PET con il lato del tessuto colorato rivolto verso il basso direttamente sulla parte superiore di un nuovo vetrino che è stato caricato sul tavolino del microscopio. Assicurarsi che la membrana e il vetrino siano strettamente accoppiati sul tavolino del microscopio.

Avviare LCM impostando prima i limiti di scorrimento. Scegliere l'ingrandimento 4X più basso nel pannello Obiettivo, quindi definire l'area di lavoro del vetrino della membrana spostando il tavolino XY del microscopio fino a quando l'angolo in alto a sinistra, dove il metallo e la membrana si incontrano, è visibile nel feed video in diretta. A questo punto, premi il pulsante Limite 1 e sulla mappa stradale comparirà un rettangolo rosso.

Quindi, sposta il palco XY nell'angolo opposto e premi il pulsante Limite 2. Premere il pulsante Scansione per creare un'immagine della mappa stradale della membrana e dei tessuti compresi tra i limiti impostati. Fare doppio clic in prossimità della TM di una delle sezioni dell'occhio all'interno della mappa stradale.

La TM può essere localizzata vicino all'apice dell'angolo iridocorneale. Una volta identificata la TM, aumentare l'ingrandimento a 10X e mettere a fuoco manualmente la TM. Ripeti con obiettivi 20X e 40X. Quando la TM è a fuoco con l'obiettivo 40X, navigare in un'area vuota, selezionare lo strumento di disegno a mano libera e tracciare una lunga linea su un'area vuota di tessuto.

Impostare i parametri del laser in modo che la velocità di taglio sia del 34%, la messa a fuoco sia del 58% e la potenza del 70%, quindi premere il pulsante Taglia. Effettuare regolazioni laser fini dei parametri di velocità, messa a fuoco e potenza fino a quando non si osserva una linea di taglio chiara e sottile. Per un taglio preciso, assicurarsi che l'azione di taglio segua la linea tracciata.

Quindi caricare il coperchio del tubo di isolamento nel supporto del tappo e aprire il tubo. Fissare il supporto del tappo al sollevatore del tappo e assicurarsi che il tubo sia capovolto. Assicurarsi inoltre che il materiale del cappuccio adesivo sporga oltre la punta del cappuccio per garantire che il tessuto desiderato venga catturato correttamente.

È fondamentale assicurarsi visivamente che la rete trabecolare venga raccolta e fissata al cappuccio di isolamento. Selezionare la modalità di dissezione manuale sul pannello del software. Controllare attentamente che il TM si trovi direttamente sotto il tubo di isolamento.

Impostare il bilanciamento del bianco e regolare la luminosità per acquisire una qualità dell'immagine ottimale. Per iniziare a tagliare, regolare manualmente la messa a fuoco e tracciare una linea utilizzando lo strumento a mano libera. Assicurarsi che il tappo di raccolta rimanga in posizione sollevata, senza ancora toccare la membrana.

Disegna dei cerchi parziali vicino al punto in cui la TM incontra la sclera e premi Taglia. Una volta eseguiti i primi tagli, posizionare il cappuccio in posizione abbassata e regolare nuovamente la messa a fuoco, quindi tracciare due linee nello spazio aperto o libero per collegare i due cerchi parziali, completando il cerchio attorno alla TM. Quindi premere Taglia e raccogliere il tessuto dalla sezione. Assicurarsi che la TM sia stata prelevata dal cappuccio di microdissezione.

Riposizionare il tappo in posizione sollevata e ripetere sulle sezioni rimanenti. Regolare leggermente la posizione del tappo in modo che tutti i campioni isolati si adattino al tappo e non si sovrappongano. Per la membrana PET successiva, inserire un nuovo tubo di isolamento e ripetere questa sezione.

Per eseguire la lisi del tessuto TM microsezionato, pipettare con cura 10 microlitri di tampone di lisi sul coperchio della provetta di raccolta, assicurandosi che il tampone di lisi copra completamente il TM microsezionato. Chiudere delicatamente il tappo adesivo e incubare la provetta di raccolta capovolta a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare a 800 g per due minuti e porre il lisato su ghiaccio secco. Conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius per la successiva purificazione e analisi.

La rapida degradazione dell'RNA può influire sull'analisi dell'RNA a valle. La qualità dell'RNA deve essere misurata e quantificata utilizzando una piattaforma basata sulla microfluidica. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi dell'analisi dell'espressione genica dell'RNA totale di alta qualità purificato dalla rete trabecolare.

Il gel digitale per l'RNA totale rimanente dal tessuto oculare dopo la microdissezione laser mostra un elevato numero di integrità dell'RNA, necessario per la successiva analisi dell'RNA a valle. Una volta estratto l'RNA di qualità dal tessuto, è possibile eseguire analisi a valle come micro-array, RNA-Seq e qPCR. Qui, l'analisi PCR digitale quantitativa è stata utilizzata per analizzare l'espressione dei geni associati al meshwork trabecolare, la miocilina e ACTA2 dall'RNA raccolto da LCM.

È illustrato dalla mappa di calore generata dai dati ottenuti dall'analisi dei micro-array che questa tecnica può essere utilizzata per comprendere i cambiamenti di espressione genica nel reticolo trabecolare di topi wild type e topi knockout con un fenotipo IOP elevato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in appena un giorno per animale biologico se eseguita correttamente. La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale in quanto le fasi di microdissezione laser sono difficili da apprendere a causa della difficoltà di visualizzazione delle cellule di interesse e dell'assenza di standard per questi campioni unici.

Affidarsi all'operatore qualificato è fondamentale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'RNA in piccole quantità di tessuto può essere rapidamente degradato. Devono essere prese precauzioni come la decontaminazione delle apparecchiature dalla RNasi, la riduzione al minimo dell'esposizione all'aria e il mantenimento del freddo dei tessuti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti dell'aumento della pressione intraoculare sull'espressione genica specifica del reticolo trabecolare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la valutazione dei cambiamenti nell'espressione genica nella retina causati dall'aumento della pressione intraoculare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'RNA-Seq o il micro-array per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali vie di segnalazione sono alterate nel reticolo trabecolare dei topi con elevata pressione intraoculare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare in modo più efficace i cambiamenti dell'espressione genica nel reticolo trabecolare nei modelli murini.