Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia vascolare e del cancro, come i meccanismi di plasticità endoteliale in varie condizioni patologiche, incluso il cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'induzione robusta di EndMT in vitro si ottiene mediante trattamento con TGF-nelle cellule endoteliali MS-1. Per prima cosa far crescere le cellule MS-1 in condizioni di coltura standard ed evitare che la coltura sia confluente.

Successivamente, su un piatto da 10 cm, lavare le cellule MS-1 con 1 soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi aggiungere 1 mL di tripsina alla piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere 9 mL di terreno di coltura alle cellule tripsinizzate per il distacco.

Quindi raccogliere la sospensione cellulare tripsinizzata in una provetta da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 300-400 x G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare un contatore automatico di celle per contare il numero di celle vitali.

Quindi piastrate le cellule MS-1 su piastre di coltura standard non rivestite per la coltura a lungo termine. Dopo 24 ore, stimolare le cellule endoteliali con una concentrazione finale di 1 ng per millilitro di TGF-2. Quindi incubare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo 48 ore di trattamento, sostituire il terreno con un terreno di coltura fresco e preriscaldato contenente TGF-2 Per l'analisi a valle, placcare le cellule MS-1 su un vetrino da camera di coltura a 8 pozzetti pre-rivestito di gelatina. Dopo 24 ore, aggiungere 10 M di inibitore ROCK alla coltura cellulare. Dopo un'ora, stimolare le cellule endoteliali con una concentrazione finale di 1 ng per millilitro di TGF-2.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Per una coltura di 72 ore, sostituire il vecchio terreno con un terreno fresco contenente TGF-2 dopo 48 ore. Dopo un'intera giornata di trattamento con TGF, rimuovere il terreno.

Quindi fissare le cellule con paraformaldeide al 4% e soluzione salina tamponata con fosfato per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine del periodo di fissaggio, sciacquare le celle con soluzione fisiologica tamponata con fosfato. Quindi incubare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo cinque minuti, sciacquare nuovamente le cellule con 1 soluzione salina tamponata con fosfato per tre volte. Dopo tre lavaggi, incubare le cellule con fallotossina fluorescente diluita contenente tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 1 soluzione salina tamponata con fosfato, tre volte.

Quindi colorare i nuclei cellulari usando il colorante legante l'acido nucleico cianina per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, sciacquare la diapositiva e montare un vetrino coprioggetto sulla diapositiva utilizzando un supporto di montaggio della diapositiva. Osservare le cellule al microscopio confocale.

Le cellule mostrano una riorganizzazione delle spesse fibre di stress dopo il trattamento con TGF-2. Ciò indica la potenza del TGF-2 nell'indurre l'EndMT nelle cellule endoteliali. Dopo 72 ore di trattamento con TGF-2, scartare il terreno e fissare le cellule con 0,5-1 ml di metanolo freddo al 50% e acetone al 50% per cinque minuti.

Quindi sciacquare le cellule con 1 soluzione salina tamponata con fosfato, tre volte. Al termine dei tre lavaggi, incubare le cellule con gli anticorpi primari in tampone bloccante per una notte a 4 gradi Celsius, al buio. Il giorno seguente, lavare nuovamente le cellule con 1 soluzione salina tamponata con fosfato, tre volte.

Quindi incubare le cellule con anticorpo secondario coniugato con colorante verde contro VE-caderina in tampone bloccante, per un'ora al buio. Lavare nuovamente le cellule con 1 soluzione salina tamponata con fosfato, tre volte. Quindi colorare i nuclei cellulari usando il colorante legante l'acido nucleico cianina per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo cinque minuti, sciacquare la diapositiva e montare un vetrino coprivetrino sulla diapositiva utilizzando un mezzo di montaggio della diapositiva. Quindi osservare le cellule al microscopio confocale. Le cellule mostrano una diminuzione dell'espressione di VE-caderina e un aumento dell'espressione di actina della muscolatura liscia dopo il trattamento con TGF-2 per 48-72 ore.

Prima del test di contrazione del gel di collagene, coltivare le cellule MS-1 in presenza e assenza di TGF-2 per 72 ore. Quindi preparare il gel di collagene di tipo 1 con ghiaccio. Quindi mescolare 800 l della soluzione di gel di collagene con 200 mL di cellule endoteliali di controllo o trattate con TGF-2.

Quindi, aggiungere 1 mL di questa miscela a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti. Lascia solidificare il gel a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Dopo la solidificazione del gel, aggiungere 1 ml di MEM Alpha, contenente il 10% di siero fetale di vitello, 50 unità per millilitro di penicillina e 50 g per millilitro di streptomicina, per far galleggiare il gel.

Quindi staccare il gel dalla parete del pozzetto e incubare il gel galleggiante a 37 gradi Celsius per 48 ore. Dopo 48 ore di incubazione, scansionare le immagini del gel dal fondo della piastra utilizzando uno scanner. Sono visibili cambiamenti morfologici distinti, che trasformano le cellule dal ciottolo all'architettura a forma di fuso mesenchimale a causa dell'esposizione al trattamento con TGF-2 per 72 ore.

È interessante notare che il trattamento con TGF beta 2 per 48-72 ore mostra un aumento sia dell'mRNA che dei livelli di espressione proteica dell'actina muscolare liscia nelle cellule MS-1. Il test di contrazione del gel mostra anche che dopo il trattamento con TGF-2, il gel di collagene di tipo 1 si contrae in modo significativo. È interessante notare che la privazione di TGF-2 riduce l'actina della muscolatura liscia al livello basale e le cellule riprendono la morfologia del ciottolo, indicando che l'EndMT è un processo dinamico.

Infatti, l'inibizione del microRNA 31 da parte dell'inibitore del microRNA LNA utilizzando le cellule MS-1, attenua l'induzione di marcatori mesenchimali. Tuttavia, l'inibitore non influenza l'induzione di geni bersaglio del TGF come la fibronectina 1, PAI-1 e Smad 7. Seguendo questa procedura come metodo come l'espressione genica, il knockdown o la modulazione di microarray, è possibile eseguire per rispondere a ulteriori domande come la funzione specifica del gene e del microRNA in EndMT.